El documento describe la técnica de Western blot, la cual permite separar e identificar proteínas mediante electroforesis en gel y detección con anticuerpos. Las proteínas de una muestra se separan primero por tamaño y luego son transferidas a una membrana donde se unen anticuerpos específicos para identificar la proteína de interés. Esta técnica es ampliamente utilizada en investigación biomédica y diagnóstico clínico.

1. BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
WESTERN BLOT
MAYTE RODRÍGUEZ MANCILLA
PRIMAVERA 2015

2. Western Blot es una técnica
analítica, ampliamente utilizada
en biología celular y molecular,
para la separación e
identificación de proteínas.

3. Capacidad de identificar proteínas
específicas de una mezcla compleja
de proteínas extraídas de las células.

4.  Las proteínas de la muestra se separan
mediante electroforesis en gel en función de
su peso molecular.
 A continuación se utiliza un anticuerpo
específico para detectar la proteína de
interés.
 El resultado aporta información sobre el peso
molecular de la proteína y su cantidad
relativa en la muestra.

5. Muestra:
 Tejido
 Cultivo celular
 Extracción de las proteínas de muestras
biológicas mediante disrupción mecánica
o química.

6. Licuadora (para grandes
volúmenes de muestra)
Homogenizador (para
muestras pequeñas)
Sonicación.
Mecánico
Detergentes
Sales
Tampones (favorecen
la lisis y solubilizan
las proteínas)
Químico

7.  En esta técnica la mezcla de proteínas se
separa mediante una electroforesis en
gel, con base en:
o Peso molecular
o Estructura
o Hidrofobicidad

9.  Estos resultados son luego transferidos a una
membrana adsorbente produciendo una
banda para cada proteína.
 Para que las proteínas sean accesibles a la
detección por anticuerpos.
 Membrana de nitrocelulosa o de PVDF.
 Esta transferencia puede realizarse por:
 Difusión
 Por vacío
 Por acción de un campo eléctrico
(electrotransferencia).

11. La técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del
proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere
(especialmente en comparación con las otras técnicas).

12.  Tras la transferencia, se suele proceder a la
tinción del gel con Coomassie Brilliant
Blue (un colorante de proteínas) para
comprobar que en efecto una parte
importante del material proteico ha pasado a
la membrana.

13.  Puesto que la membrana escogida necesita
poder unirse proteínas de forma inespecífica, es
preciso bloquear los lugares de unión que han
quedado libres tras la transferencia.
 En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza
proteica) empleado en la detección puede
unirse a ellos, dificultando la distinción
del complejo antígeno-antígeno que se forma
con la proteína que se busca.

14.  En el bloqueo se incuba la membrana con una
solución de proteínas:
 Albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por
sus siglas en inglés, BSA)
 Leche en polvo o caseína
 Diminuta fracción de detergente (Tween
20 o Tritón X-100)

15. Posteriormente la membrana se incuba con
anticuerpos específicos marcados para la
proteína de interés.
 Comprueba la presencia en la membrana de
una determinada proteína. Para ello se
emplea un anticuerpo específico contra ella
unido a enzima que, en presencia de su
sustrato, catalice una reacción colorimétrica.
De esta forma, se hace patente la unión con
el antígeno, la proteína, así como su
localización.

17. Anticuerpo
primario.
El anticuerpo reconoce
específicamente la proteína
desnaturalizada.
Esta incubación puede durar desde 30
minutos a una noche entera.
Las temperaturas elevadas
temperaturas favorecen las uniones
más específicas.
Anticuerpo
secundario
Reconoce de forma específica una
región concreta del anticuerpo
primario.
Suelen estar marcados para ser
detectables .
Varios de estos anticuerpos se unirán
a cada anticuerpo primario,
amplificando la señal.

18. Radiactividad
•Más caro
•Peligroso
•Lento
Anticuerpo unido a una
enzima
•Enzimas que catalicen la
transformación de un sustrato
soluble en un producto insoluble.
•Peroxidasa de rábano (HRP) o una
fosfatasa alcalina
Marcaje fluorescente
•Unido a fluorocromos del infrarrojo
cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 -
difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o
el rojo Nilo.
Sistema
avidina/estreptavidina
•Anticuerpo primario unido
covalentemente a moléculas
de biotina.
Detección de oro
•Anticuerpos primarios con proteína
A unida a partículas de oro.

19.  Tras el lavado de las sondas marcadas no
unidas, se procede a la detección de aquellas
que sí se han unido a la proteína de interés.

20.  Es muy importante ser consciente de que los
datos producidos con un western blot se
considera generalmente para ser semi-
cuantitativa.
 Debido a que proporciona una comparación
relativa de los niveles de proteína, pero no
una medida absoluta de la cantidad.

21.  Hay dos razones para esto; primero, hay
variaciones en los tipos de carga y de
transferencia entre las muestras en carriles
separados que son diferentes en
transferencias separadas.
 Tendrán que ser normalizado antes de una
comparación más precisa se puede hacer
estas diferencias.
 En segundo lugar, la señal generada por la
detección no es lineal en todo el intervalo de
concentración de muestras.
 Por lo tanto, puesto que la señal producida
no es lineal, no debe ser utilizado para
modelar la concentración.

22.  Investigación
 Biología molecular.
 Inmunología.
 Diagnóstico
 Prueba de VIH.
 Enfermedad de las vacas locas.
 Enfermedad de Lyme.
 Enfermedades infecciosas.

24.  Recuperado el 30 de Marzo de 2015:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC3456489/
 http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-
wb-webinar.pdf