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BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS
LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO
LABORATORIO DE VIROLOGÍA
WESTERN BLOT
MAYTE RODRÍGUEZ MANCILLA
PRIMAVERA 2015
Western Blot es una técnica
analítica, ampliamente utilizada
en biología celular y molecular,
para la separación e
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Capacidad de identificar proteínas
específicas de una mezcla compleja
de proteínas extraídas de las células.
 Las proteínas de la muestra se separan
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proteína de interés.
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una determinada proteína. Para ello se
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 En segundo lugar, la señal generada por la
detección no es lineal en todo el intervalo de
concentración de muestras.
 Por lo tanto, puesto que la señal producida
no es lineal, no debe ser utilizado para
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 Investigación
 Biología molecular.
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 Diagnóstico
 Prueba de VIH.
 Enfermedad de las vacas locas.
 Enfermedad de Lyme.
 Enfermedades infecciosas.
 Recuperado el 30 de Marzo de 2015:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/
PMC3456489/
 http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish-
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Western blot

  • 1. BENEMÉRITA UNIVERSIDAD AUTONOMA DE PUEBLA FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS LICENCIATURA EN QUÍMICO FARMACOBIÓLOGO LABORATORIO DE VIROLOGÍA WESTERN BLOT MAYTE RODRÍGUEZ MANCILLA PRIMAVERA 2015
  • 2. Western Blot es una técnica analítica, ampliamente utilizada en biología celular y molecular, para la separación e identificación de proteínas.
  • 3. Capacidad de identificar proteínas específicas de una mezcla compleja de proteínas extraídas de las células.
  • 4.  Las proteínas de la muestra se separan mediante electroforesis en gel en función de su peso molecular.  A continuación se utiliza un anticuerpo específico para detectar la proteína de interés.  El resultado aporta información sobre el peso molecular de la proteína y su cantidad relativa en la muestra.
  • 5. Muestra:  Tejido  Cultivo celular  Extracción de las proteínas de muestras biológicas mediante disrupción mecánica o química.
  • 6. Licuadora (para grandes volúmenes de muestra) Homogenizador (para muestras pequeñas) Sonicación. Mecánico Detergentes Sales Tampones (favorecen la lisis y solubilizan las proteínas) Químico
  • 7.  En esta técnica la mezcla de proteínas se separa mediante una electroforesis en gel, con base en: o Peso molecular o Estructura o Hidrofobicidad
  • 8.
  • 9.  Estos resultados son luego transferidos a una membrana adsorbente produciendo una banda para cada proteína.  Para que las proteínas sean accesibles a la detección por anticuerpos.  Membrana de nitrocelulosa o de PVDF.  Esta transferencia puede realizarse por:  Difusión  Por vacío  Por acción de un campo eléctrico (electrotransferencia).
  • 10.
  • 11. La técnica de transferencia más usada gracias a la velocidad del proceso y al elevado porcentaje de proteína que se transfiere (especialmente en comparación con las otras técnicas).
  • 12.  Tras la transferencia, se suele proceder a la tinción del gel con Coomassie Brilliant Blue (un colorante de proteínas) para comprobar que en efecto una parte importante del material proteico ha pasado a la membrana.
  • 13.  Puesto que la membrana escogida necesita poder unirse proteínas de forma inespecífica, es preciso bloquear los lugares de unión que han quedado libres tras la transferencia.  En caso contrario, el anticuerpo (de naturaleza proteica) empleado en la detección puede unirse a ellos, dificultando la distinción del complejo antígeno-antígeno que se forma con la proteína que se busca.
  • 14.  En el bloqueo se incuba la membrana con una solución de proteínas:  Albúmina de suero bovino o ASB (más conocida por sus siglas en inglés, BSA)  Leche en polvo o caseína  Diminuta fracción de detergente (Tween 20 o Tritón X-100)
  • 15. Posteriormente la membrana se incuba con anticuerpos específicos marcados para la proteína de interés.  Comprueba la presencia en la membrana de una determinada proteína. Para ello se emplea un anticuerpo específico contra ella unido a enzima que, en presencia de su sustrato, catalice una reacción colorimétrica. De esta forma, se hace patente la unión con el antígeno, la proteína, así como su localización.
  • 16.
  • 17. Anticuerpo primario. El anticuerpo reconoce específicamente la proteína desnaturalizada. Esta incubación puede durar desde 30 minutos a una noche entera. Las temperaturas elevadas temperaturas favorecen las uniones más específicas. Anticuerpo secundario Reconoce de forma específica una región concreta del anticuerpo primario. Suelen estar marcados para ser detectables . Varios de estos anticuerpos se unirán a cada anticuerpo primario, amplificando la señal.
  • 18. Radiactividad •Más caro •Peligroso •Lento Anticuerpo unido a una enzima •Enzimas que catalicen la transformación de un sustrato soluble en un producto insoluble. •Peroxidasa de rábano (HRP) o una fosfatasa alcalina Marcaje fluorescente •Unido a fluorocromos del infrarrojo cercano, como el 2 - metoxi - 2,4 - difenil - 3 (2H) - furanona (MDPF) o el rojo Nilo. Sistema avidina/estreptavidina •Anticuerpo primario unido covalentemente a moléculas de biotina. Detección de oro •Anticuerpos primarios con proteína A unida a partículas de oro.
  • 19.  Tras el lavado de las sondas marcadas no unidas, se procede a la detección de aquellas que sí se han unido a la proteína de interés.
  • 20.  Es muy importante ser consciente de que los datos producidos con un western blot se considera generalmente para ser semi- cuantitativa.  Debido a que proporciona una comparación relativa de los niveles de proteína, pero no una medida absoluta de la cantidad.
  • 21.  Hay dos razones para esto; primero, hay variaciones en los tipos de carga y de transferencia entre las muestras en carriles separados que son diferentes en transferencias separadas.  Tendrán que ser normalizado antes de una comparación más precisa se puede hacer estas diferencias.  En segundo lugar, la señal generada por la detección no es lineal en todo el intervalo de concentración de muestras.  Por lo tanto, puesto que la señal producida no es lineal, no debe ser utilizado para modelar la concentración.
  • 22.  Investigación  Biología molecular.  Inmunología.  Diagnóstico  Prueba de VIH.  Enfermedad de las vacas locas.  Enfermedad de Lyme.  Enfermedades infecciosas.
  • 23.
  • 24.  Recuperado el 30 de Marzo de 2015: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/ PMC3456489/  http://docs.abcam.com/pdf/events/spanish- wb-webinar.pdf