Este documento describe un estudio sobre la expresión de MyD88 en el folículo dental de ratas y sus implicaciones para la osteoclastogénesis y erupción dental. Los resultados mostraron que la expresión de MyD88 en el folículo dental aumentó al tercer día y que la IL-1alfa aumentó la expresión de MyD88. Al silenciar MyD88, se redujo la expresión de NFKB1, MCP-1 y la actividad quimiotáctica y osteoclastogénesis in vitro. Esto sugiere que MyD88 regula la expresión de

1. Expresión de MyD88 en el Folículo de Ratas: Implicaciones para la Osteoclastogénesisy la Erupción Dental Universidad El Bosque Biología Del Movimiento Luis Lerzundy R1 Ortodoncia

2. Materiales y Métodos Aislamiento y Cultivo de células DF Se tomo de ratas albergadas en Colegio de medicina Veterinaria de la Universidad de del estado de Lousiana aprobado por IACUC Aislados quirúrgicamente el FD de los primeros molares de las ratas correspondiente a los días 1,3,5,7,9 y 11 Estudios in vivo de Expresión del Gen MyD88 en el Foliculo Dental Los FD de los primeros molares de 5 a 6 días de edad, se cultivaron después de triptinizacion en MEM Cultivo Celular

3. Materiales y Métodos Aislamiento del ARN Se aisló de las células del DF usando Tri-Reagente para luego ser tratado con Dnasa I a 37 grados C por 1 hora para remover la contaminación El total del ARN fue cuantificado a una absorbancia de 260 nm usando un espectrofotómetro

4. Materiales y Métodos Análisis de la micro-selección del ADN El ARN total fue etiquetado con biotina -16-UTP para generar ARNc (kit TrueLabeling-AMP 2.0) El ARNc etiquetado fue hibridado a una quimoquina de rata y la microseleccion del oligo receptor ADN se hibridizo a 60 grados C por 18 horas, seguido de dos lavados a la misma temperatura. La selección se bloqueo en el buffer de bloqueo a temperatura ambiente por 40 min, se incubo con estreptavidina conjugada con fosfatasa alcalina por 10 min

5. Análisis de la micro-selección del ADN Luego fue lavada 4 veces de 5 min cada lavado La selección fue visualizada por incubación con un sustrato quimio-luminiscente CDP-Star a temperatura ambiente por 5 min. La imagen fue adquirida después de 20 min de exposición usando un sistema de imagen FluoChem 8800

6. Materiales y Métodos Transcripción reversa en tiempo real – Reaccion en Cadena de polimerasa Transcirptasa Reversa del virus de leucemia de murinoMoloney Sintetizar el ADN complementario de una cadena ADNc La reacción en cadena de polimerasa-transcripcion reversa en tiempo real fue usada para analizar la expresión MyD88, NF-kB-1, MCP-1 y RANKL en las células del Folículo Dentario

7. Materiales y Métodos Transfeccion in vitro de células DF con ARN de pequeña interferencia Se cultivaron 1 día antes de la transfeccion las células del DF en frascos T-25 en MEM La transfeccion se llevo a cabo usando LipofectaminaRNAiMAX Después de 5 min volúmenes iguales de SiRNA diluido y el re-agente de transfeccion fueron combinados e incubados a temperatura ambiente por 25 min para formar Si RNA lipofectaminaRNaiMAX Un milímetro del complejo fue agregado a 4 ml de cultivo de células para dar la concentración SiRNA final a 5 nM Las células fueron colectadas para la determinación de la expresión de genes usando el RT-PCR en tiempo real

8. Materiales y Métodos Inmunotincion Para la deteccion de la expresion de MyD88 in vivo Despues de 3 lavados con solucion salina Tris-buffered (TBS) las secciones fueron bloqueadas a temperatura ambiente por una hora en TBS Se fijaron la mandibulas de las ratas en el dia 5 postnatal con formalina neutral-buffered, decalcificada, deshidratada, sumergida en parafina y seccionada en 5um de grosor Luego se incubaron con anticuerpo primario MyD88 anti-humano policlonal de cabra Las secciones fueron lavadas 3 veces mas, se incubaron en 3,3’ DAB por 5 minutos

9. Materiales y Métodos Tratamientos con IL-1alfa Las celulasDF fueron tratadas con IL-1alfa a una concentracion de 5 ng ml por 1,3,6 y 12 horas Luego fueron cosechadas para aislamiento de ARN seguido de analisis RT-PCR en tiempo real Los tratamientos con IL-1alfa fueron tambien aplicados a las celulas DF con expresion del MyD88 y las celulas fueron transfectadas con SiRNA codificado. Despues de 48 horas de transfeccion, las celulas fueron tratadas con IL-1alfa por 2 horas La expresion de NFKB1, MCP-1 y RANKL fue determinada usando RT-PCR en tiempo real

10. Materiales y Métodos Ensayo de quimiotaxis y osteoclastogenesis en vitro Se presentaron en platos de 24 pozos Costar Transwell Los platos fueron incubados por 1 hora a 37 grados C con 5 % de CO2. Despues de 1 dia de cultivo, el CM o MEM fue reemplazado con medio de diferenciacion de osteoclastogenesis El cultivo fue teñido mediante actividad de fosfatasa acido resistente al tartrato (TRAP) El estudio se repitio 4 veces

11. Materiales y Métodos Análisis Estadístico Los datos fueron analizados por el programa SAS Se utilizo ANOVA para evaluar la expresion del gen cronologico y luego los medios fueron separados usando la prueba de diferencia menos significante (LSD) Valor de P menor o igual a 0.5 Los datos de otros experimentos fueron analisados usando T-Test pareado con un valor P menor o igual a 0.5

12. Resultados Expresión de MyD88 en el DF Para determinar si la proteína de MyD88 fue expresada las secciones de los primeros molares fueron inmuno-teñidos para expresión de proteínas Dando como resultado una mayor expresión de la proteina al 3 día de 1.7, 1.4 y 1.9 veces mas alta q los días 1,5 y 7

13. Resultados Regulación ascendente de la expresión MyD88 en las células FD mediante IL-1alfa La expresión de MyD88 estaba incrementada en las células del FD después de 3 horas de tratamiento con IL-1alfa alcanzando expresión máxima después de 6 horas

14. Resultados Reducción de la expresión de NFKB1 y MCP-1 en las células FD con cese de MyD88 La expresión de NFKB1 fue significativamente reducida de 24 a 72 horas después de la trasnsfeccionSiRNA . La expresión de MCP-1 permaneció sin cambiar en las 24 horas después de la transfeccion pero se redujo significativamente en las 48 y 72 horas después

15. Resultados Requerimiento de MyD88 para exppresion de IL-1alfa mejorada del NFKB1, MCP-1 y RANKL La IL-1alfa mejoro la expresión de NFKB1, MCP-1 y RANKL. Después que MyD88 fue eliminado la IL-1alfa no tuvo efecto sobre la expresión de NFKB1 y MCP-1 dejando sus niveles de expresión al 39% y 60% por debajo a sus niveles basales y 60 a 75% por debajo que en los niveles mejorados. Esto sugiere que la MyD88 es requerido para la expresión de IL-1alfa mejorada de NFKB1, MCP-1 y RANKL

16. Resultados Reducción de la actividad quimiotáctica y osteoclastogénesis in vitro mediante CM de las células FD con derrocamiento de MyD88 Para determinar la reduccion las células mononucleares atraídas por CM fueron cultivadas en el medio de diferenciación de osteoclastogénesis. El CM de SiMyD88 dio una reduccion de 46% en el numero de osteoclastos por pozo comparado con CM SiControl. Para el SiControl + CM de IL-1alfa, mostro un incremento del 41% en el numero de osteoclastos por pozo sobre CM de SiControl

17. Discusión MyD88 también juega un papel en la regulación de la osteoclastogénesis en el FD para la erupción dental subsecuente. Por lo tanto futuros experimentos fueron presentados para determinar como el MyD88 regula la expresión del gen relacionada con la osteoclastogénesis y la erupción dental Otros estudios han mostrado que el MyD88 es esencial para la expresion elevada de MCP-1 inducida por infección bacterial o mediante injuria por puñalada. Resultados similares se encontraron en estudios de ratones deficientes en MyD88 que muestran que la expresion de RANKL no tenia respuesta a la estimulación con LPS, diacillipopeptido o IL-1alfa.