El documento resume los resultados de varios estudios sobre la suplementación con quercetina y resveratrol en el semen porcino refrigerado. Encontró que la quercetina retrasa la capacitación espermática y reduce la reacción acrosómica, mejorando la fertilidad. El resveratrol redujo la peroxidación lipídica y el daño al ADN espermático sin afectar la cinética, protegiendo la integridad de la membrana y el material genético. Los antioxidantes como la quercetina y el resveratrol pued

1. EXAMEN DE CALIFICACIÓN
DARIO LEON GONZALEZ ROMERO
Estudiante Doctorado en Biotecnología
Director:
Giovanni Restrepo Betancur Z., MV., MSc., Ph.D.
Comite Tutorial
Alexandra Usuga Suárez, MVZ., Ph.D.
Leonardo Hernández Corredor, Ing.Prod. Animal, MV, Esp., M.Sc., Ph.D.
UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
SEDE MEDELLÍN
FACULTAD DE CIENCIAS
2020

2. En cuanto a los estudios realizados en la suplementación con quercetina en el semen
porcino han sido escasos, los pocos estudios reportan resultados son en la aplicación
a protocolos en embriones Invitro.
En el artículo “The effect of blueberry extracts and quercetin on capacitation
status of stored boar sperm” es uno de los pocos estudios donde se reporta la
suplementación de quercetina en el semen porcino siendo de vital importancia como
referente para nuestro estudio.
El semen de cerdo es altamente susceptible al choque frío posterior a la colección
dando como resultado bajas tasas reproductivas, disminución en las tasas de parto y
tamaños de camada reducidos.
Se reporta que el 99% de las cerdas a nivel productivo utilizan la inseminación
artificial, el uso de congelación y descongelación todavía no tiene aplicación comercial
sino a nivel investigativo.
El semen porcino conservado entre 15 y 20 °C pueden durar hasta cinco días, sin
embargo, el semen refrigerado también sufre capacitación y reacción acrosómica
además de oxidación lipídica durante el proceso de refrigeración lo cual reduce la
fertilidad del verraco.
Es importante el análisis de este artículo debido a que es de las pocas referencias
que tiene la suplementación de quercetina en el semen porcino por lo tanto será un
referente para nuestro estudio donde encontramos que no hay concentraciones
establecidas para la suplementación en semen porcino
En ese estudio se realizaron colectas de cuatro verracos de raza Duroc; y se obtuvo
12 eyaculados, luego se diluyó en un medio BTS a una concentración de 50 millones
de espermatozoides por ml. Para este estudio se suplemento con extracto de
arándano al 8% y quercetina al 0,1 mM. Se realizó un ensayo de refrigeración a 16°C
y a 5°C durante 7 días. Cada tratamiento se realizó por duplicado y se midió
capacitación espermática y reacción acrosómica a los días 3,5 y 7 además para el
análisis estadístico se realizó mediante una anova para determinar el efecto de la
suplementación en el diluyente.
En la siguiente tabla se muestra el porcentaje de capacitados y no capacitados
además de la reacción acrosómica del semen porcino en el diluyente BTS, con la
suplementación de extracto de Blueberry o Quercetina; donde la temperatura no tuvo
influencia en los resultados, los autores al no ver ninguna diferencia en la temperatura
no lo reportan en la tabla de resultados.

3. Para la quercetina tuvo mejor resultado en la reducción de la capacitación
espermática comparado con el control y se redujo la reacción acrosómica al día 5 y 7
comparado con el control, además mejora la reducción de la capacitación espermática
y mantiene similares valores en cuanto a la reacción acrosómica; aunque la reacción
acrosómica es importante para la fertilidad reducir este parámetro es importante para
la capacitación en el proceso de fertilización Invitro.
Por tanto, se puede llegar a la conclusión de que la quercetina en la suplementación
del semen en refrigeración retrasa la capacitación espermática durante el proceso.
En el artículo “The Effect of Resveratrol on the Quality of Extended Boar Semen
During Storage at 17ºC”, es importante su análisis debido a que es la única
referencia encontrada en la literatura con dosis de inclusión en el diluyente porcino en
el proceso de refrigeración.
Siendo un hecho que la inseminación artificial es la mayor práctica de reproducción
en las granjas porcinas, esta biotecnología permite la distribución del material
genético de reproductores de alto mérito genético y la comercialización de los
eyaculados, además de aumentar el tiempo de vida de estas células espermáticas.
Uno de los principales factores que afectan la fertilidad del semen es el daño a nivel
de membrana espermática debido a que ésta compuesta por una alta concentración
de ácidos grasos poliínsaturados que los hace sensibles al daño inducido por los
radicales libres de oxígeno (ROS) produciendo el proceso llamado peroxidación
lipídica
El uso de antioxidantes es una forma de prevenir o mitigar los daños realizados por
estos radicales libres. Entre estos antioxidantes tenemos el Resveratrol (RSV) que
es un polifenol natural que se extrae de la uva, posee diferentes beneficios al ser un
compuesto anticancerígeno, antienvejecimiento, antiinflamatorio además de ser
cardioprotector y neuroprotector.

4. Se han realizado diferentes estudios en la adición de resveratrol a 0.1, 1 y 10 mM; en
la criopreservación de semen humano y reducen la peroxidación lipídica y el daño del
ADN por los radicales libres, aunque reduce la peroxidación lipídica y el daño al
material genético no se ha visto en los estudios en humanos una mejora en la cinética
espermática, pero si en la integridad de la membrana y el material genético para
inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI).
En carneros el uso de Resveratrol en la suplementación de semen mostró una
disminución del potencial de membrana y no hay efecto en la cinética espermática ni
en la integridad acrosomal.
En humanos la suplementación con resveratrol a 100 uM, reduce la viabilidad y en
ratas a 15 uM tiene un efecto potencial contra los radicales libres.
Se ha demostrado que a nivel dietario mejora el diámetro de los túbulos seminíferos
produciendo un aumento del tejido del tejido espermático a dosis de 20 mg por
kilogramo de resveratrol
En el experimento se utilizaron 6 machos cada uno con dos eyaculados, el semen
fresco contenía en promedio 35 millones de espermatozoides por ml, los cuales se
diluyeron en BTS, luego se suplementaron con diferentes concentraciones de
resveratrol a 10, 33 y 100 uM a 17°C durante varios días para luego evaluar el efecto
en la cinética espermática (análisis casa) y por citometría de flujo: integridad de la
membrana y potencial de membrana mitocondrial; estos valores se analizaron los días
1, 4 y 7.
Se realizó una citometría de flujo para evaluar la viabilidad de los espermatozoides,
la integridad y potencial de membrana donde los fluoruros fueron excitados a 488 nm
Con un total de 10,000 eventos.
Para un segundo experimento se analizó el análisis de calcio intracelular además de
la evaluación e integridad de la membrana acrosómica donde se excitaron las células
a una longitud de onda de 365 nm. Se realizó una tinción de Hoechst 33342 para un
total de 10,000 eventos.
Para la viabilidad de los espermatozoides se realizó una tinción fluorescente usando
el kit de viabilidad vivos y muertos con SYBR-14 (2uM) y Yoduro de Propidio IP (10
uM) en 500 µl de la muestra, durante 20 minutos a temperatura ambiente en la
oscuridad para luego las células ser analizadas por citometría de flujo y determinar el
porcentaje de espermatozoides viables donde seria SYBR-14 positivo y yoduro de
propidio (PI) negativo.
Para la evaluación del trastorno por fosfolípidos de la membrana plasmática se utilizó
mediante merocianina-540 y una doble tinción YoPro-1

5. Se toma una muestra semen puro (100 µl) a 35x106 esp/ml y se mezcla en 400 µl de
diluyente éste contiene 2 µl Yopro-1(0,08 uM) a 38 °C durante 15 minutos luego se
agregan 2 µl de M540 (4 uM) y se incuba durante dos minutos luego se mezcla y se
realiza el análisis de citometría de flujo.
Para la evaluación de la integridad del acrosoma se realiza una tinción con aglutinina
de maní conjugada con fluoresceína PNA-FITC, como marcador del estado del
acrosoma y PI. Se incuba 100 µl de semen puro a temperatura ambiente, en la
oscuridad durante cinco minutos con 5 µl de solución PNA-FITC (3 ug/ml en DMSO)
y 5 ul de PI (6 uM) y se diluye en 400 uL de diluyente. El resultado de la lectura da el
porcentaje de espermatozoides vivos con acrosoma intacto o acrosoma dañado. PI
negativo y PNA positivo
Para el potencial de membrana mitocondrial se utilizó la sonda Jc-1, esta sonda emite
una luz en el especto naranja cuando se excita haz 488 nm. Las mitocondrias con
bajo potencial de membrana emitirán luz en el espectro verde a 525 nm. Se toma
una muestra de 100 µl de semen puro se diluye en 400 µl de diluyente con 3 µl de
Jc1. Y se reportará el porcentaje de células teñidas de color naranja como células de
alto potencial de membrana mitocondrial
Como medición de la capacitación espermática se midió la afluencia de calcio en el
semen porcino en refrigeración donde se utilizó tres medios para evaluar las
condiciones capacitativa o no capacitativas donde contenía: cloruro de sodio, glucosa,
cloruro de potasio, sulfato de magnesio y gentamicina, para determinar cómo era la
dinámica del calcio a nivel celular todos los medios. Los medios se ajustaron a un pH
de 7.8 y se mantuvo una temperatura de 38°C con un porcentaje de CO2 del 5%,
donde un medio tenía calcio, bicarbonato y el control no contenía calcio ni bicarbonato
Para este experimento se prepara una adición de 2 uL de solución madre y 2 mL de
semen en una concentración de 20 millones de espermatozoides por mililitro, se
incubaron en la oscuridad a temperatura ambiente posterior a 30 minutos se realizó
un Percoll para obtener los espermatozoides vivos.
Luego se realizó una centrifugación de 300 gravedades a 10 minutos, posterior se
hizo otra centrifugación a 750 gravedades por 15 minutos, se obtuvo el sobrenadante
y se diluyó en el medio control con Rsv y sin Rsv, luego se adicionó el colorante en el
medio con flou-3. en alícuotas de 5 ml para los medios con bicarbonato, con calcio y
control, además fueron suplementados con yoduro de propidio a una concentración
de 2.5 µg/ml y Hoechst 33342 (0,75 ug/ml)
Las muestras analizaron en citometría de flujo, las señales para yoduro de propidió
distinguieron las muertes de membrana plasmática defectuosa ( PI-positivas) y las
membranas plasmáticas intactas saldrían (PI-negativas) mientras que el Fluo-3 las
células que tengan baja fluorescencia se tomarán como negativas y con alta

6. fluorescencia se tomarán como positivas, entonces se tomarán cambios en la
subpoblación de calcio cuando sean negativos a PI y Fluo-3 -, en un tiempo de 60
minutos donde se mide la respuesta el bicarbonato a la exposición de condiciones de
capacitación en los tres medios: bicarbonato, calcio y control
Para la cuantificación de ATP los espermatozoides se refrigeraron y después se
encubaron a 38°C inmediatamente después se adicionaron en 100 uL de semen a 20
millones de espermatozoides con 1 uL de inhibidores de la fosfatasa y fueron
incubados a 38°C por 40 minutos, y posteriormente el semen se congeló a -20°C,
para esa extracción se utilizaron 900 µl de buffer en un tiempo de 10 minutos luego
se centrífugo a 5000 gravedades por 30 minutos a 4°C y se utilizó 25 uL del
sobrenadante en un kit llamado Bioluminiscencia de ATP siguiendo las
especificaciones de el kit.
Para el análisis estadístico se determinó mediante una estadística descriptiva luego
se realizó mediante parcelas q-q para una distribución normal, para realizar un
análisis de varianza paramétrico para determinar el efecto del tratamiento con
Resveratrol en los días 1,4 y 7 además de las características de motilidad, contenido
de ATP, viabilidad, desorden de fosfolípidos a nivel de membrana, integridad
mitocondrial, estatus mitocondrial y contenido intracelular de calcio; donde se realizó
un análisis lineal mixto para determinar efecto del tratamiento y se realizó una
correlación de Pearson para determinar la correlación entre la cantidad de ATP, los
parámetros de motilidad y la concentración de resveratrol, y se utilizó un software
estadístico SPSS versión 15 para Windows con un nivel de significancia de P menor
a 0.05
Para determinar el efecto del resveratrol en el semen de cerdo refrigerado se utilizaron
las concentraciones de 10, 33, 66 y 100 uM y se evaluaron los días 1, 4 y 7 en
almacenamiento a 17°C donde se evaluaron todos los parámetros de cinética
espermática
Resultados
La suplementación con resveratrol a dosis de 10 y 33 µl mejoraron en la motilidad
espermática y en la velocidad comparados con el control. A altas dosis 66 y 100 µl
disminuyeron la motilidad espermática y la velocidad curvilínea.
En cuanto a la viabilidad, la integridad acrosomal y los desórdenes de fosfolípidos de
la membrana no se evidencio diferencia significativa entre los tratamientos, a
diferencia de la suplementación con resveratrol a 10 µl donde se ve una disminución
significativa con respecto a los otros tratamientos.

7. En cuanto al potencial de membrana mitocondrial no se halló diferencia significativa
entre los tratamientos, pero en el resveratrol a 33 uM, expreso mayor potencial de
membrana mitocondrial con respecto a los otros tratamientos junto con la
suplementación a 66 uM.
Los niveles de ATP suplementados a diferentes concentraciones de resveratrol las
17°C no se halló diferencia significativa en los días 1,4 y 7.
Discusión
Algunos estudios han mostrado que a dosis bajas mejoran la función celular, pero a
dosis altas aumenta la muerte celular y disminuye la motilidad, pero mejora la
funcionalidad de la membrana mitocondrial sustentando diferentes estudios donde
han mostrado resultados divergentes con el uso de resveratrol.
A diferencia del semen humano el semen porcino tiene más tolerancia a las dosis
altas de resveratrol contrastando con el semen ovino donde el resveratrol disminuyó
todos los parámetros de motilidad seminal a 5°C durante siete días.
Con respecto a la membrana plasmática y a la integridad acrosomal fueron similares
a los obtenidos en la motilidad espermática, las dosis altas de resveratrol mostraron
una disminución en la integridad de membrana de membrana comparado con
estudios en semen de carnero no hay diferencias significativas con respecto a este
parámetro.
Los últimos ensayos se han centrado en evaluar el potencial de fertilización del semen
y su capacidad de responder a las señales del oviducto, por ende se realizan estudios
de fertilización experimentales donde se mide la capacidad de respuesta al estímulo
que produce el bicarbonato en condiciones de laboratorio, intentando simular lo que
pasaría a nivel normal en el oviducto in vivo. Además, la medición del calcio permite
determinar la homeostasis de las células espermáticas donde a 33 µl de resveratrol
los espermatozoides no pueden revertir la respuesta del bicarbonato y por tanto la
inestabilidad que provoca el tiempo de almacenamiento. De manera diferente
cuando el resveratrol se incluye a 100 µl induce una reducción significativa en la
respuesta al bicarbonato, otros estudios dicen que a 20 ug/mL se relaciona con un
alto potencial de membrana mitocondrial.
Para la cantidad de ATP se ve que cae de tres a seis veces cuando se utiliza a 33 uL
y se reduce de 10 a 20 veces cuando se utiliza a 100 uL esto puede ser la razón por
la cual se disminuye la motilidad espermática, es decir a medida que se aumentando
la concentración de resveratrol se han encontrado correlaciones positivas entre la
cantidad de ATP y el porcentaje de movilidad tratadas con resveratrol y se ha
demostrado que hay una correlación significativa entre el nivel de ATP y la velocidad
de los espermatozoides; las muestras que contiene una menor cantidad de ATP se
mueven con velocidades más bajas.

8. Se puede concluir que la adición de resveratrol en espermatozoides humanos puede
realizarse debido a que reduce el daño de ADN pero como no tiene inferencias sobre
la motilidad espermática se puede realizar en procedimientos de inyección
intracitoplasmática en problemas de fertilidad reducida, sin embargo en la caída del
ATP, el potencial de membrana, el aumento del trastorno de fosfolípidos y el menor
porcentaje de espermatozoides móviles hacen suponer que las muestras tratadas con
altas dosis de resveratrol podrían considerarse sub fértiles comparadas con un
control, es decir que se necesitarían más ensayos para determinar la toxicidad
relacionada con la fertilidad del semen porcino.
Articulo: Use of fluorescence-activated flow cytometry to determine membrane
lipid peroxidation during hypothermic liquid storage and freeze-thawing of
viable boar sperm loaded with 4, 4-difluoro-5-(4-phenyl-1,3-butadienyl)-4-bora-
3a,4a-diaza-s-indacene-3-undecanoic acid
La fertilidad de los espermatozoides después del proceso de preservación disminuye
debido al daño oxidativo producto de las especies reactivas de oxígeno (ROS), estas
células son susceptibles al sulfato de hierro y a la peroxidación lipídica catalizada por
Ascorbato de Hierro (FeAc) y medido por un marcador llamado Malondialdehido
(MDA) derivado del metabolismo del ácido araquidónico.
Esta medición total del MDA nos proporciona una estimación de la peroxidación
lipídica de las células, pero tiene como desventaja que no mide células vivas/muertas,
por tanto no es un resultado diferencial entre la peroxidación lipídica de la población
total de espermatozoides.
Un ácido graso conjugado fluorescente llamado Bodypi es una sonda de membrana
cuya fluorescencia marca cambios de rojo a verde según la exposición de radicales
libres en la peroxidacion oxidativa, es un método altamente sensible que da alguna
indicación de la exposición fisiológica relevante de los fosfolípidos de la membrana
expuestos a radicales libres de oxígeno.
Como punto de inicio, se realiza una colecta seminal y se mide cinética espermática
y concentración, además se realiza un Percoll y se lleva a una concentración de 150
millones de espermatozoides por ml.
Se realiza la dilución en un medio BTS a una concentración de 30 millones de
espermatozoides por ml.
Una vez que tiene esta dilución, se lleva a un medio TRY no capacitante que no
contiene cloruro de calcio.
Una vez se obtiene esta mezcla se procede a congelar en pajillas de 0.5 ml; en un
medio que contiene 11% de lactosa, 20% de yema de huevo, 3%de glicerol y 0.5 de
dodecil sulfato de sodio.
Posterior a la descongelación se mide cinética espermática y se incuban a 37°C una
vez el semen está descongelado se adiciona 200 µl de etanol y se incuba a 37°C
durante 30 minutos el exceso de sonda se retira con el medio TYR, para después
realizar una centrífugacion a 300 g durante 7 minutos, además se carga con yoduro

9. de propidio (9,6 uM) y se incuba otros 10 minutos a 25°C antes de realizar la
citometría.
Para la citometría se utilizó para la florescencia verde de la oxidación del Bodypi un
filtro de 525 nm y la florescencia roja del yoduro de propidio a un filtro de 675 nm.
Para la detección de radicales libres en los tratamientos fue mediante citometría de
flujo de la oxidación de hidroetidina → etidio, en células que excluyeron el colorante
nuclear Yo-Pro1.
El resultado será para cada muestra el porcentaje de espermatozoides viables que
contienen hidroetidina oxidada basada en la intensidad de fluorescencia de etidio por
cada célula, esto será mediante un detector Fluo-3 y la viabilidad será por medio de
la florescencia o más bien de la baja fluorescencia de la sonda Yo-pro1.
Para determinar la fiabilidad del Bodypi se realizaron ensayos preliminares donde se
determinó las concentraciones de sulfato de hierro, Ascorbato de sodio y el tiempo de
exposición para poder determinar la mejor concentración, las cuales variaban entre 0
y 250 um en un tiempo entre 5 y 120 minutos a 37 °C.
Para los experimentos 1a y 1b para la especificidad del Bodypi en la oxidación de
hydroethidina, se utilizó un compuesto FeAc. El cual es una mezcla de sulfato de
hierro con Ascorbato de sodio, además se utilizó peróxido de hidrógeno, y
Menadiona(vitamina k3), como generadores de ROS.
Para cada uno de estos tres tratamientos se realizó por medio de una eyaculado de
cuatro cerdos que fueron diluidos en una proporción 1:4 durante 120 minutos a 37 °C
donde contenía 30 um de menadiona, 30 uM de peróxido de hidrógeno y 1/30 uM del
compuesto férrico.
Para el experimento 2 se utilizó un agente quelante como es el ácido
etilendiaminotetraacético (EDTA) y Deferoxamina mesilato (DFM) atenuado.
Se obtuvieron 13 eyaculados de tres cerdos divididos en seis porciones los cuales se
incubaron por 30 y 120 minutos a 37 °C, para los seis tratamientos en combinaciones
de Ascorbato de hierro y DFM a diferentes proporciones, lo mismo se realizó para los
seis tratamientos comparados de las FeAc con el EDTA
Para el experimento 3 se compara el efecto del líquido hipotérmico en un diluyente
BTS con Ascorbato de hierro, donde, se utilizaron dos eyaculados de dos cerdos a
una concentración de 30 millones de espermatozoides por ml, estos se dividieron en
cinco porciones, las cuales se incubaron a 25°C por 30 minutos esto para el día 0
(d0), luego a 17 °C por 24 horas (d1) y 17 °C por 120 horas (d5) y se realiza un modelo
experimental en bloques con un arreglo factoría el 2 ×2.

10. Para el experimento 4 se determina la proporción de cambios del ascorbato de hierro
en la peroxidación lipídica de la membrana a diferentes concentraciones de EDTA
posterior al proceso de congelación.
Resultados
Para los experimentos 1a y 1b. Expresados en la tabla uno se ve que, para el Control,
Peróxido de Hidrógeno y Menadiona: no mostraron respuesta en el % de Bodypi, con
gran diferencia cuando se asoció con el compuesto Ascorbato de hierro dónde
aumenta hasta un 92,9% en comparación con los otros tratamientos y la intensidad
de florescencia también aumento y continuó amentando en un tiempo de 30 a 120
minutos.
Para el experimento 1b se comparó el efecto del H2O2, menadiona y FeAc en la
oxidación del hidroetidio (HE), donde se determinó que en presencia de agentes
generadores de ROS, cómo es la Menadiona y el H2O2 aumentó la oxidación HE y
la fluorescencia de etidio cuando estaban presente estos compuestos.

11. En la siguiente figura, se expresa la motilidad de los espermatozoides: En el control
se mantuvo en aproximadamente el 70% a los 30 y 120 minutos. En comparación con
los espermatozoides de control, solo el H2O2 disminuyó (P <0.05) la motilidad a los
30 min. Sin embargo, después de 120 minutos, la motilidad disminuyó (P <0.05)
durante el tratamiento con H2O2, MEN y FeAc.
Figura 1. Efectos de menadiona (MEN), H2O2 (HP) y ascorbato de FeSO4-Na (FeAc) sobre el
porcentaje de espermatozoides móviles de jabalí después de la incubación a 37 ° C (30 min 
120 min)
En la siguiente tabla se muestra el Efecto de 30 minutos de incubación con (DFM)
en la peroxidación basal y de FeSO4-Na ascorbato- (FeAc) inducida por
(BODIPY) en espermatozoides viables de cerdo
En la adición de DFM a FeAc, el porcentaje de espermatozoides con BODIPY oxidado
y fluorecencia denotan en las respuestas a 3 y 9 uM DFM, no fueron diferentes a las
respuestas en ausencia de FeAc.
En el siguiente grafico se muestra la motilidad con respecto a la adición de diferentes
inclusiones de DFM y FeAc, donde en promedio se comporta en todos los
tratamientos de manera similar con un promedio de 75%, únicamente decreciendo en
el tratamiento donde se incluye 1/30 FeAc, 0 y 1 de DFM

12. Efectos del almacenamiento de líquido hipotérmico BTS sobre los cambios
basales e inducidos por FeAc en la oxidación de BODIPY581 / 591 en
espermatozoides viables de cerdo
Solo el tratamiento con FeAc fue una fuente de variación para la oxidación de
BODIPY. La intensidad de fluorescencia y el porcentaje de células con BODIPY
oxidado no se vieron afectados por el tiempo de almacenamiento o la interacción del
tratamiento con FeAc con el tiempo de almacenamiento.
La oxidación de BODIPY basal en ausencia de FeAc en el dia 0 al dia 5 fue en
promedió 1.0%, y la intensidad de fluorescencia de BODIPY / esperma promedió 0.3.
La presencia de FeAc aumentó el porcentaje de espermatozoides viables que
contienen BODIPY oxidado a una media general del 82% y la intensidad de
fluorescencia de BODIPY / célula a una media general de 1.3.
La viabilidad en el día cero, 91%, fue mayor (P <0.05) que la viabilidad en el dia 1 y 5
(85.5 y 82%, respectivamente); las medias en presencia o ausencia de FeAc no fueron
diferentes (P = 0,83)

13. Efecto del tiempo en presencia de FeAc, en semen de cerdo refrigerado a 5°C
La interacción del tiempo con respecto a los niveles de FeAc, se evidencio a los 5
días donde se ve la diferencia de la inclusión de 1/30 uM de FeAc con respecto a la
no-inclusión.
Efecto de la inhibición de la oxidación de BODIPY por FeAc y muerte celular por
el quelante de metales EDTA en esperma de cerdo descongelado viable.
Gráficos de puntos bidimensionales citométricos de flujo de intensidades de
fluorescencia de 10.000 espermatozoides de cerdo individuales a partir de semen
descongelado teñido con C11-BODIPY591 / 691 (BODIPY) y yoduro de propidio (PI).
Los espermatozoides se incubaron durante 30 minutos a 37 ° C en ausencia (panel

14. A) o en presencia de ascorbato de FeSO4-Na (FeAc, 1 y 30 uM, respectivamente;
panel B) y con FeAc y EDTA 9 uM (panel C). Se añadió yoduro de propidio para
distinguir entre la membrana intacta y las células permeables. Los datos en los
cuadrantes 1 y 3 representan espermatozoides viables con fluorescencia PI de baja
intensidad. En ausencia de FeAc (panel A), solo el 4% de los espermatozoides
descongelados viables contenía BODIPY oxidado. La presencia de FeAc (panel B)
aumentó el porcentaje de espermatozoides que contienen BODIPY oxidado al 78%
de los espermatozoides viables. El tratamiento con EDTA bloqueó el efecto de FeAc
(panel C), con solo el 4% de la población viable que contiene BODIPY oxidado
En ausencia de FeAc y EDTA, el nivel basal de peroxidación BODIPY fue bajo; solo
el 3.4% de los espermatozoides descongelados contenía BODIPY oxidado.
En de las gráficas de puntos para esperma descongelado (panel A, cuadrante 1) y
esperma fresco (datos no mostrados) reveló una pequeña subpoblación de
espermatozoides viables descongelados que contienen BODIPY oxidado que estaba
ausente o reducido en esperma fresco.
En comparación con ningún FeAc, la inclusión de EDTA 9 uM solo causó una ligera
disminución (P <0.05) en el porcentaje de esperma que contiene BODIPY oxidado a
1.2%.
En comparación con ningún FeAc, la presencia de FeAc aumentó el porcentaje de
espermatozoides que contienen BODIPY oxidado al 75,4%.
La presencia de 3 o 9 uM de EDTA con FeAc mantuvo el porcentaje de esperma que
contiene BODIPY oxidado y la intensidad de fluorescencia de BODIPY / célula en
niveles bajos que no fueron diferentes de los niveles en esperma en ausencia de FeAc
y EDTA.
Los gráficos de puntos muestran el aumento de la intensidad de fluorescencia verde
BODIPY causada por FeAc (panel B, cuadrante 1) en comparación con la ausencia
de FeAc (panel A, cuadrante 1) y muestra el efecto inhibidor de EDTA sobre la
peroxidación de BODIPY inducida por FeAc (panel C, cuadrante 1).
La viabilidad media del esperma descongelado en ausencia de FeAc fue
aproximadamente del 64%. La presencia de FeAc solo disminuyó (P <0.05) viabilidad
a 48.9%. La presencia de EDTA (todas las concentraciones) con FeAc mantuvo la
viabilidad a niveles que no diferían de la ausencia de FeAc
La movilidad del esperma descongelado en ausencia de FeAc (con o sin EDTA) fue
estable en aproximadamente el 23% de 30 a 120 min

15. La inclusión de EDTA 3 o 9 uM con FeAc bloqueó completamente el efecto de FeAc
al mantener la motilidad a niveles similares a los espermatozoides incubados en
ausencia de FeAc.
Discusión
El ensayo de Bodipi es un análisis superior comparado con el análisis de MDA, para
determinar la peroxidación lipídica en células, en este estudio fue importante
determinar la peroxidación lipídica y la motilidad debido a los efectos nocivos de los
radicales libres producto de la preservación.
En espermatozoides mamíferos se encuentra alta cantidad de superóxido dismutasa
a nivel mitocondrial y citoplasmático por lo cual el peróxido de hidrógeno es
responsable del daño a la estructura de la membrana, esto es debido a que el
peróxido de hidrógeno pasa fácilmente por la membrana y a través de la reacción de
Fenton produce radicales hidroxilos.
La peroxidación lipídica se desencadena debido a la acción de los radicales hidroxilos
y por los hidroperóxidos lipídicos existentes después de la conversión en radicales
alcoxilos por la reacción de Fenton.
Un resultado fue que la formación de radicales libres en ausencia de un sistema
generador de radicales es muy bajo no todas las células están dotadas de enzimas
que eliminan los radicales libres teóricamente son la catalasa, glutatión peroxidasa
los cuales reducen el peróxido de hidrógeno hacia la molécula de agua.
En semen fresco de cerdo la tasa de peroxidación lipídica es baja. La interacción de
la reducción de temperatura hace que se reduzca la peroxidación lipídica en el semen
de cerdo, a una temperatura baja reduce el nivel de formación de superóxido a nivel
mitocondrial debido a la reducción del metabolismo mitocondrial.
El uso de Bodipy puede capturar una amplia gama de radicales libres durante la
exposición al estrés oxidativo, la oxidación de hidroetidio por superóxido o peróxido
de hidrógeno producto de la oxidación de Bodipy por la acción de los radicales:
hidroxilo, alcoxilo y peróxilo.
Las especies reactivas de oxígeno inhiben el movimiento de los espermatozoides y
tienen efectos tóxicos al realizar daños en las proteínas, ácidos nucleicos y los lípidos
de las membranas celulares; hay veces son tan altas las concentraciones de radicales
libres que no pueden ser contrarrestados por los mecanismos de defensa naturales
de la célula, los cuales se encuentran en el plasma seminal como son los
antioxidantes enzimáticos entre ellos: superóxido dismutasa, el sistema glutatión
peroxidasa y catalasa y una serie de antioxidantes no enzimáticos como ascorbato,

16. urato, alfa-tocoferol, piruvato, glutatión, taurina e hipotaurina. Este efecto protector
de los antioxidantes se encarga de secuestrar los radicales libres, pero éste no
funciona cuando en la conservación a bajas temperaturas se aumenta la cantidad de
ROS y también a medida que transcurre los días se ve reduce la viabilidad
espermática producto de estas reacciones.
Algunos estudios aseguran que la inclusión de vitamina e disminuye la pérdida de
viabilidad y la peroxidación lipídica en espermatozoides almacenados durante cinco
días.
Una razón de la eficiencia en la disminución de la temperatura en el medio BTS
pudiera ser un componente presente en el medio el cual es el quelante EDTA el cual
está a 3.35 mM en el medio.
En el semen descongelado es más sensible a la presencia de Ascorbato de Hierro
comparado con el semen fresco. En el semen descongelado aumentó la peroxidación
lipídica, disminuyó la motilidad y también bajo la viabilidad.
Cuando se adiciona ETA a 9 uM disminuyó la florescencia de Bodypi de 3.4 a 1.2%.
Es posible que el hierro y otros metales están presentes en el plasma seminal y en la
yema de huevo y están disponibles para sufrir una reacción de Fenton si él EDTA no
los quela.
Debido a la peroxidación lipídica producto del procesamiento del semen porcino se
ve la necesidad de incluir yema de huevo dializada, la cual ofrece una protección para
los iones de hierro en el proceso de peroxidación lipídica. Estudios en carneros
sustentan esta teoría.
En conclusión, podemos decir que la medición de Bodypi por citometría de flujo
permite la medición de MDA para determinar el porcentaje de espermatozoides
viables afectados por la peroxidación lipídica y medir los cambios a lo largo del tiempo
además nos permite distinguir entre células viables y no viables para no incurrir en un
falso resultado totalizando la peroxidación de toda la población de espermatozoides.
Art: Improvement of the quality of boar cryopreservation semen by
supplementing with low density lipoprotein in diluents
El uso de congelación en el semen porcino no es utilizado comúnmente en las granjas
comerciales debido a que está asociado con una menor tasa de parto y un bajo
tamaño de camadas, donde se ha demostrado que el ROS afecta el ADN y causa que
la hebra se dañe, las muestras de semen que contienen alto daño de ADN están
asociados con la disminución de las tasas de fertilización y producción de embriones
después de la inseminación artificial y esto puede estar asociado a muerte
embrionaria.

17. Se han utilizado varios crioprotectores y protocolos en la congelación de semen
porcino y se ha demostrado que las lipoproteínas de baja densidad podrían ser una
fuente de resistencia contra el choque frío y mejorar la motilidad e integridad
acrosomal.
Para este estudio se determinó el efecto de LDL sobre los parámetros de calidad e
integridad del ADN además de la motilidad en el proceso de congelación.
Si utilizaron 100 eyaculados provenientes de cerdos raza Durok y Yorkshire donde se
utilizó un diluyente a base de Tris.
Para los tratamientos se incluyeron concentraciones de LDL al 6,7,8,9,10 %
Luego se realizó una curva de refrigeración previo a la congelación donde fueron
empacadas en pajillas 0,25 mL, a una velocidad de descenso de 5°C por minuto.
Las características de movimiento espermático se evaluaron mediante un sistema
casa y la integridad del acrosoma se valúa mediante aglutinina de Mani marcada con
FITC.
Para la integridad del. ADN se terminó mediante el ensayo del cometa neutral que es
un ensayo que determina la presencia de “un cometa” que indica el daño a nivel de
ADN mediante florescencia.
Para los resultados se observa que en los espermatozoides móviles totales el mejor
tratamiento es la inclusión de LDL al 8 y 9 %, mejorando la motilidad y la velocidad
en línea recta, similares valores se encontraron en la integridad de membrana
plasmática, la integridad del acrosoma y la actividad mitocondrial donde los mejores
tratamientos fueron el 8 y 9 por ciento de inclusión con LDL.
En cuanto al ADN se observa que la inclusión de LDL reduce daño en la integridad
de ADN.
Por tanto, las propiedades críoprotectoras de las LDL mejora tanto la motilidad, las
características del movimiento coincidiendo con estudios que han reportado mejores
tasas en fertilización invito cuando la inclusión es del 8%.
Las LDL se componen de un 90% de lípidos y un 10% de proteínas, las cuales tienen
un núcleo de triglicéridos rodeado por una película de proteínas, por tanto son
responsables del efecto críoprotector de los espermatozoides, al formar una película
protectora que recubre la superficie de las membranas de los espermatozoides
produciendo un proceso de gelificacion en la congelación y es congelación

18. En los procesos de conservación el daño a la membrana y ADN está altamente
relacionado en la reducción de parámetros de movimiento por ende la inclusión con
LDL es un método sencillo y altamente beneficioso para el procesamiento de semen
porcino.
Art. The Cryoprotective Effect on Frozen-thawed Boar Semen of Egg Yolk Low
Density Lipoproteins
Para el proceso de criopreservación de semen porcino se han utilizado diferentes
protocolos de congelación basados en la modificación del diluyente, donde la
inclusión de yema de huevo ha sido fundamental en el desarrollo de nuevos
protocolos. La yema de huevo generalmente se usa a una concentración de 20% en
la inclusión del diluyente, pero algunas sustancias son perjudiciales, las cuales
pueden ser eliminadas por medio de centrifugación.
Numerosos estudios han determinado que el componente fundamental de la yema de
huevo son las lipoproteínas de baja densidad ya que son las responsables de la
resistencia contra el choque térmico y por ende mejora la motilidad de los
espermatozoides, la integridad del acrosoma y la membrana plasmática posterior al
procesamiento del semen.
La extracción de las LDL es por medio de procesos de centrifugación y diluciones
donde se procede a incluir concentraciones al 6,7,8,9 y 10 por ciento en el medio de
congelación a base de Tris.
Posterior a la descongelación se determinó el efecto de la inclusión de LDL en la
motilidad espermática, la integridad acrosomal y Test host, además de las
correlaciones entre el host, la integridad acrosomal y la motilidad
Los métodos de críoprotección de las LDL todavía no están muy diferenciados. Las
LDL son importantes en el proceso de gelificación y los otros componentes de la yema
de huevo no participan en este proceso, por tanto, se inhibe la formación de cristales
de hielo intracelulares durante el proceso de congelación.
Cuando las concentraciones son mayores del 10% se va formando agregación de
gránulos que conduce a la disminución de características favorables, teniendo efecto
nocivo sobre la calidad espermática
Los reportes en la motilidad poscongelación están aproximadamente en el 54 al 57%
de motilidad total, el host alrededor del 50% y la integridad acrosomal cerca de 70%
dónde el mejor tratamiento es la inclusión entre el 8 y 9 por ciento; en cuanto a la
motilidad se reportan mejores resultados en una inclusión al 6%

19. Los espermatozoides no pueden fertilizar el óvulo inmediatamente después de la
eyaculación en mamíferos, y deben adquirir la capacidad de fertilizar la "capacitación"
en el tracto reproductor femenino. La unión a la zona pelúcida estimula a los
espermatozoides a experimentar una reacción acrosómica (AR) en la cual las
membranas acrosómicas externas se fusionan con la membrana plasmática
suprayacente, este evento exocitótico fisiológico resulta en la liberación de enzimas
hidrolíticas que son esenciales para el proceso de fertilización. Los espermatozoides
que el acrosoma ha inducido la pérdida espontánea después de la eyaculación o por
daños físicos no pueden fertilizar los óvulos. La integridad acrosómica es un indicador
adicional necesario de la función potencial de los espermatozoides para fertilizar los
ovocitos en Al. Por lo tanto, la evaluación de los daños del acrosoma después del
proceso de congelación-descongelación es un parámetro muy importante a
considerar. Para la evaluación del estado del acrosoma influirá en la unión de muchas
lectinas, proteínas que interaccionan con los glicoconjugados de las membranas
acrosomal para estas reacciones se podría utilizar: aglutinina de maní, concanavalina
A, aglutinina de Arachis hypogaea y Ricinus communis
Actualmente, utilizamos la prueba de unión FITC-PNA. Muestra una afinidad por los
residuos terminales α-D-glucosilo y α -D- manosilo de las glicoproteínas presentes
principalmente en las membranas acrosómicas de los espermatozoides de los
mamíferos.
A nivel de microscopía de fluorescencia, la señal que representa la unión de PNA se
limita principalmente a la tapa acrosómica de los espermatozoides de cerdo. Por lo
tanto, FITC-PNA puede usarse como una sonda confiable para detectar reacciones
de acrosoma en espermatozoides de cerdo. La observación microscópica mostró que
los espermatozoides congelados en el extensor de LDL mostraban una fluorescencia
verde en su región acrosómica, esta esencia de flúor es un indicador de la presencia
del acrosoma. Hubo 70,3% de espermatozoides intactos con acrosoma en semen
diluido por un extensor que contenía 9% de LDL en nuestro estudio, que disminuyó
significativamente en comparación con el semen fresco. La pérdida acrosómica puede
ocurrir debido a un proceso degenerativo después de la muerte de los
espermatozoides.
La prueba de inflamación hipoosmótica (HOST) es un predictor de una membrana
plasmática intacta. HOST se basa en el principio de que los espermatozoides
hinchados en medios hipotónicos muestran flagelos enrollados cuando su membrana
plasmática permanece intacta. Los flujos de agua arrojan la membrana y entran en la
célula, restableciendo así el equilibrio entre los compartimentos extracelulares e
intracelulares. El volumen de células aumenta y el área de la membrana se expande,
haciendo que el flagelo se enrolle. Los espermatozoides con membranas plasmáticas
dañadas no se inflan y no se produce hinchazón o curvatura de las colas

20. Los resultados del estudio indican una correlación significativa entre la motilidad de
los espermatozoides, los métodos FITC-PNA y HOST utilizados para evaluar la
calidad del semen después del proceso de congelación y descongelación.
La hinchazón de los espermatozoides en respuesta a condiciones hipoosmóticas da
como resultado la aparición de una cola enrollada.
El procedimiento HOST fue una prueba sensible y reproducible para evaluar la
integridad funcional de las membranas de esperma de cerdo después de la
incubación en condiciones de estrés hipoosmótico, y puede ser una herramienta útil
para detectar poblaciones de espermatozoides menos viables cuando se usa junto
con otro tipo de prueba de integridad de la membrana
La motilidad de los espermatozoides estaba altamente correlacionada con HOST (r =
0.965), lo que sugiere que la integridad de la membrana plasmática está relacionada
con la motilidad de los espermatozoides. Los coeficientes de correlación entre la
motilidad espermática y la integridad del acrosoma, y la integridad de la membrana
plasmática y la integridad del acrosoma son 0.545 y 0.503, respectivamente.
Las 3 pruebas se usaron para evaluar la viabilidad de los espermatozoides, la
estrecha correlación entre las pruebas puede sugerir que cualquiera de ellas sería un
indicador de diagnóstico igualmente eficaz de la calidad de los espermatozoides de
cerdo después de congelar y descongelar.
En conclusión, nuestros resultados muestran claramente que las LDL poseen
propiedades crioprotectoras notables para los espermatozoides de cerdo congelados
y descongelados, y pueden reemplazar la yema de huevo entera en el extensor con
mejores resultados en términos de motilidad (54.4%), integridad del acrosoma (70.3
%) e integridad de la membrana plasma (50.8%). Además, se ha determinado que la
concentración óptima de LDL en el extensor de semen de cerdo es del 9% (p / v).
Se necesita más investigación para evaluar y comprender el mecanismo preciso
respectivo de los lípidos y las apoproteínas para proteger los espermatozoides en el
proceso de congelación y descongelación de LDL. Además, el nuevo método y
tecnología también es necesario para desarrollar y aislar el agente antagonista
contenido en la yema del huevo.