El documento describe los métodos de producción de proteínas recombinantes en bacterias y levaduras, incluyendo la producción de quimosina en E. coli usando un plásmido y la producción de antígeno de superficie de hepatitis B en levaduras. También discute el uso terapéutico de proteínas recombinantes como insulina, interferón y eritropoyetina.

1. UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
QUÍMICA FARMACEUTICO BIOLÓGICA
BIOSINTESÍS Y BIOTECNOLOGÍA
PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
Canchola Carrillo Eileen
Muñoz Herrera David
Nava Pintor Edgar Ezequiel
Ocampo Olvera Silvestre Alfredo Semestre 2014/2
Torres Torres Edna Yuzi 30 de Abril del 2014
.

2. INTRODUCCIÓN

3. Hormonas, interferones y
diversas enzimas

5. Técnicas de DNA recombinante Significaron una revolución en la producción
de este tipo de compuestos. Permite alterar los genes y expresarlos de tal
manera que se pueden obtener proteínas con propiedades funcionales
mejoradas o corregir defectos genéticos
•Vector de expresión, un plásmido q contiene secuencias de control de
trascripción y traducción en posiciones adecuadas.
•Proteínas de eucariontes. El DNA recombinante con la secuencia que
codifica la proteína también presenta las secuencias.

6. MARCO HISTÓRICO

7. • Biotecnología Aplicación de los principios de la ciencia e ingeniería
al procesamiento de materiales por agentes biológicos. La definición
actual se refiere también a los productos.
El consumo de la bebida aumentó
al transcurrir los siglos; se tuvieron
que desarrollar métodos que
permitieran obtener grandes
volúmenes.

11. RECOMBINACIÓN NATURAL
Conjugación
Transducción
Transformación

16. MUTAGÉNESIS
Herramienta para el mejoramiento de cepas.

17. MUTACIÓN
Es un cambio heredable en la secuencia de nucleótidos del DNA.
Puede o no producir un cambio observable en el individuo.
Se presenta súbita y espontáneamente.
10-10 mutaciones por generación por gen

18. MUTÁGENOS FÍSICOS
• Mutaciones puntuales
• Dímeros de Timina
• Roturas cromosómicas
• Radiación UV
• Rayos γ
• Rayos X

19. MUTÁGENOS QUÍMICOS
Ácido Nitroso
Agentes alquilantes
Sustancias análogas a las bases nitrogenadas
Sustancias intercalantes

20. MUTAGÉNESIS INDUCIDA
Someter a los microorganismos a repetidas rondas de Mutagénesis,
seguido de una detección y selección apropiadas de los
sobrevivientes, ha sido una herramienta muy efectiva en el
mejoramiento de muchos microorganismos utilizados industrialmente.

21. INGENIERÍA GENÉTICA DE
MICROORGANISMOS
Producción de proteínas en bacterias.

22. • La tecnología de DNA recombinante ha permitido que
secuencias específicas de ADN sean transferidas de un
organismo a otro.
• Esto puede ser utilizado para incrementar el rendimiento de un
producto mediante la remoción de los cuellos de botella en las
rutas metabólicas y amplificando o modificando pasos
específicos en la ruta metabólica.
• Dado que no hay restricción para el origen de los genes que
expresa un microorganismo, la producción de proteínas de
origen animal y vegetal se ha hecho posible

23. • La Ingeniería Genética implica la manipulación del DNA
fuera de la célula.
1. Aislamiento y recuperación del gen de interés.
• Regulación de su expresión.
2. 3. Inserción del DNA en la célula huésped mediante un
vector de fácil manipulación.
4. Reproducción.

24. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
EN BACTERIAS
Uso de vectores para la inserción del DNA

25. Usualmente resulta necesario insertar un gen exógeno en un
vector que se replica autónomamente en el microorganismo
hospedero y actúa como un transportador del segmento de
DNA exógeno insertado.

26. PLÁSMIDOS
• Características
• Origen de replicación
• Gen de resistencia a
antibióticos
• Comúnmente el DNA
exógeno y el plásmido
son cortados con la
misma enzima de
restricción.
• El plásmido recombinante
se introduce por
Transformación

27. La introducción de plásmidos recombinantes por Transformación se
puede lograr con un tratamiento de Cloruro de Calcio, lo cual somete a
la membrana celular haciéndola más permeable al DNA exógeno.

28. VECTORES DE FAGO Λ

30. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
Detección y Selección de clones Recombinantes
PCR y Bases de Datos
Expresión de los Genes clonados
Recuperación y Purificación de Proteínas

31. • Método de hibridación.

32. • Método fenotípico
• Método
inmunológico

33. Colonias con defectos nutricionales
Métodos Genéticos

35. BASES DE DATOS

36. EXPRESIÓN DE LOS
GENES INSERTADOS.

37. ALTOS NIVELES DE
EXPRESIÓN DE PROTEÍNA
• Factores genéticos.
Características del gen, estabilidad del ARNm, Promotor
empleado, cepa utilizada
• Factores fisiológicos.
Componentes del medio de cultivo, estrategias de
cultivo, parámetro en el fermentador.

38. RECUPERACIÓN Y PURIFICACIÓN
DE PROTEÍNAS
• Acumulación de proteína en citoplasma
*Lisis de la célula
*Puede ocurrir la formación de cuerpos de inclusión.
• Acumulación de proteínas en el espacio
periplasmático.
*Choque osmótico

39. *Separar por centrifugación
O filtración.
** remoción de ácido nucleicos
mediante agentes policatiónicos
*** precipitación de la proteína
con sale s o resinas de integración
hidrofóbica
**** purificación final por métodos
cromatográficos.

40. PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA
EN E. coli

41. PRODUCCIÓN DE QUIMOSINA (RENNINA)
• Es la proteasa (Aspartil-proteasa) que se produce en
una mayor proporción en el cuarto estómago de los
rumiantes lactantes.

42. RENNINA
• Se libera como PREPROQUIMOSINA
PRE 16 aa PRO 27 aa QUIMOSINA
PRO 27 aa QUIMOSINA
QUIMOSINA

43. ¿QUÉ HACE LA
RENNINA?
• Coagula la leche por la
hidrólisis de k-caseina

44. PROBLEMA
¿Solución?
Rennina producida por hongos como Mucor o
Endothia

45. PRO 27 aa QUIMOSINA
Rennina recombinante

46. QUIMOSINA
RECOMBINANTE
• Fusión al extremo N-
terminal de LacZ o TrpE
• La secuencia de la
proquimosina se insertó
nmediatamente después
del RBS y el codón ATG

47. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
EN LEVADURAS

48. GENOMA NUCLEAR S. CEREVISIAE
Distribución genoma S. cerevisiae
Comparación en tamaño de
genomas

49. GENOMA NO NUCLEAR

50. YAC’S “YEAST ARTIFICIAL
CHROMOSOMES”
Centromérico
Episomal
(Lanzadera)

52. MEJORA EXPRESIÓN
GENÉTICA
Acetilación
Otras
• Glicosilación
• Insertar genes de
glicosilación humanos
• Deleción de genes de
glicosilación
• Cadena de oligohistidina

53. CEPA E. COLI K12 JA 198, VECTOR PBR322, GEN PROQUIMOSINA ERAN 3
SEGMENTOS SE INSERTAN EN EL VECTOR Y SE DEJA LA CEPA CON EL
VECTOR EN MEDIO PARA FORMAR CUERPOS DE INCLUSIÓN.

54. PRODUCCIÓN DE ANTÍGENO
DE SUPERFICIE DE LA HEPATITIS B
POR LEVADURAS

55. VACUNA DE LA
HEPATITIS B
Antígeno de superficie del virus
de la hepatitis B (HBsAg)

56. 9 RESIDUOS DE G
3 RESIDUOS DE G

57. GLUCOSILACION, PLEGAMIENTO Y
ACETILACIÓN DE HBSAG
Humano
• N-Glucosilado
• Exportado hacia la
membrana vía Golgi
• Plegamiento en
partículas de 22 nm
• Acetilado
Levadura
• No glucosilado
• Se acumula en el
citoplasma
• Plegamiento en
partículas de 22 nm
• Una fracción se acetila

58. PRODUCCIÓN DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
Uso Terapeútico

60. PROTEÍNAS
RECOMBINANTES: USO
TERAPÉUTICO
•Factor de necrosis tisular-α
Anticuerpos
•Interferones, Interleucinas , TNFCáncer y infecciones
virales
•Eritropoyetina, Hirudin, Uroquinsa, Activador
de plasminógeno tisular
Enfermedades
cardiovasculares
•Insulina, Hormona del crecimiento
Hormonas
•Endorfinas, NeuropéptidosEnfermedades
Neurológicas
•Hepatitis-B
Vacunas
•Factor de crecimiento epidermico, de
fibroblastos y factor VIII de la coagulación
Cicatrizantes y factores
de coagulación

61. DNASAS: FIBROSIS
QUÍSTICA
DNasas 260 aa
(Pulmozyme®, FDA 1996)
Viscosidad
del moco

62. ERITROPOYETINA
EPOGEN®
1989

63. SOMATOTROPINA (HGH)
hGH
191 aa
Cadáveres
Bovino o
porcino
Recombinante
(E. coli)

64. SOMATOTROPINA
192 aa
N-formilmetionina
N-formilmetionil-Hgh
PROTROPIN® 1985

65. INSULINA
• Primera proteína recombinante de uso farmacéutico.

66. E. Coli
o S. cerevisiae
Cadena A Cadena B
Insulina
Humulin® , FDA 1981

67. INTERFERÓN
IFN-α IFN-β
IFN-γ
• Hepatitis C
• Cáncer renal
• Leucemias
• Mieloma • Esclerosis múltiple
• Leucemia
• Cáncer renal

68. I
N
T
E
R
F
E
R
Ó
N

69. INTERLEUCINAS
IL-2
(PROLEUKIN®,
FDA 1992)
Carcinoma
renal

70. FACTOR ACTIVADOR DEL
PLASMINÓGENO TISULAR
(TPA)
tPA (Serín
proteasa)
Plasminógeno Plasmina
Disolución del
coágulo

71. COLÁGENO
Pichia augusta
Pichia pastoris
Colágeno
tipos I y III

72. REFERENCIAS
• Lauersen, K. J.; Berger, H.; Mussgnug, J. H.; Kruse, O. Efficient
recombinant protein production and secretion from nuclear
transgenes in Chlamydomonas reinhardtii . Journal of
Biotechnology 167 (2013) 101-110.
• Singer, M; Berg, P. Genes y Genomas. Una perspectiva
cambiante. 1993, 1a edición, Ediciones Omega, S.A,
Barcelona, España. pp 227-229.
• Klug, W. S; Cummings, M.R. Conceptos de Genética. 1999,
5a edición, Prentice Hall, México. pp 453- 454 y 504.
• Glazer, AN. Nakaido, Hiroshi.(2007) Microbial Biotechnology.
Fundamentals of applied microbiology. 2da Edición.
Cambridge University Press. Cambridge, UK. p. 90-143.

73. REFERENCIAS
• Waites, MJ. (2001) Industrial Microbiology: An Introduction.
Blackwell Science. London, UK. p. 80-84. 173-177.
• Mellor, J., M. J. Dobson, N. A. Roberts, M. F. Tuite, J. S.
Emtage, S. White, P. A. Patel, A. J. Kingsman and S. M.
Kingsman. 1983. Efficient synthesis of enzymatically
active calf chymosin in Saccharomyces cerevisiae.
GENE 24: 1-14
• J. M. Cregg1, ,†, J. F. Tschopp1, C. Stillman1, R.
Siegel1,High–Level Expression and Efficient Assembly of
Hepatitis B Surface Antigen in the Methylotrophic
Yeast, Pichia Pastoris, Nature Biotechnology 5, 479 - 485
(1987) doi:10.1038/nbt0587-479