El documento describe un experimento de laboratorio para determinar la actividad enzimática de la ureasa a través de dos métodos: reacción de neutralización y método colorimétrico. Se utilizaron tubos de ensayo con diferentes muestras que contenían ureasa y se incubaron, observando la formación de productos en uno de los tubos pero no en el otro. Los resultados mostraron actividad enzimática de la ureasa a través de la formación de productos alcalinos. El objetivo de demostrar la actividad enzimática de la ureasa se logró

1. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
ESCUELA DE INGENIERÍA AMBIENTAL
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LA UREASA
LABORATORIO N.º 02
AUTORES:
RODRIGUEZ CARBONELL JUAN MANRRIQUE
RODRIGUEZ RODRIGUEZ SOFIA MELISA
SÁNCHEZ TORRES LIZANDRO RAUL
SILVESTRE VILLACORTA PAMELA EVELYN
TACANGA SILVA LIZBETH CORIN
BIOQUÍMICA AMBIENTAL - A
V CICLO
Docente:
Mg. OLGA DANITZA PLASENCIA CERNA
TRUJILLO- PERÚ
2022

2. 2
ÍNDICE
1. RESUMEN 3
2. INTRODUCCIÓN 4
3. OBJETIVOS 5
3.1. OBJETIVO GENERAL 5
4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS 6
5. PROCEDIMIENTO 7
1. SISTEMA A 7
1.1. TUBO 1A 7
1.2. TUBO 2 A 7
1.2.1. Añadimos 0,5 ml de buffer en un tubo de ensayo y le
nombramos tubo 2A. 7
2. SISTEMA B 8
2.1. TUBO 1 B 8
2.2. TUBO 2 B 8
3. SISTEMA NESSLER 8
3.1. 3.1. TUBO BLANCO 9
3.2. 3.2. TUBO 1C 9
3.3. 3.3. TUBO 2C 9
6. RESULTADOS 9
6.1. DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO FORMADO POR
REACCIÓN DE NEUTRALIZACIÓN 9
6.2. DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO FORMADO POR
MÉTODO COLORIMÉTRICO (REACTIVO DE NEESLER) 10
7. DISCUSIONES 11
8. CONCLUSIONES 13
9. RECOMENDACIONES 13

3. 3
DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
DE LA UREASA
1. RESUMEN
Nuestro presente informe realizado en laboratorio durante clases, tuvo como
objetivo principal la actividad enzimática, la cual se ha demostrado mediante
dos métodos, el primero fue de Reacción de Neutralización y el otro fue por el
método Colorimétrico, cuya finalidad es encontrar su velocidad de reacción.
Por ello se recopiló información de fuentes primarias y secundarias que puedan
avalar su credibilidad presente en nuestro informe, en donde se precisa sus
bases teóricas, para cumplir con el objetivo principal.
La metodología empleada para nuestro trabajo es netamente cualitativa ya que
vamos a observar cambios de color en cada muestra.
Para el desarrollo de la práctica de laboratorio se usaron materiales biológicos
como la ureasa, equipos de laboratorio como gradillas para tubos, tubos de
ensayo, pipetas, goteros y también reactivos muy indispensables para este
experimento entre ellos Buffer HCL O.O5m, ph 7,2, la solución de urea 0,05%,
solución de rojo de metilo a 0,04%. La metodología empleada en nuestro
informe consta de observación experimental y un análisis minucioso donde
participará el sentido de la vista .En cuanto a los resultados estos fueron
descritos de acuerdo al tiempo que se empleó para cada muestra en el
proceso de incubación a una temperatura de 35,8°C ,observándose que en el
tubo número uno no existió reacción ni actividad enzimática pese a que se usó
los mismos materiales , mientras que en el tubo número dos si existió formación
de productos alcalinos .Por otra parte , la conclusión se plasmó basándose en
los objetivos .

4. 4
2. INTRODUCCIÓN
Las enzimas son proteínas que se encuentran compuestos por cadenas
unidas covalentemente de aminoácidos adheridos entre sí cumpliendo una
función catalizadora en los seres vivos para las reacción químicas que
ocurren en los mismos , acelerando dichas reacciones de tal manera que
no se lleguen a consumir en el proceso ni en formar parte del producto
(Ramirez,2014).Además, factores como el pH y la temperatura son factores
determinantes en la cual se puede determinar qué tan efectiva es la
actividad enzimática siendo el pH óptimo de la mayoría de las enzimas
cerca de 7 , es aquí donde alcanza una conformación tridimensional que le
permite tener una mayor actividad catalítica y en que una variación de la
misma ocasiona que la conformación nativa de la enzima se pierda y no
alcance una correcta función como catalizador , lo mismo ocurre con la
temperatura a la que es sometida la enzima , ya que estas son muy
sensibles a la temperatura alcanzan una menor actividad cuando son
expuestas a bajas temperaturas debido a la insuficiente cantidad de energía
para su actividad catalizadora .Por otro lado, a temperaturas elevadas su
actividad enzimática se incrementa por las colisiones de las moléculas
reactantes con las enzimas (Martínez ,2022).Un ejemplo de enzima con
actividad catalizadora es la Ureasa , esta es una enzima que se activa
debido a la interacción de dos átomos de níquel . Asimismo, cumple un
papel importante en la hidrólisis de la urea obteniendo como producto
moléculas de amoniaco y carbonato en donde cumple una respuesta
espontánea ante otras moléculas de ácido carbónico y amoniaco (Zumay,
2020).
Posteriormente, para el desarrollo de la investigación, se requiere
fundamentalmente de conocimientos en el campo de la bioquímica
ambiental, para ello se recurrió a artículos bibliográficos y profesionales
sobre trabajos investigativos referidos a la ureasa y su utilidad. De esta
manera (Lebrette et.al 2014) nos dice que esta no es funcional de inmediato,
si no que requiere unirse con dos átomos de níquel para que así se pueda
activar.

5. 5
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GENERAL
• Demostrar la actividad enzimática, determinando para ello
la actividad de ureasa.

6. 6
4. MATERIALES, EQUIPOS Y REACTIVOS
Equipos de Laboratorio
Gradillas para tubos 7 tubos de ensayo de
13x100 mm
Pipetas de 1 ml, 2 ml, 5
ml y 10 ml
Gotero o pipeta
descartable de plástico
Pizeta Espectrofotómetro y Baño
María
Material Biológico
Enzima Ureasa
Reactivos
Solución de urea 0.075 M Solución de ureasa 0.05
%
Solución de HgCl2 al 1%
Buffer Tris - HCL 0.05 M,
pH 7.2
Solución de rojo de metilo
0.04%
Agua destilada
Solución Nessler
Fuente: Elaboración propia

7. 7
5. PROCEDIMIENTO
1. SISTEMA A
COMPONENTES (ml) Y PROCESO
TUBOS
1A 2A
BUFFER TRIS – HCl 0,05 M pH 7,2 0,5 0,5
UREA 0,075 M BUFFEREADA 3,0 3,0
MEZCLAR Y PRE-INCUBAR A 37ºC POR 5 MINUTOS
UREASA 0,05 % --- 0,5
MEZCLAR SUAVEMENTE, INCUBAR A 37 ºC POR 15 MINUTOS
HgCl2 1% MEZCLAR 2 gotas 2 gotas
UREASA 0,05 % 0,5 ---
MEZCLAR, PREPARAR Y SEGUIR CON LOS SIGUIENTES SISTEMAS
1.1. TUBO 1A
1.1.1. Iniciamos añadiendo 0,5 ml de buffer en un
tubo de ensayo y le nombramos tubo 1A.
1.1.2. Agregamos al tubo 1A 3 ml de urea,
mezclamos y pre- incubamos durante 5 min
aproximadamente para llegar a una
temperatura de 37 ºC.
1.1.3. En el mismo tubo 1A adicionamos 2 gotas del
desactivante de enzimas Cloruro de Mercurio
(HgCl2 1%).
1.1.4. Finalmente, agregamos la enzima ureasa
0,05%, mezclamos, preparamos y analizamos.
1.2. TUBO 2 A
1.2.1. Añadimos 0,5 ml de buffer en un tubo de
ensayo y le nombramos tubo 2A.
1.2.2. Agregamos al tubo 2A 3 ml de urea,
mezclamos y pre- incubamos durante 5 min
aproximadamente para llegar a una
temperatura de 37 ºC, pero en la práctica se
llegó a 35,8 ºC.

8. 8
1.2.3. Agregamos la enzima ureasa 0,05%,
mezclamos, preparamos y dejamos reposar
por 15 min a 35,8 ºC.
1.2.4. En el mismo tubo 2A adicionamos 2 gotas del
desactivante de enzimas Cloruro de Mercurio
(HgCl2 1%), observamos.
2. SISTEMA B
2.1. TUBO 1 B
2.1.1. Agregamos 2 ml de una solución del tubo 1A
en la 1B.
2.1.2. Añadimos 2 gotas de rojo de metilo,
mezclamos, encima titulamos HCl 0,05 N
hasta obtener una coloración rosado claro.
2.2. TUBO 2 B
2.2.1. Agregamos 2 ml de una solución del tubo 2A
en la 1B.
2.2.2. Añadimos 2 gotas de rojo de metilo,
mezclamos, encima titulamos HCl 0,05 N
hasta obtener una coloración rosado claro.
3. SISTEMA NESSLER
COMPONENTES (ml) Y
PROCESO
TUBOS
BLANCO 1C 2C
TUBO 1 DEL SISTEMA
DE INCUBACIÓN
--- 0,1 ---
WTUBO 2 DEL SISTEMA
DE INCUBACIÓN
--- --- 0,1
AGUA DESTILADA 4,5 4,4 4,4
REACTIVO NESSLER 0,5 0,5 0,5
Dejar en reposo durante 10 minutos y leer el fotocolorímetro con filtro verde, o en
espectrofotómetro a 540 nm.
COMPONENTES (ml) Y
PROCESO
TUBOS
1B 2B
SOLUCIÓN 1A 2 ml ---
SOLUCIÓN 2A --- 2 ml
ROJO DE METILO 2 gotas 2 gotas
MEZCLAR
HCl – 0,05N TITULAR

9. 9
3.1. 3.1. TUBO BLANCO
3.1.1. Colocamos 4,5 ml de agua destilada.
3.1.2. Añadimos 0,5 ml del reactivo de Nessler,
mezclamos y dejamos reposar durante 10
minutos.
3.2. 3.2. TUBO 1C
3.2.1. Agregamos 0,1 ml del tubo 1B (Después
del sistema de incubación).
3.2.2. Luego colocamos 4,4 ml de agua destilada.
3.2.3. Añadimos 0,5 ml del reactivo de Nessler,
mezclamos y dejamos reposar durante 10
minutos.
3.3. 3.3. TUBO 2C
3.3.1. Agregamos 0,1 ml del tubo 2B (Después
del sistema de incubación).
3.3.2. Luego añadimos 4,4 ml de agua destilada.
3.3.3. Finalmente, agregamos 0,5 ml del reactivo
de Nessler, mezclamos y dejamos reposar
durante 10 minutos.
6. RESULTADOS
6.1. DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO FORMADO POR REACCIÓN DE
NEUTRALIZACIÓN
TABLA N.º 01. Volúmenes de HCl gastados y velocidad de formación.
Tubo V HCl gastado Velocidad (μmol urea
desdoblados/min)
1 0.15 ml --------
2 0.13 ml 0.6
Fuente: Elaboración propia.
• Hallando la velocidad de la reacción:

10. 10
velocidad =
(vol.HCl gastado(problema) − vol. HCl (blanco)) ∗ molaridad HCl ∗ 103
∗ 4
15 min ∗ 2 ∗ 2
• Remplazando con los datos anteriores de la tabla 1 para encontrar
la velocidad de la reacción en el tubo 2:
velocidad =
(0.15 ml − 0.13 ml) ∗ 0.05 ∗ 103
∗ 4
15 min ∗ 2 ∗ 2
𝐯𝐞𝐥𝐨𝐜𝐢𝐝𝐚𝐝 = 𝟎. 𝟔 𝐮𝐦𝐨𝐥/𝐦𝐢𝐧
6.2. DETERMINACIÓN DEL PRODUCTO FORMADO POR MÉTODO
COLORIMÉTRICO (REACTIVO DE NEESLER)
TABLA Nº 02. Volúmenes de HCl gastados y velocidad de formación.
TUBO Coloración
Blanco incoloro Reactivo Neesler
1 Medio amarillo Reactivo Neesler
2 incoloro Agua destilada
Fuente: Elaboración propia.
Figura 1: Coloración de la solución de los tubos
con el reactivo de Neesler
Fuente: Elaboración propia

11. 11
7. DISCUSIONES
En el sistema de incubación se empleó la enzima ureasa la cual
Quintero, et al (2002) nos dice que esta enzima se caracteriza por
ser una hidrolasa es decir está encargada de catalizar en el
sustrato de la urea mediante la hidrólisis teniendo como productos
al dióxido de carbono y al amoniaco, asimismo hace mención que
dicha enzima se encuentra en los animales, plantas y
microrganismos; es así que se le representa mediante la siguiente
ecuación:
H2NCONH2 + H2O → 2NH3 + CO2
En la tabla N.º 01, se determinó el volumen del producto que se
formó tras la reacción de neutralización con el ácido clorhídrico
(HCl) a una concentración de 0.05 M y a un valor de pH de 7.2.
Para ello utilizamos el rojo de metilo quien Gil, (2019) nos señala
que en su estudio el rojo de metilo se encarga de detectar las
alteraciones del pH, cuyo indicador de pH nos da un valor de 4.2
cuando parte del color rojo hasta 6.3 alcanzando un color
amarillento, para este caso se ha utilizado una muestra de 2 ml
del sistema de incubación al cual se le fue añadiendo el indicador
para posteriormente proceder a la reacción de neutralización
utilizando HCl.
Para el tubo 1 o blanco se obtuvo un volumen gastado de 0.15 ml,
es utilizado solamente para restarle las medidas a los tubos que
tienen las muestras, es por ello que no desarrolla una velocidad
de reacción debido a la ausencia de enzimas, es decir no tiene
una actividad enzimática.
Por otro lado, para el tubo 2 medimos el volumen gastado de HCl
que nos da el valor de 0.13 ml, posteriormente se encontró la
velocidad de reacción la cual fue de 0.6 umol/min y así demostrar
que en dicha muestra existe una actividad enzimática debido a la
presencia de enzimas.
En la tabla N.º 02 se utilizó el método cualitativo para la
recopilación de datos no numéricos partiendo de la observación

12. 12
de las reacciones; se empleó el método colorimétrico utilizando el
reactivo de Neesler para detectar pequeñas concentraciones de
amoniaco o catión amonio contenidos en una solución en donde
la sal de amonio disuelta comienza a reaccionar con el reactivo
de Neesler alcalino, esto trae consigo una elevación del pH de la
solución teniendo como producto al amonio; de igual forma se
aprecia coloración amarilla o incolora ante la presencia o ausencia
del amoniaco (Idavoy ,2015).
En el experimento realizado una vez ya añadido el reactivo de
Neesler en los tres tubos de ensayo ; se observó que el menisco
alcanzo la misma coloración incolora ; esto se debe a que se
formó una reacción negativa en la solución causado porque la
temperatura no alcanzo su activación a la temperatura de 37^o C
para que pueda trabajar en su máxima expresión ,por lo que una
temperatura inferior a su temperatura optima ocasiono que su
actividad enzimática se ralenticen como se observó en el
experimento al trabajar con otra temperatura inferior a 37^o C ; la
cual fue de 〖36.5〗^o C dando como resultado que en los 15 min
de tiempo de espera no se observó cambio alguno en la
coloración en el tubo de ensayo 2 que contenía la enzima ureasa
antes del cloruro de mercurio donde se tenía previsto que debía
cambiar su coloración. Además, Balta (2008), en su estudio sobre
el “Efecto de la temperatura en la actividad y la estabilidad térmica
de la inulinasa de Kluyveromyces marxianus” establece que la
temperatura en un proceso enzimático es un factor primordial
entre la actividad y la estabilidad enzimática, en donde en su
temperatura optima y pH ácido permitirían que la enzima alcance
una mayor actividad.

13. 13
8. CONCLUSIONES
• Actividad enzimática demostrada mediante dos métodos el
de Reacción de Neutralización y el Método Colorimétrico,
donde la velocidad es igual a 0.6 umol/min.
9. RECOMENDACIONES
• Se recomienda realizar un estudio previo de los fenómenos
que suceden en una reacción de actividad enzimática, con
la finalidad de poder reconocer los cambios que sucederán
durante la experimentación, pues estas pueden presentar
tendencias distintas a las encontradas en este trabajo de
laboratorio.
• Es recomendable determinar las propiedades
fisicoquímicas del material biológico y los reactivos a
utilizar, puesto que el conocimiento de estos parámetros es
de gran importancia ya que pueden limitar la actividad
enzimática.
• Por otro lado, es de suma importancia controlar la limpieza
de los equipos de laboratorio (siempre debe estar limpio y
seco), y la calidad de los tubos de ensayo y sustancias
empleadas para la prueba; nunca deben estar
contaminados por microorganismos u otras soluciones, ya
que puede variar los resultados obtenidos.
• Debido a la variabilidad de los resultados, es recomendable
contrastar siempre nuestros resultados con otros trabajos
de investigación, para así estar seguro que nuestros
resultados están dentro de los estándares.

14. 14
10. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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de-ph-rojo-de-metilo-que-es-y-para-que-funciona/
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Kluyveromyces marxianus NRRL Y-7571. Scientia
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312. http://www.scielo.org.pe/scielo.php?script=sci_arttext&pid=
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Ramírez, J. (2014). ENZIMAS: ¿QUÉ SON Y CÓMO FUNCIONAN? 15,
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15. 15
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