Manual de-microbiologia-cuba-unam

Manual de Técnicas
Microbiológicas
Para la Evaluación de la Calidad Ambiental
de Ecosistemas Marino costeros
HONORABLE AYUNTAMIENTO
DE SOLIDARIDAD 2008-2011

CRÉDITOS
COMITÉ EDITORIAL
Honorable Ayuntamiento
del Municipio de Solidaridad
C. Eduardo Román Quian Alcocer
Presidente
Dirección General de Ordenamiento
Ambiental y Urbano
Arq. Jorge Alonso Durán Rodríguez
Director General
Dirección de Medio Ambiente
M. en C. Gladys Pérez de la Fuente
Directora
MANUAL DE TÉCNICAS
MICROBIOLÓGICAS PARA EVALUACIÓN
DE LA CALIDAD AMBIENTAL DE
ECOSISTEMAS MARINO COSTEROS
Ministerio de Ciencia, Tecnología
y Medio Ambiente
Instituto de Oceanología, Cuba
Departamento de Microbiología-Necton
Dra. María Elena Miravet Regalado
M. en C. Diana Iris Enríquez Lavandera
Dra. Margarita Lugioyo Gallardo
Universidad Nacional Autónoma de México
Instituto de Biología
Departamento de Botánica
Dra. María del Carmen González Villaseñor
Colaboradores
Dirección de Medio Ambiente
M. en C. Gladys Pérez de la Fuente
Directora
M. en C. Nuria Joseph Montero
Lic. María Cristina Capó de Paz
Técnico Francisca Rodríguez Acosta

Estamos conscientes de la importancia de este libro para los especialistas de
habla hispana que se desenvuelven en el tema del medio ambiente e incluso, para los
estudiantes que se inician en esta línea, ya que brindan los detalles necesarios para de-terminar
la calidad ambiental del ecosistema marino a partir de diferentes indicadores
microbiológicos, que como es conocido, permite tomar medidas inmediatas para la
protección y/o recuperación de las condiciones naturales.
El presente Manual, resume las técnicas y metodologías de microbiología ma-rinas
más utilizadas para abordar los aspectos siguientes:
evaluación de la calidad del agua de uso • recreativo, desde el punto de
vista higiénico sanitario,
• evaluación de la calidad ambiental de las aguas y sedimentos en los
diferentes ecosistemas marinos (arrecifes, manglares, pastos marinos,
playas),
• determinación de microorganismos indicadores del grado de contami-nación
tanto orgánica, como por la presencia hidrocarburos, en la zona
costera marina,
• velocidad de autodepuración de las aguas marinas (importante para in-ferir
la capacidad de recuperación),
• parámetros microbiológicos útiles en estudios de factibilidad para situar
granjas para cultivo de organismos marinos,
• indicadores microbiológicos necesarios para hacer “líneas bases” en
sitios de desarrollo turístico, en aquellos donde se sitúen plataformas
petroleras u otras industrias.
•
Además de los indicadores de calidad ambiental, se incluyen técnicas para
aislar microorganismos de peces, crustáceos, algas y otros organismos marinos con di-versos
fines, y de interés biotecnológico como:
• técnicas para aislar microorganismos marinos productores de sustancias
biológicamente activas (tensoactivos, polisacáridos y luciferasa),
• técnicas para estudiar la diversidad de hongos marinos en playas, man-glares,
y arrecifes.
El Manual ofrece también detalles explícitos y recomendaciones prácticas para
facilitar el montaje de las técnicas e interpretación de los resultados, y constituye un
basamento adecuado para estudios de pre y postgrado de microbiólogos y biólogos ma-rinos.
Se merece destacar que es una importante contribución para el Programa Inte-gral
de Playas Limpias en México, en el cual participa el H. Ayuntamiento del Munici-pio
de Solidaridad, a través del Comité Local de Playas Limpias de la Zona Norte del
Estado de Quintana Roo.
PREFACIO
Editores

PRÓLOGO
La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 mil 500 mi-llones
de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio marino. Desde
entonces, los microorganismos constituyen un componente esencial de las redes tróficas
de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia y biomasa, contribuyendo a la re-generación
de nutrientes e interactuando con una amplia gama de organismos.
Los microorganismos marinos juegan un papel importante en los ciclos bio-geoquímicos
de carbono, el nitrógeno, el azufre, el fósforo, el hierro y los metales trazas,
pero además constituyen nuevas fuentes de producción de sustancias biológicamente
activas de interés para las industrias médico-farmacéutica, petrolera, alimenticia, etc.
Este Manual de Técnicas de Microbiología Marina, está dirigido a estudiantes,
docentes y especialistas de América Latina que se proponen a estudiar e investigar dife-rentes
aspectos relacionados con las bacterias y los hongos que habitan en el ecosistema
marino. Su principal ventaja es que en él se han recopilado técnicas y metodologías de
trabajo muy utilizadas en esta especialidad, que se encuentran dispersas en diferentes
publicaciones en otros idiomas, lo que facilita al usuario de habla hispana su consulta en
un único documento.
Otro aspecto importante de este documento, es que sirve de apoyo a los profeso-res
en la preparación y desarrollo de los programas dre educación superior relacionados
con las ciencias marinas, y a los jóvenes graduados que se inician en los trabajos de
ecología microbiana marina.
El manual se ha conformado dividido en seis capítulos. En el primero se abordan
aspectos teóricos generales sobre la distribución e importancia de los microorganismos
marinos en el ecosistema y algunas generalidades de los principales biotopos que carac-terizan
nuestra región.
El segundo capítulo reune algunas de las técnicas más utilizadas de enumeración
de bacterias heterótrofas, sulfatoreductoras y coliformes, de suma importancia en estu-dios
de contaminación orgánica y fecal en aguas marino costeras, así como las técnicas de
aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos y productoras de tensioactivos,
productoras de polisacáridos, bacterias luminicentes, bacterias asociadas a peces inverte-brados
marinos, y bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas.
En el tercer capítulo se describen técnicas y metodologías de aislamiento de
hongos marinos de playas, pastos marinos, manglares, y hongos asociados a gorgónidos,
haciéndose referencia a las claves más actualizadas de identeificación de estos microor-ganismos.
El cuarto capítulo explica los métodos que se utilizan para la conservación de
bacterias y hongos en el laboratorio, brindando referencias que permiten profundizar en
detalles específicos para cada caso.
En el capítulo quinto se describen las técnicas de conteo total de mecroorganis-mos
empleando microscopía de epifluorescencia, la determinación de bimasa a partir del

volumen celular y el conteo total y varios métodos para determinar la productividad bac-teriana.
También, se presentan las técnicas para determinar la productividad bacteriana.
También, se presentan las técnicas para determ,inar la fotosíntesis, producción primaria
y respiración, aspectos sumamente importantes en los estudios sobre el funcionamiento
del medio marino, y por último, se describen las técnicas para determinar la intensidad
de los procesos de descomposición aerobia y anaerobia de la materia orgánica, respec-tivamente,
empleando métodos que no requieren de una infraestructura compleja y re-cursos
sofisticados.
El capítulo sexto y final, brinda la composición de los medios de cultivo que se
han citado en los capítulos dos y tres, lo que permite disponer de toda la información
técnica necesaria para realizar las técnicas descritas.
Las técnicas que se describen en este manual han sido probadas con éxito en el
Laboratorio de Microbiología Marina del Instituto de Oceanía de Cuba y en el Labora-torio
de Ascomicetos del Instituto de Biología de la Universidad Nacional Autónoma de
Resulta meritorio el empeño colectivo de las autoras de poner a disponer del
alumnos y profesores el resultado de sus experiencias para contribuir al conocimiento
del mundo marino.
Esperamos que el noble propósito de las autoras les permita a los lectores seguir
los caminos de los nuevos conocimientos para habitar un mundo más sano y mejor.
Dra. Lina Domínguez Acosta
Viceministro
México.
Ministerio de Ciencia , Tecnología y Medio Ambiente de Cuba

“Hay más microorganismos en el mar que estrellas en el universo”
Copley, J. 2002. All at sea. Nature 415: 572-574.

PREFACIO
PRÓLOGO
CAPÍTULO 1. Introducción.
1.1. Distribución de los microorganismos en el mar ........................................................
1.2. Importancia de los microorganismos marinos ............................................................
1.3. Características de los Ecosistemas marinos ...............................................................
CAPÍTULO 2. Técnicas de Bacteriología.
2.1. Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas ........................................
2.2. Enumeración de bacterias sulfatoreductoras ..............................................................
2.3. Enumeración de Coliformes totales y fecales ............................................................
2.4. Enumeración de Estreptococos fecales ......................................................................
2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos ..........................................
2.6. Aislamiento de bacterias productoras de sustancias tensioactivas .............................
2.7. Aislamiento de bacterias productoras de polisacáridos extracelulares .......................
2.8. Aislamiento de bacterias luminiscentes ......................................................................
2.9. Aislamiento de bacterias asociadas a organismos marinos ........................................
2.10. Aislamiento de bacterias asociadas a macroalgas y fanerógamas marinas...............
CAPÍTULO 3. Técnicas Micológicas.
3.1. Aislamiento de hongos en las playas ..........................................................................
3.2. Aislamiento de hongos de los pastos marinos ............................................................
3.3. Aislamiento de hongos asociados al mangle ..............................................................
3.4. Aislamiento de hongos asociados a organismos marinos ...........................................
CAPÍTULO 4. Métodos de Conservación.
4.1. Bacterias .....................................................................................................................
4.2. Hongos ........................................................................................................................
CAPÍTULO 5. Técnicas y Métodos en Ecología microbiana.
5.1. Conteo Directo del Número Total de microorganismos .............................................
5.2. Determinación de biomasa .........................................................................................
5.3. Determinación de la Productividad bacteriana ...........................................................
5.4. Determinación de la Fotosíntesis, la Producción primaria y la Respiración ...............
5.5. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización aerobia de
la materia orgánica .....................................................................................................
5.6. Determinación de la intensidad del proceso de mineralización anaerobia
de la materia orgánica en los sedimentos ...................................................................
CAPÍTULO 6. Medios de Cultivo.
6.1. Bacterias .....................................................................................................................
6.2. Hongos ........................................................................................................................
469
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160
ÍNDICE

INTRODUCCIÓN
Microorganismo es un término que incluye distintas formas de vida
que comparten la característica común de tener un tamaño menor de 200 μm
(Tabla 1). Estas formas de vida pueden pertenecer a cualquiera de los tres do-minios
de la vida que existen en nuestro planeta, Archaea, Bacteria y Eukar-ya
(Woese et al. 1990), e incluye desde procariotas (bacterias y arqueas) hasta
eucariotas (algas y protistas fagotrofos), tanto autótrofos como heterótrofos.
Asimismo, dentro del ámbito de estudio de la Microbiología se incluyen los
virus y otros agentes subvíricos que no presentan estructura celular (López y
Zaballos, 2005). Recientemente, se ha propuesto un nuevo dominio biológico
denominado Akamara para incluir estas formas de vida (Hurst, 2000). Dentro
de este nuevo dominio se propone incluir dos reinos, Euviria (virus verda-deros)
y Viroidia (viroides y virusoides), y una organización en phyla, clases,
órdenes, géneros y especies similar a la del resto de seres vivos (Hurst, 2000).
Tabla 1. Diferentes categorías en que se agrupan los microorganismos de
acuerdo a su tamaño (Tomado de Sherr, E. y Sherr, B. 2000. Marine microbes: an
overview. En: Microbial Ecology of the Oceans. Ed. D.L. Kirchman, Wiley-Liss,
New York. 13-46).
Categoría Grupo Microbiano Tamaño (μm)
Femtoplancton Viruses 0.01-0.2
Picoplancton Procariotes
Página 3
Bacterias
Fotoautótrofos
Proclorofitas
Cianobacterias cocoides
Cianobacterias-filamentosas
Quimioautótrofas
Heterótrofas
Archaea
Picoalgas
Flagelados picoheterótrofos
0.5 – 1.0
0.5 – 2.0
1.0 – 2.0
7-10 ancho
<= 100 longitud
0.3-1.0
0.3-1.0
1.0-2.0
Nanoplancton Nanoalgas
Nanoheterotróficos-
(flagelados)
2.0-20
Microplancton Microalgas
Protistas microheterótrofas
Ciliados
Dinoflagelados heterótrofos
20-200

INTRODUCCIÓN 4 1.1. Distribución de los microorganismos en el mar.
En el mar, los microorganismos se encuentran distribuidos en toda su
extensión: desde la costa hasta zonas oceánicas muy distantes, y desde la super-ficie
hasta profundidades abismales, ocupando una gran variedad de habitats.
En la distribución y abundancia de los microorganismos marinos en el
océano se reconoce que influyen, de manera general, tres gradientes:
• Gradiente de profundidad, en el cual varía la cantidad y calidad
de la luz, la concentración de nutrientes, la temperatura y la pre-sión,
• Gradiente nerítico-oceánico, en el cual varía la disponibilidad de
materia orgánica teniendo en cuenta que en las aguas costeras-neríticas
hay mayor influencia del escurrimiento terrígeno y el
aporte de los ríos, y
• Gradiente latitudinal, que ocurre debido a las variaciones en la
energía solar, es decir, las bajas latitudes reciben más energía por
m2 que las altas latitudes, creándose vientos que causan mezclas,
afloramientos y corrientes en el océano.
Para facilitar su estudio, el ecosistema marino se ha dividido de manera
empírica (Fig.1).
Fig.1. Habitats marinos (Tomado de Taylor, B.F. 1992. Marine Habitats,
Bacteria. Enciclopedia of Microbiology, Vol.3, p.29-44).
Una primera subdivisión se hizo entre las aguas (hábitat pelágico) y los
sedimentos (hábitat béntico). Ambos habitats pueden corresponder a zonas de
plataformas insulares o continentales conocidas como neríticas (desde la costa

INTRODUCCIÓN
hasta 100 m de profundidad), o a zonas oceánicas de mas de 100 m de profun-didad,
hasta profundidades abismales.
También la interfase superficie del mar-atmósfera constituye un hábitat
Página 5
especializado donde habitan organismos llamados “neuston”.
Otro hábitat lo constituyen los vegetales y organismos marinos ver-tebrados
o invertebrados que proveen a los microorganismos de sus propios
cuerpos como superficies sobre las cuales pueden formar sus colonias, e inclu-so,
establecer relaciones de interacción muchas veces de beneficio mutuo.
Los restos de plantas y animales (detritus) y en general, los agregados
de materia orgánica (“nieve marina”), las partículas fecales e inorgánicas, así
como las estructuras sumergidas construidas por el hombre, constituyen tam-bién
superficies inanimadas que promueven el crecimiento microbiano en el
medio marino.
La composición química de los agregados es heterogénea, contienen
cantidades significativas de carbohidratos y proteínas por lo que constituyen
un micro hábitat rico en nutrientes con concentraciones de carbono y nitró-geno
varios órdenes de magnitud mayor que la encontrada en las aguas circun-dantes
(Alldredge y Silver, 1988). En estos agregados se han registrado elevadas
tasas de producción primaria (Gotschalk y Alldredge, 1989) y se ha comproba-do
que las bacterias que se desarrollan en ellos suelen ser fácilmente cultivables
y de tamaño mayor que las de vida libre (Eguchi y Kawai, 1992).
Los agregados constituyen reservorios de nutrientes para las bacterias
de vida libre, que pueden tomar su alimento directamente de ellos, aunque
también se ha constatado que las células que forman parte de los agregados
son responsables de la solubilización de las partículas de detritos mediante
actividad exohidrolasa, produciendo la liberación de carbono orgánico al me-dio
circundante (Smith et al. 1992). Los compuestos de bajo peso molecular
solubilizados pueden ser entonces utilizados por la comunidad de bacterias
pelágicas oligotróficas.
En la zona costera, la celulosa es el componente predominante del detri-tus.
Proviene tanto de la vegetación costera como de la submarina.
Las partículas de materia orgánica están formadas por proteínas, po-lisacáridos
(incluyendo quitina) y lípidos; algunos de estos compuestos son
degradados por los microorganismos en la columna de agua y otros menos ase-quibles
a la actividad microbiana (refractarios) se depositan en el fondo donde
ocurre su descomposición final.

INTRODUCCIÓN 6 Las partículas inorgánicas llegan al mar a través del escurrimiento te-rrígeno
y los ríos y también, provienen de dientes, esqueletos y conchas de
organismos marinos.
En resumen, los microorganismos pueden encontrarse libres en la co-lumna
de agua formando parte del plancton, en los sedimentos, o adheridos a
organismos o sustratos inanimados.
1.2. Importancia de los microorganismos marinos.
La historia evolutiva de los microorganismos se remonta a más de 3 500
millones de años y una parte importante de ésta ha ocurrido en el medio mari-no.
Desde entonces, los microorganismos constituyen un componente esen-cial
de las redes tróficas de los ecosistemas marinos, con una gran abundancia
y biomasa, contribuyendo a la regeneración de nutrientes e interactuando con
una amplia gama de organismos (López y Zaballo, 2005).
Dentro de la diversidad de microorganismos que habitan en el medio
marino, las bacterias y los hongos juegan un papel predominante, ya que se
ocupan de descomponer la materia orgánica presente en el mar dando lugar a
compuestos menos complejos asequibles a otros organismos de la trama ali-mentaria.
Un ejemplo importante es la capacidad de los hongos de despolimerizar
la celulosa y la pectina en la materia vegetal residual, con lo cual ablandan y
ayudan a la descomposición de dicho material, haciéndolo accesible para otros
invertebrados que pueden así devorarlo.
Paralelo al proceso de descomposición, las bacterias y los hongos asi-milan
los compuestos orgánicos disueltos para formar su propia biomasa, la
que a su vez, queda disponible para ser consumida como alimento por pro-tozoos
y flagelados, así como por otros organismos. Esta vía microbiana de
reincorporación de materia orgánica a la trama alimentaria se conoce como
“lazo microbiano” (“microbial loop”, Azam, 1998) y es de suma importancia en
el funcionamiento del ecosistema marino.
En aguas oceánicas profundas donde la presión hidrostática es como
promedio, 400 veces mayor que en la superficie, la temperatura es baja, y por lo
general, la materia orgánica es escasa, existen bacterias barotolerantes y barófi-las
adaptadas a la escasez de materia orgánica (oligotróficas) y a las bajas tempe-raturas
(psicrófilas) que juegan un papel preponderante en la descomposición
de los restos fecales producidos por los organismos (Taylor, 1992).

INTRODUCCIÓN
También, existen bacterias que viven en el intestino de anfípodos de
aguas profundas proveyéndolos de nutrientes que no pueden absorber por
otras vías.
Un descubrimiento de gran impacto fue conocer que determinados mi-croorganismos
quimiolitotrófos viven en asociación directa con invertebrados
(gusanos tubícolas) que habitan en fuentes hidrotermales submarinas que ex-pulsan
fluidos a 270-380°C. Estos invertebrados dependen de la actividad de
los microorganismos que crecen a expensas de las fuentes de energía inorgá-nicas
procedentes de las propias fuentes hidrotermales, e incorporan dióxido
de carbono, que se encuentra en abundancia en el agua de mar en forma de
CO3
2- y HCO3-, a la forma orgánica. Estos microorganismos quimiolitotrófos
proporcionan alimento a los animales, ya que estos se nutren de los productos
de excreción de los simbiontes y de las células muertas de los mismos, por lo
que se consideran la base de la corta trama alimentaria en la que se encuentran
los organismos que viven junto a las fuentes hidrotermales (Madigan et al.
1999).
Los microorganismos juegan un papel importante en los ciclos bio-geoquímicos
del carbono, el nitrógeno, el azufre, el fósforo, el hierro y los
Página 7
metales trazas.
En la mayoría de los ecosistemas, el nitrógeno es eficientemente recicla-do
debido a la actividad descomponedora de los microorganismos que da lugar
a formas inorgánicas como nitratos o amonio. En los pastos marinos, el nitró-geno
es fijado por las cianobacterias que viven en las hojas y por las bacterias
anaerobias que viven en las raíces, en los rizomas y en los sedimentos.
En los sedimentos, la oxidación de la materia orgánica ocurre a partir
del uso de diferentes aceptores de electrones en la medida que aumenta la pro-fundidad
y cambia la disponibilidad de estos compuestos (Fig.2).
Fig.2. Distribución típica de los compuestos aceptores de electrones
que utilizan las bacterias en los sedimentos (Tomado de Taylor, 1992).

INTRODUCCIÓN 8 Cuando se agota el oxígeno, más del 50% de la mineralización de la
materia orgánica ocurre gracias a la actividad de las bacterias sulfatoreducto-ras,
las cuales llevan a cabo este proceso a partir de la reducción de sulfatos en
condiciones anaerobias.
Entre los ciclos del azufre y el hierro se producen interacciones com-plejas
en muchos ambientes. Una de las formas más corrientes del hierro y
el azufre es la pirita (FeS2), la cual forma una estructura cristalina altamente
insoluble. La oxidación bacteriana de este compuesto tiene gran importancia
para el desarrollo de las condiciones de acidez en las minas y en los drenajes
mineros, y también, en el proceso de lixiviación de los metales.
Otra actividad de importancia económica y ambiental donde participan
los microorganismos es la descomposición del petróleo y sus derivados. La
eliminación del petróleo o de otros contaminantes mediante el uso de micro-organismos
se conoce como “bioremediación” y ha sido ampliamente utilizado
para descontaminar zonas donde se han producido vertidos de crudos.
También, se conoce que existen hongos y bacterias capaces de degradar
compuestos químicos sintéticos (xenobióticos) como los plaguicidas y herbi-cidas,
lo cual es de gran utilidad para el saneamiento del medio ambiente, pero
además, tiene un significado evolutivo, ya que estos compuestos no existían en
la Tierra hasta hace poco más de 50 años (Madigan et al. 1999).
Desde el punto de vista biotecnológico, además de la bioremediación,
se reconoce la importancia de los microorganismos marinos como potencia-les
productores de sustancias biológicamente activas para la industria médico-farmaceútica.
Los grupos de microorganismos más estudiados con estos fines
son las microalgas, las bacterias y los hongos marinos (Fenical y Jensen, 1993;
De la Rosa y Gamboa, 2003).
Existen numerosas publicaciones de diferentes autores que refieren la
detección de microorganismos productores de antibióticos, agentes antitumo-rales,
antivirales y enzimas (Atlas y Bartha, 2002; De la Rosa y Gamboa, 2003;
Nishihara et al. 2008), sin embargo, aún existen microorganismos que no cre-cen
en los medios de cultivo tradicionales, o después de crecer, pierden la ca-pacidad
de producir determinado compuesto. El hecho de que las condiciones
que prevalecen en el medio marino sean difíciles de reproducir en laboratorio
provoca que un elevadísimo porcentaje de estas bacterias (hasta un 99%) no
haya podido ser cultivado, y por tanto, se desconozca qué papel ecológico jue-gan
de manera individual.
Hoy en día es posible también abordar el estudio de la dinámica de un
ecosistema natural a nivel genómico. Mediante el análisis de los genomas com-

INTRODUCCIÓN
pletos se puede intentar reconstruir el funcionamiento de los microorganis-mos,
así como su potencial fisiológico y metabólico, y relacionarlo con los
compuestos existentes en el ambiente en el que se desarrollan (López y Zaba-llos,
Página 9
2005; Amann y Fuchs, 2008).
1.3. Características de los ecosistemas marinos.
Arrecifes coralinos.
Los arrecifes coralinos son estructuras geológicas sólidas, masivas, de
origen biológico, y con formas variadas, que cubren la matriz rocosa de algu-nos
fondos marinos tropicales y subtropicales. Éstos crecen hacia la superficie
y son creados por organismos fijos al fondo que forman esqueletos pétreos de
carbonato de calcio. En el Gran Caribe, los organismos fijos que los confor-man
son principalmente, los corales pétreos, las esponjas, los octocorales, las
ascidias y las algas, y los móviles, una rica fauna de peces e invertebrados.
Los arrecifes coralinos, además de una alta diversidad biológica, poseen
grandes valores naturales y socio-económicos. Tienen gran valor intrínseco
por su carácter único. A pesar de su muy limitada extensión sobre el océano,
los arrecifes coralinos albergan la cuarta parte de las especies marinas del mun-do
(Alcolado, 2006). Más del 25% de las capturas comerciales de los países
en desarrollo provienen de especies que habitan o guardan alguna relación de
dependencia con ese biotopo (Jameson et al. 1995).
Según Costanza et al. (1997) los arrecifes del mundo en conjunto pro-veen
bienes y servicios por valor de cerca de 375 000 millones de USD/año.
Spalding et al. (2001) estimaron un total mundial de 284 300 km2 de arrecifes,
por tanto, estas dos cifras arrojan un estimado grueso de ingresos de 1 319
millones de USD/año por km2 de arrecife (Alcolado 2006).
En los arrecifes habita una gran diversidad de microorganismos, vege-tales
e invertebrados portadores de sustancias biológicamente activas, que se
emplean o constituyen recursos potenciales como fármacos y reactivos de in-terés
bioquímico. Muchas de sus especies se utilizan para la elaboración de
objetos de artesanía y bisutería. Los arrecifes constituyen una de las principales
fábricas de la arena blanca que nutre las playas, principal recurso turístico de la
mayoría de los países caribeños. Sus barreras o crestas brindan protección a las
costas contra la erosión producida por el oleaje y también protegen poblados
y edificaciones de las costas.
Además de constituir un extraordinario atractivo para el turismo de bu-ceo,
los arrecifes coralinos poseen un gran valor educacional, científico y ético.
Según Alcolado (2006) también son indicadores de la calidad de las aguas
marinas y de los efectos de los cambios climáticos globales.

INTRODUCCIÓN 10 Sobre la diversidad de bacterias y hongos en arrecifes de coral, existe
escasa información, el mayor énfasis se ha puesto en el estudio del efecto de
los microorganismos sobre la “salud” de los arrecifes, ya que algunas enferme-dades
de los corales se han atribuido a la acción de microorganismos patógenos
específicos (Borneman, 2008).
Los fondos duros no arrecifales.
Los fondos duros no arrecifales se localizan en las macrolagunas, fuera
de las zonas pre-arrecifales y arrecifales. Se caracterizan por poseer básicamente
un fondo rocoso cubierto por una capa de arena predominantemente delgada o
localmente ausente, y a menudo, por parches de pastos marinos o de pequeños
depósitos de arena. Con frecuencia suelen presentar corales aislados, típica-mente
del género Solenastrea o pequeños cabezos coralinos y gorgóneas de los
géneros Pterogorgia y Pseudopterogorgia entre otros. Tiende a ser un biotopo
más bien mixto a manera de mosaico, lo que lo hace portador de una notable
diversidad de especies, en comparación con la que corresponde a los biotopos
componentes. A diferencia de los arrecifes sus aguas son menos transparentes
por la mayor concentración de fitoplancton. No deben confundirse con los
fondos de cabezos o de arrecifes de parche, ni con los que algunos denomi-nan
fondos duros no colonizados o “comunidades de corales”, ya que no son
arrecifes porque el cubrimiento de corales es inferior al 10%. Estos aparecen
comúnmente dentro del perfil de los arrecifes a poca profundidad (general-mente
a menos de 6 m de profundidad) y se corresponden con la terraza somera
o superior, conocida como zona de Pseudopterogorgia (Goreau, 1959), pavi-mento
rocoso o explanada abrasiva. También aparecen en bajos de muy escasa
profundidad formando crestas que actúan como rompientes.
Este biotopo sostiene una pesca que incluye esponjas, langostas y varias
especies de peces. Alberga especies de corales que son muy raras en los arreci-fes
coralinos. Algunos sitios pueden resultar de interés contemplativo para el
turismo de naturaleza y la recreación (Alcolado, 2006).
Fondos de sedimentos no consolidados.
Biotopo arenoso y de playa.
El biotopo arenoso o arenal puede ser: desde puramente arenoso hasta
areno-fangoso, según la proporción de fango o cieno (partículas más finas). Su
existencia se debe a la relativa inestabilidad producida por un fuerte hidrodina-mismo
(oleaje y corrientes) que limitan la deposición de sedimentos de fango o
cieno y de materia orgánica particulada, e impiden el desarrollo de yerbas ma-rinas.
En Cuba la composición de la arena tiende a estar dominada por restos
de algas calcáreas, de moluscos y de corales, aunque en lugares específicos está
compuesta mayormente por oolita (granos de arena casi esféricos que se forman
por deposición de carbonato de calcio bajo condiciones físicas específicas de tem-peratura,
salinidad, y pH).

INTRODUCCIÓN
Debido a su inestabilidad, este biotopo se caracteriza por su relativa-mente
baja diversidad de especies y poca productividad. En él pueden habi-tar
macroalgas (comúnmente algas verdes calcáreas como Halimeda, Penicillus,
Udotea, Rhipocephalus, etc.) o delgados tapices de microfitobentos. Ejemplos
de este tipo de fondo son las playas, médanos, bancos, depósitos en lechos
rocosos, cangilones de arrecifes y algunas terrazas arrecifales. Constituye un
hábitat de especies especializadas, brinda refugio y alimento a algunas especies
que se entierran en la arena (rayas, algunos peces teleósteos, poliquetos, holotu-rias,
etc.), proporciona arena para las playas y construcciones y contribuye a la
formación y mantenimiento de las dunas de las playas y las cuencas arenosas.
Biotopo fangoso.
Como su nombre lo indica, el fondo fangoso o fanguizal, está formado
por sedimentos en que predomina la fracción fangosa o cieno. De acuerdo a
la granulometría y la hidrodinámica local, los fangos pueden ser más o menos
blandos o compactos, llegando a ser casi “líquidos” cuando son pelíticos, es
decir, el diámetro promedio de las partículas es menor de 0.0625 mm. La falta
de luz, la sedimentación excesiva y la “liquidez” del fondo suelen ser las causas
que impiden el desarrollo de las yerbas marinas en ellos. Los fangos “líquidos”
son menos propicios para el desarrollo del bentos que los más compactos y es-tables.
Si bien su diversidad de especies es comparativamente baja, su produc-tividad
neta (explotable) puede ser localmente alta. Su ambiente como regla es
fluctuante e impredecible, y además se caracteriza por un régimen hidrodiná-mico
comparativamente débil. Es típico de ambientes eutrofizados y también,
de plataformas profundas protegidas, donde la luz que llega al fondo es insufi-ciente
para el desarrollo de pastos marinos. Como fauna típica pueden mencio-narse
camarones, telestáceos, algunas esponjas, erizos irregulares y peces.
Los fondos fangosos saludables son altamente productivos y constitu-yen
una fuente de importantes recursos pesqueros como camarones, moluscos
y peces. Este biotopo, mediante la descomposición de materia orgánica que
produce e importa, genera y exporta nutrientes a otros ecosistemas marinos
(Alcolado, 2006).
Pastos marinos (vegetación sumergida).
Los pastos marinos, conocidos como seibadales, son fondos de sedi-mentos
no consolidados con desarrollo de yerbas marinas (fanerógamas) y
algas. Las yerbas son principalmente Thalassia testudinum, Syringodium fi-liformis
y Halodule wrighti. En lugares afectados por altas salinidades o en
médanos muy bajos sometidos a altas temperaturas suele dominar H. wrighti.
Estos despliegan una alta productividad neta que es exportada a los arrecifes y
explotada por el hombre.
Página 11

INTRODUCCIÓN 12 Los pastos marinos son la principal vía de entrada de la energía que ga-rantiza
la productividad biológica y pesquera en la plataforma cubana y cons-tituyen
una fuerte reserva ecológica de materia y energía en forma de biomasa,
parte de la cual es exportada a los arrecifes y al océano lo que en cierta me-dida
aumenta la productividad de éstos biotopos. Se ha estimado el valor de
los bienes y servicios de los pastos marinos en unos 19 000 USD/ha año, to-mando
como referencia solamente su importancia en el reciclaje de nutrientes
(Constanza et al. 1997). También actúan como estabilizadores del fondo, pre-viniendo
su erosión y la afectación de los arrecifes y de las playas colindantes,
regulan la concentración de oxígeno y gas carbónico en el mar, y condicionan
fuertemente los procesos biogeoquímicos locales. Muchos pastos marinos son
formadores de gran parte de las arenas de las playas gracias al desarrollo de
algas calcáreas, principalmente Halimeda (Alcolado, 2006).
Las lagunas costeras y estuarios
Las lagunas costeras son cuerpos de agua relativamente pequeños, poco
profundos (menos de 2 m), con conexión limitada, permanente o temporal con
el mar. Poseen, en su mayoría, considerable aporte de agua dulce, sedimentos,
nutrientes y materia orgánica procedentes de tierra, lo que determina en parte
su alta productividad biológica, o en caso de exceso de los dos últimos, su
degradación. El sedimento principal es el fango o cieno de color oscuro, casi
siempre con penetrante olor a sulfuro de hidrógeno. Cerca de las desembo-caduras
puede haber sustrato rocoso a causa de las corrientes de marea que
impiden la acumulación de sedimentos. Se caracterizan por sufrir fluctuaciones
relativamente grandes en la salinidad y temperatura, y en muchos casos de la
propia biota. Generalmente, están bordeadas por bosques de mangle y pueden
abundar los pastos marinos sobre todo, hacia las orillas.
Las lagunas costeras constituyen el hábitat de diferentes fases de la vida
(larvas, juveniles y adultos) de muchos recursos pesqueros como camarones,
lisas, róbalos, corvinas, sábalos, ostiones, etc.. En ellas y su entorno suelen
habitar de forma permanente o temporal numerosas especies de aves y otros
organismos silvestres, algunos en peligro de extinción, como el manatí.
En cierta medida las lagunas costeras protegen a los ecosistemas ex-teriores
contra pulsos de excesivos nutrientes y de sedimentos suspendidos,
al retenerlos (efecto amortiguador). Muchas poseen gran valor paisajístico, re-creativo
y turístico. Las lagunas y estuarios son los ecosistemas marinos de
mayor productividad pesquera, y son zonas potenciales para el desarrollo del
maricultivo. Por otra parte, son áreas de reproducción y cría de camarones y de
otras especies comerciales (Alcolado 2006).

INTRODUCCIÓN
Manglares.
Se localizan en las costas de origen biológico, acumulativas, cenagosas
y en esteros con escurrimientos de agua dulce, aunque también en ambientes
salinos como por ejemplo, los cayos que bordean la plataforma submarina cu-bana,
muchos de ellos formados por los propios manglares.
En zonas con aportes de aguas dulces y nutrientes los bosques de man-gle
alcanzan 20-25 m de altura y una alta densidad, mientras que en aguas muy
saladas y pobres en nutrientes pueden ser de pequeña talla, achaparrados o
enanos. Los bosques de manglar pueden ser monodominantes o mixtos (Me-néndez-
Cabrera y Priego-Santander, 1994).
Asociados al bosque de manglar habita una rica fauna, destacándose las
aves endémicas o de hábitat reducidos, algunas de las cuales lo utilizan como
área de anidamiento y/o refugio, y muchas son migratorias.
Sobre las raíces de los mangles y alrededor de estos, habita una gran
diversidad de organismos, algunos de forma permanente (esponjas, ascidias, hi-drozoos,
anémonas, briosos, crustáceos, peces, etc.), otros de tránsito como peces
Página 13
en etapas juveniles y crustáceos.
Las raíces de los manglares sirven de sustrato a numerosos invertebrados
y peces. Entre los primeros prevalecen los crustáceos y moluscos. Además, se
fijan al mangle escaramujos, varias algas epífitas y esponjas que son hospederos
de numerosos organismos, como los ascidiáceos coloniales y los celenterados.
La composición de la ictiofauna del manglar depende de las caracterís-ticas
ambientales de cada sitio. Asociados a los manglares estuarinos prodo-minan
los peces típicos de las lagunas costeras: robalos (Centropomidae), mo-jarras
y pataos (Gerridae), lisas (Mugilidae), corvinas (Sciaenidae) y algunas
especies arrecifales altamente tolerantes a diferentes salinidades como algunos
pargos (Lutjanus griseus, L. apodus y L. jocu) o sus etapas juveniles. En los
manglares de los cayos, donde prevalecen aguas con salinidad y transparen-cia
más parecidas a las de los arrecifes coralinos, habitan peces típicos de ese
biotopo más algunas poco comunes en estos, como las sardinas (Clupeidae),
mojarras, pataos y otros.
Los manglares aportan energía al ecosistema acuático, mediante sus ho-jas,
ramas y raíces (y su microbiota asociada), las cuales pasan a formar parte
del detrito acumulado en los sedimentos. Las raíces de los mangles sirven de
refugio a las etapas juveniles de langostas y peces. La mayoría de los peces del
manglar forman parte de las pesquerías que se realizan en el complejo seibadal-arrecife.
En la parte aérea los manglares proveen madera, leña, carbón, taninos
para curtir pieles, y productos apícolas como miel, cera y propóleos. Además,

INTRODUCCIÓN 14 los manglares protegen las costas de la erosión provocada por el oleaje, el vien-to
y las corrientes costeras y filtran los contaminantes y los sedimentos evitan-do
que lleguen a los arrecifes coralinos y otros biotopos. De vital importancia
es la protección que brindan a la población e infraestructuras costeras contra
las violentas penetraciones del mar y el efecto de los huracanes.
Costa rocosa baja y costa acantilada.
La costa rocosa baja y la costa acantilada, por su constitución rocosa
predominantemente cársica, gozan de una gran solidez, aunque el batir cons-tante
del oleaje y el intemperismo tallan el complicado microrelieve (mezcla de
grietas, puntas y crestas afiladas, concavidades) y macrorelieve (cavernas, buza-mientos,
charcas, fracturas, desprendimientos, etc.) que los caracteriza.
El ambiente a que está sometida la biota en estos sitios es harto severo,
con una mezcla casi constante (pero con pulsos extremos de insolación, rocia-miento,
desecación, mareas, inundación, golpes de olas, lluvias, etc.). La flora
y la fauna, están generalmente distribuidas a manera de cinturones sucesivos
perpendiculares al gradiente de influencia marina y de la altura de la costa. En
estas costas son típicos los cangrejos grápsidos, gran diversidad de moluscos
como quitones, neritas, litorinas, siguas, mejillones, etc. Las algas en el estrato
más bañado por el mar son variadas y las especies dominantes dependen ma-yormente
del grado de eutrofización y agitación del agua, la estación del año,
y el régimen de desecación; este último determinado en gran medida por la in-clinación
y la distancia del sitio al nivel medio de las mareas. En los lugares con
aguas extremadamente eutrofizadas suelen ser abundantes las algas del género
Ulva. En las charcas suelen estar presentes de manera casi siempre temporal
peces clínidos, eleótridos, góbidos y ciprinodontidos. Estos últimos son peces
de agua dulce, algunas de cuyas especies resisten altas salinidades (Alcolado
2006).

INTRODUCCIÓN
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Página 17

Capítulo 2
Técnicas de Bacteriología

TÉCNICAS DE BACTERIOLOGÍA
Página 21
2.1. Enumeración de bacterias heterótrofas aerobias mesófilas
Dentro de las comunidades microbianas las bacterias heterótrofas cons-tituyen,
después de los virus, la población más numerosa (Marie et al. 1999)
en los ecosistemas acuáticos. Este grupo de bacterias comprende una amplia
diversidad de géneros y en términos numéricos de abundancia, constituyen el
componente biológico más importante involucrado en la transformación y mi-neralización
de la materia orgánica en la biosfera (Cho y Azam, 1988), ya que
controlan los flujos de nutrientes en el sistema a través de la mineralización de
la materia orgánica (Schut et al. 1997) y la producción secundaria de carbono
(Azam et al. 1983). Además, son capaces de utilizar la materia orgánica disuelta
(MOD) que deriva de los organismos autótrofos y de la actividad metabólica
de otros organismos heterótrofos de mayores dimensiones presentes en el am-biente
pelágico (López y Zaballos, 2005).
Las bacterias heterótrofas contribuyen a los ciclos de carbono y nu-trientes
por dos vías principales: a través de la producción de biomasa bac-teriana
(producción secundaria) y mediante la remineralización del carbono
orgánico y los nutrientes (del Giorgio y Cole, 1998).
Objetivo: Determinar la concentración de bacterias heterótrofas aero-bias
mesófilas en muestras de agua y sedimentos marinos.
Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados.
Materiales.
Erlenmeyers.
Frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad.
Pipetas de 10 y de 1 mL.
Tubos de ensayo con tapones de algodón.
Gradillas.
Placas Petri.
Espátulas de vidrio estériles.
Tubo plástico para la toma de muestra de sedimento (“corer”).
Jeringuilla despuntada.
Papel de pH.
Reactivos y medios de cultivo.
Soluciones para ajustar el pH del medio.
Buffer Fosfato.
Medio 2216E para bacterias marinas (Oppenheimer y ZoBell, 1952).

22
Equipos.
Autoclave.
Baño termostatado.
Incubadora bacteriológica.
Detalles experimentales.
Para el recuento y aislamiento de bacterias heterótrofas se pueden uti-lizar
varios medios de cultivo: 2216E (Oppenheimer y ZoBell, 1952), Medio 6
(Gorbienko, 1961), Agar marino, etc. Actualmente se considera que el Agar
marino comercial desarrollado a partir de Oppenheimer y ZoBell, (1952) está
muy cargado en nutrientes e inhibe el crecimiento de bacterias oligotróficas,
por lo que se han desarrollado una variedad de medios con bajas concentracio-nes
de nutrientes para aislar este tipo de bacterias (Weiner et al. 1980; Austing
y Allen, 1982).
En la preparación del medio de cultivo cuando se va a trabajar con
muestras de aguas marinas se puede emplear agua de mar sin diluir (salinidad
promedio entre 32 y 35 °/oo), o diluida con agua corriente (750 mL agua de mar
y 250 mL de agua corriente), en dependencia de la salinidad del lugar de aisla-miento.
Cuando se trata de bacterias aisladas de aguas interiores (lagos, ríos,
subterráneas), se puede utilizar agua destilada o agua corriente.
Después de esterilizar el medio a 121°C 15 min el pH debe ajustarse
hasta 7.0-7.2 para el caso de siembra de muestras marinas, y hasta 6.9 para
muestras de aguas interiores.
Cuando se siembra una porción o dilución de la muestra por vertido en
placa (“pour plates”) se debe tener en cuenta que el medio de cultivo tenga la
temperatura apropiada (entre 42°C y 45°C) para evitar la muerte de las células
por exceso de temperatura. Cuando la temperatura del medio al verterlo en
las placas es superior a 50°C generalmente el vapor de agua que desprende se
condensa en la tapa de la caja Petri y si no se elimina esta agua puede causar un
crecimiento continuo o mezclado de colonias sobre el medio, lo que impide el
recuento de colonias individuales y/o el aislamiento de cultivos puros (Schnei-der
y Rheinheimer, 1988).
Si se emplea el método de siembra en superficie (“spread plates”) se vier-te
el agar en las placas y se deja secar en una estufa a 45°C toda la noche antes
de usarlas. Posteriormente, se extiende por toda la superficie del medio un
volumen no mayor a 0.1 mL de la dilución apropiada, utilizando una espátula
de vidrio estéril. La placa se incuba hasta que aparezcan las colonias.

Procedimiento.
Muestras de agua de mar.
Método de siembra por vertido en placa (“pour plates”).
Las muestras de agua se colectan preferiblemente por triplicado utili-zando
frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad.
A partir de cada muestra de agua se hacen las diluciones a conveniencia,
Página 23
según el tipo de agua (Tabla 2), en agua de mar estéril.
Tabla 2. Diluciones recomendadas según el tipo de muestra
Tipo de muestra Diluciones
Aguas superficiales limpias 10-1, 10-2, 10-3, 10-4
Aguas moderadamente contami-nadas
o aguas residuales tratadas 10-2, 10-3, 10-4, 10-5
Aguas contaminadas o aguas re-siduales
sin tratamiento 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
Nota: Dilución 10-1 es igual a 1/10, es decir, 1 mL de muestra en 9 mL
de diluyente (agua de mar estéril, en este caso), dilución 10-2 es igual a 1/100, es
decir, 1 mL de muestra en 99 mL de diluyente, y así sucesivamente.
De cada muestra o dilución se vierte 1 mL en placas Petri (Colwell y
Grigorova, 1986). Seguidamente, se añaden de 12 a 15 mL del Medio 2216E
para bacterias marinas heterótrofas (Oppenheimer y ZoBell, 1952) previamente
fundido y mantenido en un baño de María a una temperatura de 43-45°C.
Se mezcla los volúmenes de muestra (o dilución) añadidos con el medio
de cultivo mediante movimientos suaves y rotatorios de la placa, y se deja soli-dificar.
Se debe preparar una placa “control” conteniendo únicamente el medio
de cultivo y una segunda placa “control” conteniendo el medio de cultivo y el
agua de dilución.
Las placas se incuban a la temperatura seleccionada, teniendo en cuenta
el rango óptimo de temperatura para el crecimiento de bacterias mesófilas (en-tre
25 y 40°C) y la temperatura del agua en el lugar donde se tomó la muestra,
y se realiza el conteo de colonias a las 24, 48 y 72 h de incubación con ayuda de
un contador de colonias o empleado un microscopio estereoscópico.
Se recomienda contar las colonias en las placas que presenten entre 30 y
300 colonias, excepto en el caso de que el medio inoculado con 1 mL de agua
no diluida contenga menos de 30 colonias.

24
Si el conteo no se realiza inmediatamente después del tiempo de incu-bación,
las placas se pueden conservar en refrigeración hasta que se efectúe el
conteo siempre que este período no exceda las 24 h.
Método de siembra en superficie (“spread plate”).
Si la siembra es “en superficie” se vierte 0.1 mL de la muestra, o de la
dilución, sobre el medio ya solidificado y se riega sobre la superficie con la
ayuda de una espátula de vidrio estéril (espátula Drygalski). Es importante que
la superficie esté bien seca para que el líquido que se extiende por la superficie
empape rápidamente el medio. Durante esta operación, debe tenerse cuidado
de no romper la superficie del agar.
Muestras de sedimentos.
Los sedimentos se colectan con un tubo plástico o “corer”, si hay interés
en seleccionar una profundidad específica, o directamente de la capa superfi-cial,
se pueden emplear frascos de vidrio estériles de 50 mL de capacidad. De
cada muestra se toma 1 cm3 con una jeringuilla despuntada estéril y se añade a
un tubo conteniendo 10 mL de agua de mar estéril o Buffer Fosfato. Se agita
por unos minutos el tubo en un “vortex” para propiciar la separación de las
células de las partículas de sedimento y se deja reposar por 2 o 3 min. También
se puede emplear ultrasonido para la separación de las células adheridas a las
partículas (Torreton, 1991). A partir del sobrenadante se hacen diluciones se-riadas
en agua de mar estéril o Buffer Fosfato, hasta 10-6 u otra dilución mayor
si se cree conveniente, y se procede igual que se describió para la siembra de
muestras de agua anteriormente.
Conteo y cálculos.
El número de colonias obtenido en un conteo de viables depende no
sólo del tamaño del inóculo, sino también del medio de cultivo empleado, la
temperatura y el tiempo de incubación. No todas las células desarrollarán las
colonias al mismo tiempo ni del mismo tamaño, por lo que deben establecerse
bien estos requisitos para evitar errores. El conteo de viables se expresa como
“unidades formadoras de colonias”, en lugar de células viables, ya que una uni-dad
de colonia puede contener más de una célula.
Para el cálculo del número de unidades formadoras de colonia por mi-lilitro,
se cuentan las colonias crecidas en las placas, se calcula la media arit-mética
entre las réplicas y se multiplica el promedio del número de colonias
por el reciproco de la dilución usada. Los resultados se reportan en Unidades
Formadoras de Colonias por mililitros (UFC/mL) para las muestras de agua.

En el caso de las muestras de sedimentos se puede dar el re-sultado
en UFC/g de peso húmedo o de peso seco, para lo cual:
Página 25
1g
UFC/g (peso seco) = UFC/g (peso húmedo) x -------------------------------
Peso seco de la muestra (g)
El procedimiento habitual es determinar el peso seco después de secar
las muestras durante una noche a 90 - 110°C. La masa seca de las células bacte-rianas
es aproximadamente, entre el 10 y el 20% de la masa húmeda.

26
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2.2. Enumeración de bacterias sulfatoreductoras
28
Las bacterias sulfatoreductoras (BSR) son una de las formas de vida
mas antigüas del planeta, datan de al menos 2.72 mil millones de años (NAI,
2003). Constituyen un grupo diverso de bacterias con capacidades metabólicas
diferentes, agrupadas por la característica común que tienen de usar el sulfato
como aceptor terminal de electrones durante la respiración anaerobia.
Las BSR son anaerobias y requieren un potencial redox bajo (alrede-dor
de -100 mV), para poder crecer. Sin embargo, el hecho de poseer enzimas
como la superoxido dismutasa y la catalasa les permite sobrevivir en agua de
mar oxigenada hasta niveles de tolerancia específicos de cada cepa (Cypionka
et al. 1985).
La ubicuidad de las BSR en el agua de mar ha producido problemas de
corrosión, toxicidad y pérdidas en las industrias del petróleo y gas donde se
utilizan grandes volúmenes de agua de mar como lastre y para el mantenimien-to
de la presión (Battersby et al. 1985).
Las BSR son abundantes en fondos fangosos con o sin vegetación (Smi-th
et al. 2004), siendo mas activas en los 20 cm superiores de los sedimentos
costeros donde hay abundantes sulfatos y condiciones reducidas de poten-cial
redox. Generalmente, en estos sedimentos los sulfatos no son limitantes
(aproximadamente, >2mM SO4
2-), por tanto, predomina la respiración anaero-bia
mediante sulfatos como aceptor de electrones, pudiendo llegar a represen-tar
el 50% de la mineralización de carbono orgánico.
Las BSR juegan un papel importante en el ciclo del azufre en el océano
removiendo la mayor parte del sulfato (aproximadamente 1011 kg) que llega
al mar cada año por el aporte de los ríos debido al escurrimiento terrígeno
(Battersby, 1988).
Objetivo: Determinar el número de bacterias sulfatoreductoras en
muestras de aguas y sedimentos marinos por el método de Número Más Pro-bable.
Materiales, reactivos, medio de cultivo y equipos empleados.
Materiales.
Frascos de vidrio de 150 mL de capacidad.
Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad.
Pipetas estériles de 10 y 1 mL.
Tubos con tapas de rosca.

Reactivos y medio de cultivo.
Buffer Fosfato.
Medio API (Overzil, 1970).
Equipos.
Jarra mezcladora estéril.
Zaranda.
La mayoría de las BSR crece bien a temperaturas entre 25 y 35°C, aunque
usualmente se cultivan a una temperatura de incubación de 30°C. El sustrato es
el factor selectivo determinante para el crecimiento de un tipo u otro de BSR
procedente de aguas marinas o de otro medio en particular, por tanto, existen
varios medios de cultivos recomendados para los diferentes tipos de BSR.
En este acápite se utiliza el medio API (American Petroleum Institute)
recomendado por Overzil, (1970), y se emplea la metodología de diluciones se-riadas
en tubos múltiples para determinar el Número Mas Probable (NMP).
Procedimiento.
Se inoculan 10, 1 y 0.1 mL de la muestra de agua de mar en series de
cinco tubos estériles y posteriormente, se le añade 10 mL de medio API a la
primera serie de cinco tubos (muestra sin diluir) y 9 mL a las series siguientes
de tubos (diluciones 1/10 y 1/100, respectivamente). Se cierra cada tubo con
tapa de rosca y después de rotularlos convenientemente, se incuban a 30°C de
2 a 4 semanas. Debe prepararse un tubo “control” sin inóculo. Se consideran
positivos aquellos tubos donde ocurre un cambio de color de rojo a negro.
En el caso de que sean muestras de sedimento, se toman 50g de muestra
del horizonte seleccionado, y se suspenden en 450 mL de agua de mar estéril
o en Buffer Fosfato. Se homogenizan en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2
min, o en zaranda por 15 min, obteniéndose de esta forma la dilución 1:10. A
partir de esta dilución, se preparan las restantes diluciones decimales: se toma
1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a un tubo que contiene 9 mL de agua de
mar estéril o Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido obteniéndose así la
dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones se seguirá el mismo
procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para cada dilución.
Posteriormente, se inoculan series de 5 tubos y se rellenan con medio
API. Los primeros 5 tubos inoculados con 10 mL de la dilución 1:10 se les
añaden 10 mL de medio API y constituyen las porciones de 1g. Se tomarán
5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos a
los cuales se les añaden 10 mL de medio API, éstos constituyen las porciones
de 0.1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución 1:100, 1:1000,
1:10000, así sucesivamente, hasta la última dilución empleada y se inocularán
en tubos que se llenan con el medio API, éstos constituyen las porciones de
0.01g, 0.001g, 0.0001g y demás respectivamente. Se incuban los tubos a 30°C
Página 29

de 2 a 4 semanas y al igual que en el caso de las muestras de agua, un cambio de
coloración del medio de rojo a negro se considera positivo.
30
Conteo y cálculos
La densidad de bacterias sulfatoreductoras en las muestras de agua se
expresa como el NMP de BSR por 100 mL de muestra, y en el caso de los
sedimentos, se puede expresar NMP de BSR/ 100g de peso seco o por gramo
de peso húmedo.
La Tabla de NMP también puede ser utilizada cuando volúmenes ma-yores
y menores de la muestra son inoculados. En este caso se procesa un
código formado por los números de tubos con resultados positivos para BSR
obtenidos en las tres series consecutivas inoculadas, verificándose el valor de
NMP correspondiente a el.
Para el cálculo del NMP de bacterias sulfatoreductoras en los sedimen-tos,
el NMP/100g será dada a través de la siguiente fórmula:
NMP correspondiente al código x 10
NMP/100g (peso seco)= -----------------------------------------------------
Mayor vol. inoculado seleccionado
para conformar el código
Ejemplo:
Porciones
en los tubos
inoculados
A B C D E NMP del
Código 530 Cálculo NMP/100g
1g
0.1g
0.01g
+ + + + + 5
+ + + - - 3
- - - - - 0
80 80x10/1 = 800
+ : tubos con cambio de color de rojo a negro
- : tubos que no muestran cambio de color del medio
NMP/100g (peso húmedo) = 800.
NMP/ g (peso húmedo) = 8.
Resultado del peso seco obtenido = 0.4g
1g (peso seco)
NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x -----------------------
Peso seco (g)
Por tanto:
NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g
En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se
expresará como <0.2.

Página 31
BIBLIOGRAFIA
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in seagrass bed sediments. Aquatic microbial ecology, 37, 183-195.

2.3. Enumeración de bacterias coliformes totales y fecales.
32
Las bacterias coliformes son un grupo grande y heterogéneo de bacilos
gram negativos, anaerobios facultativos y asporógenos que pertenecen a la fa-milia
Enterobacteriaceae. Son bacilos cortos que pueden formar cadenas y en
condiciones de cultivo desfavorables (por ejemplo, exposición a la penicilina)
aparecen formas filamentosas largas. Dentro de los coliformes se agrupan: Es-cherichia
coli, Klebsiella y Enterobacter. Actualmente dicha agrupación inclu-ye
a los integrantes llamados organismos paracólicos: Serratia, Edwarsiella y
Citrobacter, aunque algunos autores incluyen también Arizona y Providencia
(Rojas y Coto 1989).
Las bacterias coliformes constituyen una gran parte de la microbiota
normal aerobia del intestino, dentro de él, estos microorganismos por lo gene-ral
no provocan enfermedades y pueden incluso contribuir al funcionamiento
normal y a la nutrición. Estas bacterias se transforman en patógenas cuando
alcanzan tejidos fuera del intestino, particularmente las vías urinarias, las vías
biliares, los pulmones, el peritoneo o las meninges, provocando inflamaciones
en estos sitios (Jawetz, 1985).
En las aguas la presencia de coliformes totales funciona como una alerta
de que ocurrió contaminación, sin identificar el origen. Indican que hubo fallas
en el tratamiento, en la distribución o en las propias fuentes domiciliarias de
agua. Su presencia acciona los mecanismos de control de calidad y de procesa-miento
dentro de las plantas de tratamientos de agua, e intensifica la vigilancia
en las redes de distribución (CYTED, 2002).
Por otra parte, los coliformes fecales, cumplen todos los criterios usa-dos
para definir los coliformes totales, pero en adición, estos son capaces de
crecer y fermentar la lactosa con producción de ácido y gas a 44 ± 0.2°C en las
primeras 48 h de incubación. Por esta razón, algunos especialistas consideran
que el término de coliformes «fecales» que se les aplica no es correcto y que
debería utilizarse en su lugar «coliformes termotolerantes» (ISO, 1990).
Aproximadamente el 95% del grupo de los coliformes presentes en he-ces
fecales, están formados por Escherichia coli y ciertas especies del género
Klebsiella. Debido a que los coliformes fecales se encuentran casi exclusiva-mente
en las heces de animales de sangre caliente, se considera que reflejan
mejor la presencia de contaminación fecal (WHO, 1999; CYTED, 2002).
Cuando están suficientemente diluidas en una gran masa de agua las
bacterias coliformes fecales sobreviven sólo por lapsos cortos de tiempo, por
lo que su presencia puede tomarse, por lo general, como evidencia de con-taminación
reciente. Sin embargo, en algunos ríos y puertos que están muy

contaminados con las aguas del desagüe urbano, las bacterias coliformes no
sólo sobreviven, sino que mantienen una población significativa mediante mul-tiplicación
Página 33
lenta a partir de substancias orgánicas (Jawetz, 1985).
En la actualidad muchos países consideran las bacterias coliformes
como indicadores de la calidad higiénico sanitaria en las aguas costeras que se
usan para el baño, aunque las concentraciones permisibles para estos microor-ganismos
varían ligeramente de un lugar a otro (Norma cubana NC: 22-1999;
Norma mexicana, 2004).
Objetivo: Determinar el número de bacterias coliformes totales y fe-cales
en muestras de agua y sedimentos marinos por el método de diluciones
seriadas en Tubos Múltiples.
Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados.
Materiales.
Frascos de vidrio de 250 mL de capacidad estériles.
Frascos de vidrio de 50 mL de capacidad estériles.
Pipetas de 10 y 1 mL estériles.
Tubos de cultivo con tapón de algodón.
Tubos Durham.
Gradillas.
Reactivos y Medios de Cultivo.
Agua de mar estéril, solución salina o agua peptonada.
Buffer Fosfato.
Caldo Lactosado (Lactose Lauryl Tryptose Broth).
Caldo Bilis Verde Brillante (Brilliant Green Lactose Broth).
Caldo EC (EC Broth).
Equipos
Jarra mezcladora,
Baño termostatado,
Incubadora bacteriológica,
Este procedimiento se puede aplicar para muestras de agua de diferentes
fuentes: marinas, riverinas, potables, residuales, entre otras.
Se utiliza el método de Tubos Múltiples mediante siembra en medio
líquido y el cálculo del Número Más probable (NMP). El método se basa en
el enriquecimiento de las muestras de agua en Caldo Lactosado, al cual se ha
añadido un indicador de pH, a una temperatura de 35 ± 2°C, donde el cambio

de color del medio evidencia la presencia de microorganismos del grupo coli-formes.
34
Este primer paso se conoce como “prueba presuntiva”. Posteriormen-te,
se hace una “prueba confirmativa” de la presencia de coliformes mediante
la siembra de una asada tomada de los tubos que dieron positivos en la prueba
anterior, en tubos con Caldo Bilis Verde Brillante. La turbidez y presencia de
gas confirma la existencia de coliformes totales en la muestra analizada (Gon-zález
et al. 2000).
Actualmente, para detectar la presencia de coliformes existen algunos
ensayos menos complejos que permiten obtener los resultados más rápidos,
pero sólo puede considerarse una información preliminar (presencia-ausencia).
En estas pruebas, se mezcla grandes volúmenes de muestra de agua (100 mL) en
una botella de cultivo con Caldo Lactosa Lauril Triptosa (LLTB) triple fuerza.
Como indicador de pH se añade bromocresol púrpura. Si los coliformes están
presentes, fermentan la lactosa produciendo ácido y gas y cambiando de color
el medio de púrpura a amarillo. Para detectar coliformes y Escherichia coli,
puede usarse la prueba del Colilert que consiste en mezclar 100 mL de muestra
de agua con un medio que contiene como únicos nutrientes orto-nitrofenil-
β,D-galactosido (ONPG) y 4-metil umbeliferil-β,D-glucoronido (MUG). Si
los coliformes están presentes, el ONPG es metabolizado, resultando un color
amarillo. Si hay presencia de E. coli, será degradado el MUG a un producto
fluorescente que puede detectarse por observación en luz UV de larga longitud
de onda.
Procedimiento
Determinación del Número Más Probable de Coliformes totales en mues-tras
de agua por el método de diluciones seriadas en tubos múltiples.
Preparación de las diluciones decimales.
Las diluciones se harán en dependencia del tipo de agua a analizar.
Tabla 3. Diluciones recomendadas según el tipo de agua a analizar
Tipo de muestra Diluciones
Aguas superficiales limpias 100,10-1, 10-2, 10-3, 10-4
Aguas moderadamente contami-nadas
o aguas residuales tratadas 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6
Aguas contaminadas o aguas re-siduales
sin tratamiento 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7
Se toma asépticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un
tubo de ensayo con 9 mL de agua de mar estéril, solución salina o agua pepto-nada,
obteniéndose una dilución de 1:10. Se homogeniza, se toma 1 mL y se
lleva a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solución de la dilución, se homo-geniza,
y se obtiene una dilución 1:100. De ser necesarias más diluciones se
seguirá el mismo procedimiento (Se utilizará una pipeta para cada dilución).

Prueba presuntiva.
Se toman 10 mL de muestra empleando una pipeta estéril graduada de
10 mL y se transfieren a un tubo de ensayo que contenga 10 mL de Caldo
Lactosado de doble concentración y se mezcla el contenido. Se repite cinco
veces este procedimiento.
Para agua de mar se realiza además lo siguiente: se toman 5 mL de agua
y se añade 1 mL en cada uno de los tubos con medio a simple concentración
de la segunda hilera y se toman 0.5 mL de muestra y se añade 0.1 mL en cada
tubo de la tercera hilera con medio Caldo Lactosado de simple concentración.
Cuando se analiza agua no tratada, se inoculan porciones de la muestra y sus
diluciones respectivas.
Se incuban los tubos entre 35 ± 0.5°C durante 24 - 48 h. Al cabo de
24 h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido algún cambio de
color y turbidez, se reincuban y se examinan nuevamente después de otras 24
h (48 en total).
La producción de ácido o gas dentro de las 48 ± 3 h constituye una re-acción
presuntiva positiva y la ausencia de formación de ácido o gas al finalizar
Página 35
las 48 ± 3 h constituye una prueba negativa.
Prueba confirmativa.
A partir de cada uno de los tubos presumiblemente positivo en Caldo
Lactosado, se inoculan con un asa de platino tubos que contengan Caldo Bilis
Verde Brillante y tubos de fermentación Durham invertidos. Se incuban de 35
± 0.5°C por 48 h y se observa la producción de gas. La producción de gas
en cualquier cantidad en el tubo invertido Durham dentro de las 48 ± 3 h es
considerada una fase confirmativa positiva.
Recomendaciones importantes.
• 1. Utilice una pipeta estéril para la inoculación de cada tubo. Si
la pipeta se contamina antes de que la transferencia se haya com-pletado,
reemplace con otra pipeta estéril. Tome precauciones
cuando retire la pipeta del pipetero, para evitar contaminaciones.
No arrastre la punta de la pipeta sobre la parte final expuesta de
las otras pipetas del pipetero o sobre los bordes y cuellos de los
tubos de la dilución. Cuando remueva la muestra, no inserte las
pipetas mas de 2.5 cm por debajo de la superficie de la muestra.
• 2. Cuando descargue las porciones de muestra, sostenga la pi-peta
en un ángulo de aproximadamente 4°C, con la punta tocan-do
el cuello del tubo de ensayo.
• 3. En el examen de residuales o de agua turbia, utilice un inocu-lo
de 0.1 mL de la muestra original o prepare una dilución ade-cuada.

36
• 4. Límite del número de muestras a ser analizadas de forma
tal, que el tiempo entre la inoculación de la primera muestra y la
última no excedan los 20 min (Preferiblemente 10 min).
Determinación del Número Más Probable de Coliformes fecales.
A partir de cada uno de los tubos gas positivos en Caldo Bilis Verde
Brillante, se inoculan con un asa tubos que contengan caldo EC y tubos de
fermentación Durham. Se incubaran a 44.5 + 0.1°C durante 24 - 48 h. Antes de
la inoculación los tubos se mantendrán sumergidos, a un nivel por encima del
medio de cultivo, en un baño termostatado a 44.5 oC durante 30 min.
La producción de gas en un tubo de fermentación Durham dentro de 24
h o menos se considera una reacción positiva.
Cálculos y expresión de los resultados.
La densidad de coliformes (totales y fecales) se expresa como el NMP de
coliformes totales o fecales, según se trate, por 100 mL de la muestra de agua.
Para formar el código se seleccionan las diluciones según los números
de tubos positivos y negativos obtenidos en las tres series de diluciones con-secutivas
inoculadas.
El NMP/100 mL de agua se obtendrá a través de la siguiente fórmula:
NMP correspondiente al código de la tabla x 10
NMP/100 mL = ------------------------------------------------------------------
Mayor volumen inoculado seleccionado
para formar el código
Ejemplo 1:
Volúmenes
de agua
inoculados
Tubos
Cálculo
A B C D E Código NMP NMP/100mL
1mL
0.1mL
0.01mL
+ + + + + 5
+ + - - - 2
- - - - - 0
520 50 50x10/1 = 500
Se selecciona la serie donde los tubos sean positivos en su mayoría y las
dos diluciones siguientes para formar el código.

A B C D E Código NMP Cálculo
NMP/100mL
Página 37
Ejemplo2:
Volúmenes
de agua
inoculados
Tubos
10 mL
1 mL
0.1 mL
0.01 mL
+ + + + + 5
+ + + - - 3
+ - - - - 1
+ - - - - 1
532 140 140x10/10
= 140
}2
En este ejemplo el resultado positivo de la última dilución se adiciona al
de la serie anterior para formar el código.
Determinación de Coliformes totales y fecales en muestras de sedimentos
Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homo-genizan
en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min,
obteniéndose de esta forma la dilución 1:10.
Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de
contaminación de la muestra. Se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a
un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido
obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones
se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para
cada dilución.
Prueba presuntiva.
Se inoculan series de cinco tubos (a, b, c, d, e) de Caldo Lactosado con
tubos de fermentación de Durham invertidos. Los primeros 5 tubos inocula-dos
con 10 mL de la dilución 1:10 contienen 10 mL de Caldo Lactosado de
doble concentración y constituyen las porciones de 1g. Se tomarán 5 alícuotas
de 1 mL cada una de la dilución 1:10 y se inocularan en 5 tubos que contie-nen
10 mL de Caldo Lactosado de simple concentración, éstos constituyen
las porciones de 0.1g. Se tomarán 5 alícuotas de 1 mL cada una de la dilución
1:100, 1:1000, 1:10000, así sucesivamente hasta la última dilución empleada y
se inocularán respectivamente en tubos con Caldo Lactosado de simple con-centración
y con tubos de Durham invertidos, éstos constituyen las porciones
de 0.01g, 0.001g, 0.0001g y demás respectivamente.
Se incuba a 35 ± 0.5°C. Después de 24 ± 2 h se observará si hay pre-sencia
de ácido o gas en los tubos invertidos, si no hay, se reincuban hasta las
48 ± 3 h.
La producción de ácido o gas dentro de las 48 ± 3 h constituye una re-acción
presuntiva positiva y la ausencia de formación de ácido o gas al finalizar
las 48 ± 3 h constituye una prueba negativa.

38
Prueba confirmativa
De todos los tubos que resultaron positivos en la fase presuntiva se
toma muestra con asa de platino y se inoculan tubos conteniendo Caldo Bilis
Verde Brillante. Se incuban los tubos a 35 ± 0.5°C por 48 ± 3 h.
La producción de gas en cualquier cantidad en el tubo invertido de Cal-do
Bilis Verde Brillante dentro de las 48 ± 3 h es considerada una fase confir-mativa
positiva.
Se calcula el valor NMP del número de tubos positivos de Caldo Bilis
Verde Brillante.
Cálculos y expresión de los resultados
La densidad de coliformes totales se expresa como el NMP de colifor-mes
totales por g de peso seco.
NMP correspondiente al código x 10
NMP/100g (peso seco) = ------------------------------------------------------
Mayor volumen inoculado seleccionado
para conformar el código
Ejemplo 1:
Volúmenes
de agua
inoculados
Tubos
Cálculo
A B C D E Código NMP NMP/100g
1g
0.1g
0.01g
+ + + + + 5
+ + + - - 3
- - - - - 0
530 80 80x10/1 = 800
+ presencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante
- ausencia de gas en Caldo Bilis Verde Brillante
NMP/100g (peso húmedo) = 800
NMP/ g (peso húmedo) = 8
Resultado del peso seco obtenido (ejemplo) = 0.4g
1g (peso seco)
NMP/g (peso seco) = NMP/g (peso húmedo) x -----------------------
Peso seco (g)
Por tanto:
NMP/g (peso seco) = 8 x 1g/ 0.4 = 20 NMP/g
En los casos considerados como negativos (código 000) el resultado se
expresará como <0.2.

Página 39
BIBLIOGRAFIA
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Approach (The “Annapolis Protocol”). Protection of the Human Environ-ment
Water, Sanitation and Health Series. Geneva. 50 pp.

2.4. Enumeración de estreptococos fecales.
40
Los estreptococos fecales son cocos Gram positivos, no móviles, cata-lasa
negativa, anaerobios facultativos que se agrupan en cadenas cortas, pares y
células simples. Pueden crecer en presencia de sales biliares, en concentracio-nes
de azida de sodio inhibitorias para organismos coliformes y otras bacterias
Gram negativas y a temperatura de 45 °C. Hidrolizan la esculina y algunas
especies resisten calentamiento a 60 °C por 30 min, crecen en Caldo Nutriente
conteniendo 6.5% de cloruro de sodio y a pH 9.6.
El hábitat de los estreptococos fecales es el intestino de humanos y
muchos animales de sangre caliente, aunque con frecuencia se encuentran en
infecciones urinarias, leche, productos lácteos, carnes, aguas y suelos (Suárez,
2002).
Aunque este grupo de microorganismos ha sido utilizado por las au-toridades
sanitarias de diferentes países para evaluar la calidad sanitaria de sus
aguas costeras, en los últimos años se ha incrementado la utilización de los
enterococos fecales en lugar de los estreptococos (Secretaria de Salud, 2004).
Los enterococos fecales son un subgrupo de los estreptococos fecales,
que generalmente se usa para referirse a las especies Enterococcus faecalis y sus
variedades, y a E. faecium, las cuales tienen mucha importancia clínica. Según
Suárez (2002) se ha propuesto que sea adoptado el término “enterococos y es-treptococos
intestinales”, ya que las especies de origen fecal o intestinal pertene-cen
principalmente a los géneros Enterococcus y Streptococcus.
Para la detección y enumeración de estos microorganismos se utiliza el
método de Tubos Múltiples mediante siembra en medio líquido y el cálculo del
Número Más Probable (NMP), aunque también puede emplearse la técnica de
Filtro de Membrana y por vertido en placa, en dependencia del tipo de muestra
a analizar.
Tejedor et al. (2005) incuban las membranas en Agar Slanetz a 37 °C
por 24 h, las transfieren a placas de Agar Bilis-Esculina-Azida e incuban a 35
°C entre 1 y 4 h. Las colonias crecidas formadas por cocos gram positivos,
catalasa negativos y que hidrolizan la esculina, los consideran estreptococos
fecales.
El método de Tubos Múltiples se basa en el enriquecimiento de las mues-tras
de agua en Caldo Azida-Dextrosa donde el cambio de color del medio de
púrpura a amarillo evidencia la presencia de este tipo de microorganismo.

Objetivo: Determinar el número de estreptococos fecales en muestras
de agua y sedimentos marinos por el método de diluciones seriadas en Tubos
Múltiples.
Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos empleados
Materiales.
Frascos de vidrio estériles de 250 mL .
Tubos de ensayo.
Gradillas.
Pipeta de 10 mL.
Pipeta de 0.1 mL.
Placas Petri.
Caldo Azida-Dextrosa a doble concentración.
Caldo Azida-Dextrosa a simple concentración.
Buffer Fosfato.
Caldo KF 1.5 concentrado y de simple concentración.
Agar Tristona Soya (ATS).
Caldo Etil Violeta Azida o Medio selectivo para enterococos Pfizer -
(PSE).
Agar Slanetz-Bartley .
Caldo Corazón.
Equipos.
Procedimiento .
Colecta de las muestras de aguas.
La colecta de las muestras de aguas se debe realizar con frascos de vidrio
estériles, preferiblemente durante el horario de marea baja. Si no se procesa
inmediatamente, la muestra deberá permanecer refrigerada (sin llegar nunca a
la congelación) hasta el momento de su procesamiento. El análisis debe reali-zarse
tan pronto como sea posible, para minimizar los cambios en la población
microbiana y si la muestra ha sido mantenida en frío, el tiempo máximo reco-mendado
Página 41
es de 24 h.
Determinación del Número Más Probable de estreptococos fecales en
muestras de aguas marinas.
Se toma asépticamente 1 mL de la muestra de agua y se transfiere a un
tubo de ensayo con 9 mL de solución salina, agua de mar estéril o agua pepto-

nada, obteniéndose una dilución 1:10. Se homogeniza, se toma 1 mL y se añade
a otro tubo de ensayo con 9 mL de la solución de disolución, se homogeniza,
y se obtiene una dilución 1:100. De ser necesaria mas diluciones se seguirá el
mismo procedimiento, cuidando utilizar una pipeta para cada dilución.
42
Se recomienda marcar cada tubo de la serie con el número de la muestra
y dilución. Dicho rotulo deberá hacerse en dirección vertical, para evitar con-fusiones
entre diluciones.
Prueba presuntiva.
A partir de la muestra de agua se toman 5 porciones de 10 mL cada una,
empleando pipetas estériles graduadas de 10 mL, y se transfieren a tubos de en-sayo
que contienen 10 mL de Caldo Azida-Dextrosa de doble concentración.
Se homogeniza el contenido. Seguidamente, se toman 5 mL de la muestra y se
añade 1 mL a cada uno de los tubos de la segunda hilera con medio de simple
concentración y a continuación, se toman otros 0.5 mL de muestra y se añade
0.1 mL de la misma en cada tubo de la tercera hilera con medio de simple con-centración.
Se incuban todos los tubos a 35 ± 0.5 °C .durante 48 h. Al cabo de 24
h se examina cada tubo inoculado y si no se ha producido cambio de color, se
re-incuban y se examinan nuevamente después de otras 24 h (48 en total).
El cambio de color de amarillo a púrpura dentro de las 48 h del ensayo,
constituye una prueba presuntiva positiva.
Prueba confirmativa
Se toma con un asa muestra de los tubos que dieron positivos en la fase
presuntiva y se siembra en Caldo Etil Violeta Azida o en medio selectivo para
enterococos Pfizer (PSE).
Los tubos se incuban a 35 oC durante 48 h y las placas con medio PSE
durante 24 ± 2 h.
En el caldo la respuesta positiva se manifiesta por presencia de turbidez
y un botón color púrpura en el fondo del tubo y en el medio PSE por la pre-sencia
de colonias marrón con halos marrones.
Cálculos.
A partir de los tubos considerados positivos se conforma el código y se
consulta la tabla de Número Más Probable (NMP) que corresponda, según el
número de tubos utilizados como réplicas.

Los resultados del NMP de estreptococos fecales se expresan en NMP
Página 43
por 100 mL.
Si se usaron para la siembra porciones de 1.0, 0.1 y 0.01 mL, el NMP se
calcula por la tabla y se registra multiplicando por 10 la cifra correspondiente;
o si se usó una combinación en porciones de 0.1, 0.01 y 0.001 mL la cifra de la
tabla se multiplica por 100.
Determinación del Número Más Probable de Estreptococos fecales en
muestras de sedimentos.
Se suspenden 50g de muestra en 450 mL de Buffer Fosfato y se homo-genizan
en una jarra mezcladora estéril por 1 a 2 min, o en zaranda por 15 min,
obteniéndose de esta forma la dilución 1:10.
Se preparan diluciones decimales apropiadas de acuerdo al grado de
contaminación de la muestra. Se toma 1 mL de la dilución 1:10 y se lleva a
un tubo que contiene 9 mL de Buffer Fosfato, se homogeniza el contenido
obteniéndose así la dilución 1:100. Si se requiere mayor número de diluciones
se seguirá el mismo procedimiento siempre utilizando una pipeta estéril para
cada dilución.
Fase presuntiva.
Se procede de igual forma que se explica para las muestras de agua, pero
el medio utilizado es Caldo KF 1.5 concentrado y de simple concentración. Se
incuba a 37 °C por 48 h.
La aparición de una coloración amarilla en los tubos de Caldo KF debi-do
a la producción de ácido indica una reacción positiva.
Fase confirmativa.
De todos los tubos positivos en la prueba presuntiva se toma muestra
con un asa y se siembra por estrías en placas de Agar Slanetz-Bartley. Las placas
se incuban a 37 °C 48 h.
De las colonias crecidas, se seleccionan al menos tres colonias y se siem-bran
cada una en Caldo Corazón. Se incuban a 37 °C por 24 h y a partir de cada
colonia crecida en Caldo Corazón realizar las siguientes pruebas:
• Coloración de Gram (cocos Gram +, mayormente en pares ó ca-denas
cortas).
• Siembra en placas de Agar Nutriente para la prueba de Catalasa
(-).

44
• Crecimiento en Agar Bilis Esculina (+).
• Crecimiento a 45 oC (+).
• Crecimiento en medio con 6.5% de cloruro de sodio (+ o -).
Cálculos
La densidad de estreptococos fecales se expresa como el NMP de es-treptococos
fecales por gramo de peso seco. El cálculo se realiza de acuerdo
al resultado de la fase confirmativa y se expresa según se explica en el Cap.2.3
para muestras de sedimentos.

Página 45
BIBLIOGRAFIA
González, M. I., Suárez, M., Torres, T., Cisneros, E. y Senmanat, L. 1996.
Manual de técnicas microbiológicas para el control sanitario de aguas mine-romedicinales
y peloides. Inst. Nac. Higiene, Epidemiología y Microbiología.
Cuba.
Norma Cubana NC: 22-1999.
Lugares de Baño en costas y en masas de aguas interiores. Requisitos Higiéni-cos-
Sanitarios.
Secretaría de Salud. 2004.
Lineamientos para determinar la calidad de agua de mar para uso recreativo
con contacto primario. Comisión Federal para la Protección contra Riesgos
Sanitarios. México. 13pp.
Suárez, M. 2002.
Tendencia actual del Estretococo como indicador de contaminación fecal. Re-vista
Cubana de Higiene y Epidemiología 40 (1): 38-43.
Tejedor M.T., Pita, M.L., Viera, C., Morín, L. González, M., Fernández, C. y
Martín, M. 2005.
Calidad bacteriológica de las aguas de playas en Gran Canarias (Islas Canarias,
España). Higiene y Sanidad Ambiental. 5:120-122

2.5. Aislamiento de bacterias degradadoras de hidrocarburos.
46
La biodegradación o bioxidación, es el mecanismo más importante,
efectivo y económico para la eliminación final de los hidrocarburos no voláti-les
del petróleo presentes en el medio marino. Bajo su acción se ponen en juego
múltiples reacciones de oxidación que conducen a la formación de hidrocarbu-ros
de menor peso molecular, además de la formación de dióxido de carbono,
agua y biomasa microbiana.
Las diferencias en la composición y concentración de hidrocarburos en
el petróleo determinan una alta especificidad en el proceso de oxidación mi-crobiana
(Jackson y Pardue, 1999). En el ambiente marino las n-parafinas son
degradadas más rápidamente, seguido por los aromáticos, isoalcanos, ciclopa-rafinas,
y policíclicos aromáticos de cadenas largas (Prince, 1993). Cuando se
trata de petróleos pesados se mantiene esta secuencia de degradación incluidas
las resinas y los asfaltenos, compuestos de alto peso molecular (Haines et al.
1996).
La microbiota marina capaz de utilizar los crudos o fracciones refinadas
del petróleo como única fuente de carbono y energía, está ampliamente repre-sentada
en diversos géneros. Sin embargo, ésta solo se corresponde con el 1
% de la población heterótrofa total en ecosistemas no contaminados y puede
alcanzar hasta un 10 % cuando ocurre un derrame de petróleo (Venosa et al.
2000).
Entre las bacterias hidrocarbonoclastas marinas que refiere la literatura
especializada se incluyen los géneros Pseudomonas, Rhodococcus, Flavobacte-rium,
Acinetobacter, Achromabacter, Bacillus, Corynebacterium y Mycobacte-rium;
entre las levaduras los géneros Candida y Rhodotorula son los más re-presentativos,
mientras que entre los hongos filamentosos los más frecuentes
son Cladosporium, Penicillium y Aspergillus.
La capacidad de los microorganismos biodegradadores de petróleo y sus
derivados tiene implicación práctica para el saneamiento de ambientes impac-tados
por petróleo, tanto en aguas marinas como interiores, en la industria de
extracción de crudos (donde se emplean directamente o sus metabolitos), en la
obtención de biomasa microbiana y solventes, así como, en la transformación
de esteroides.

Objetivo: Aislar bacterias degradadoras de hidrocarburos de muestras
Página 47
de agua y sedimentos marinos.
Materiales, reactivos, medios de cultivo y equipos
Materiales
Placas Petri.
Replicador.
Pipetas.
Petróleo pesado.
Petróleo ligero.
Combustible Diesel.
Equipos.
Procedimiento.
Para la colecta de muestras, tanto de agua como de sedimentos superfi-ciales,
se pueden emplear frascos de vidrio estériles de 250 mL de capacidad. Si
las muestras no pueden procesarse de inmediato, deben conservarse en refrige-ración
por un máximo de 4 h.
En el caso de las muestras de agua, se puede sembrar directamente 1 mL
de la muestra en un erlenmeyer conteniendo 100 mL de medio salino descrito
por Vela y Ralston (1978) empleando como fuente de carbono petróleo pesa-do,
petróleo ligero o combustible Diesel indistintamente, al 2%.
En el caso de las muestras de sedimentos, se hacen diluciones seriadas
en agua de mar estéril hasta 1:100 y se siembra 1 mL de cada dilución en erlen-meyers
conteniendo cada uno 100 mL del mismo medio salino citado anterior-mente,
con la fuente de carbono seleccionada.
Los erlenmeyers inoculados se colocan en zaranda termostatada a 28
ºC.
Cada cinco días, y por tres veces sucesivas, se hacen subcultivos em-pleando
el mismo medio de cultivo (estático) y se incuba a 28ºC ± 2 ºC. Luego
de 15 días de incubación, se inoculan diluciones seriadas de los subcultivos en
placas Petri conteniendo medio para bacterias heterótrofas (Gorvienko, 1961),
en agar GELP (Van Uden y Fell, 1968) y en agar –petróleo (Finnerty y Singer,
1984), respectivamente, y se incuban todas las placas a 28º C ± 2 por 72 h.

48
Una vez crecidas las colonias, se conservan en tubos de cultivo con es-tos
mismos medios.
Los cultivos mixtos capaces de degradar petróleo se aíslan, conserván-dolos
después del enriquecimiento en medio líquido con pases mensuales a
medio salino fresco con petróleo como única fuente de carbono.
Para detectar la capacidad de cada cepa de degradar hidrocarburos aro-máticos,
cíclicos y combustible diesel se siembra en placas Petri contenien-do
medio Vela y Ralston (1978) agarizado, utilizando un replicador múltiple
(Shiaris y Cooney, 1983). Para la siembra con replicador, se preparan suspen-siones
de cultivos jóvenes (24h) de cada cepa en agua de mar estéril y se añade
una gota de cada suspensión celular en una placa estéril de porcelana con po-citos.
El replicador múltiple estéril se aplica sobre los pocitos que contienen
las suspensiones celulares y luego se aplica sobre el medio salino agarizado
contenido en placas Petri. Para el caso de los hidrocarburos aromáticos y cí-clicos,
previamente se aplican, sobre el medio salino agarizado, soluciones al
0.5% P/V de estos sustratos en acetona; mientras que para los cíclicos volátiles
se conservan las placas inoculadas dentro de un recipiente en atmósfera del
compuesto volátil.
Se deben preparar controles utilizando el medio salino agarizado con la
fuente de carbono seleccionada sin inocular.

Página 49
BIBLIOGRAFIA
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A microbial bio¬surfactant. Physiology and Applications. Development In-dustrial
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Swannell, R.P.J., Mitchel, D., Waterhouse, J.C., Miskin, I.P., Head, I.M., Petch,
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Van Uden, N. y Fell, J.W. 1968.
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Microbial population during bioremediation of an experimental oil spill. Pro-ceedings
50
of the 8th International Symposium on Microbial Ecology.

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