Practica 04, cadena respiratoria, inhibidores enzimaticos.

1. CURSO:
Estructura y Función Celular y Tisular II
DOCENTES:
Dra. Julia Violeta Morín Garrido (10)
UNIVERSIDAD NACIONAL DE PIURA
FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD
ESCUELA DE MEDICINA HUMANA - I - 2023
PRÁCTICA 04: Cadena Respiratoria: Inhibidores enzimáticos

2. INTEGRANTES
Grupo 10
• Fiestas Pazo Luciano
• Galvez Pintado Cristian
Jeampieer
• Tarrillo Guevara Yomer
Guivar
• Timaná Cruz Jesús José

3. ÍNDICE
1. Introducción
2. Objetivos
3. Marco Teórico
3.1. Inhibidores de la cadena respiratoria
3.1.1. Inhibidores del Complejo I: NADH - ubiquinona oxidorreductasa
3.1.2. Inhibidores del Complejo II: succinato - ubiquinona oxidorreductasa
3.1.3. Inhibidores del Complejo III: complejo bc1 (ubiquinol - citocromo c reductasa)
3.1.4. Inhibidores del Complejo IV: citocromo c oxidasa (citocromo aa3)
3.2. Inhibidores de la Fosforilación oxidativa
3.3. Fundamento para el homogenizado hepático
3.4. Fundamento del método para el sistema Succinato
3.5. Fundamento del método para el sistema P-fenilendiamida
4. Desarrollo teórico de la práctica
4.1. Sistema succinato
4.1.1. Materiales, equipos y reactivos
4.1.1.1. Materiales
4.1.1.2. Equipos
4.1.1.3. Reactivos

4. ÍNDICE
4.2. Sistema P-fenilendiamina
4.2.1. Materiales, Reactivos, Equipos
4.2.2. Metodología: Sistema P-fenilendiamina
5. Desarrollo de la práctica en forma virtual
5.1. Sistema succinato
5.1.1. Materiales, equipos y reactivos
5.1.1.1. Materiales
5.1.1.2. Equipos
5.1.1.3. Reactivos
5.1.2. Preparación del homogenizado hepático
5.1.3. Metodología del sistema succinato
5.1.4. Resultados e interpretación
5.2. Sistema P-fenilendiamina
5.2.1. Materiales, equipos y reactivos
5.2.2. Metodología: Sistema P-fenilendiamina
5.2.3. Resultados e interpretación
6. Conclusión y Recomendaciones
7. Bibliografía

5. INTRODUCCIÓN
La cadena respiratoria es un sistema complejo que debe responder a las necesidades
energéticas de la célula. Mientras que hay tipos celulares con necesidades
constantes (por ejemplo los hepatocitos) también los hay que presentan necesidades
variables en cortos períodos de tiempo (es el caso del músculo esquelético).
Está formada por una serie de complejos multiproteicos localizados en las
membranas de las crestas mitocondriales que atraviesan la bicapa lipídica y
sobresalen hacia la matriz y el espacio intermembranoso. Las coenzimas están
disueltas en lípidos y se difunden a lo largo de la membrana o a través de su
superficie.
En el presente laboratorio se trata de demostrar el efecto de algunos inhibidores de
la óxido-reducción empleando como fuente enzimática el homogenizado celular de
hígado.

6. 2. Objetivos
2.1. Objetivo General
• Demostrar el funcionamiento de la cadena respiratoria a través del efecto de inhibidores sobre la
cadena óxido-reducción biológica mediante dos sistemas: el sistema de la para-fenilendiamina y el
sistema succinato.
2.2. Objetivos Específicos
• Identificar los sistemas de transporte de los equivalentes reductores de la mitocondria mediante el uso de
artificiales de hidrógeno y de electrones con el fin de visualizar que la cadena respiratoria funciona utilizando
inhibidores.
• Explicar la técnica de aislamiento de mitocondria a través de homogeneizado hepático.
• Describir las partes del sistema enzimático de la cadena respiratoria usado en el presente modelo en cada
tubo del experimento.
• Interpretar los resultados obtenidos para el sistema de la para-fenilendiamina y el sistema succinato.

7. 3.1. Inhibidores de la cadena respiratoria
3.1.1.Inhibidores del Complejo I: NADH - ubiquinona
oxidorreductasa
Capta dos electrones del NADH y los transfiere a un transportador
liposoluble denominado ubiquinona (Q). El producto reducido, que se
conoce con el nombre de ubiquinol (QH2) puede difundir libremente por la
membrana. Al mismo tiempo, el Complejo I transloca cuatro protones a
través de membrana y produce un gradiente de protones.
El flujo de electrones ocurre de la siguiente forma:
El NADH es oxidado a NAD+, y reduce al FMN a FMNH2 en un único paso
que implica a dos electrones. El siguiente transportador de electrones es un
centro Fe-S que puede aceptar al electrón y transferirlo a la ubiquinona
generando una forma reducida, denominada semiquinona. Esta
semiquinona vuelve a reducirse con el otro electrón que quedaba,
generando el ubiquinol, . Durante este proceso, cuatro protones se
translocan a través de la membrana interna mitocondrial, desde la matriz
hacia el espacio intermembrana.

8. 3.1.2. Inhibidores del Complejo II: succinato - ubiquinona
oxidorreductasa
Se trata de un complejo formado en mamíferos por 4 subunidades
proteicas. Cataliza la reacción de oxidación del succinato a fumarato
acoplándola con la reducción de la ubiquinona a ubiquinol. El
acoplamiento se realiza gracias a una cadena de oxidaciones
(esquematizada a la derecha) en varios coenzimas redox incluidos en
este complejo.
El coenzima Q (ubiquinona) difunde entre la región hidrófoba de la
bicapa lipídica y el sitio de unión en las subunidades C y D del
complejo II, integradas en la membrana. Una vez reducido, el ubiquinol
(QH2) puede desplazarse por la membrana y así transportar los
electrones hasta el complejo III.

9. 3.1.3. Inhibidores del Complejo III: complejo bc1 (ubiquinol - citocromo c reductasa)
El complejo está formado por 11 subunidades proteicas e intervienen varias moléculas de ubiquinol, dos de citocromo b, un núcleo Fe·S y una
de citocromo c1.
Los electrones se reciben desde el ubiquinol (QH2) que, desplazándose por la membrana, los trae desde el complejo I o el complejo II. Como
consecuencia de un complejo mecanismo de intercambio de electrones (denominado “ciclo Q”), en la interacción de Q con el complejo III se
toman 2 protones del estroma o matriz mitocondrial y se ceden 4 al espacio intermembranario. Dado que en la formación anterior de ese QH2
(junto al complejo I o al II) se utilizaron otros 2 protones del estroma, en la actuación de Q se ha producido la traslocación de 4 H+ por cada 2
e− transportados desde I (o II) hasta III.
El aceptor final al que este complejo III cede los electrones es el citocromo c, que es soluble y transportará por el espacio intermembranario
los electrones hasta el complejo IV.

10. El oxígeno se reduce a agua gracias a los electrones recibidos desde el citocromo c que, desplazándose por el espacio intermembranario,
los trae desde el complejo III.
El complejo IV está formado por varias subunidades proteicas que contienen los grupos prostéticos que intervienen en el transporte de
electrones: dos grupos hemo (llamados citocromos a y a3) y 2 núcleos que contienen iones Cu2+ (centros CuA y CuB). Los electrones se
transportan de uno en uno hasta acumular 4 en el último centro redox (formado por cit.a3, centro CuB y un residuo de tirosina); entonces
pueden cederse a una molécula de oxígeno.
Como consecuencia de todo esto, por cada electrón transferido se capta un protón del estroma o matriz mitocondrial y se libera un
protón al espacio intermembranario.
3.1.4. Inhibidores del Complejo IV: citocromo c oxidasa (citocromo aa3)

11. Atractilósido
3.2. Inhibidores de la fosforilación oxidativa
Muchos de los conocimientos que tenemos hoy en día sobre la cadena respiratoria y la fosforilación
oxidativa, se debe a estudio del uso de los inhibidores, esto a llevado a que conozcamos el mecanismo de
acción de diversos venenos que pueden ser clasificados en: inhibidores de la cadena respiratoria,
inhibidores de la fosforilación oxidativa y desacopladores de esta última.
Inhibe la fosforilación oxidativa
mediante la inhibición del
transportador de ADP hacia dentro
de la mitocondria, y de ATP hacia
afuera de ella.

12. Oligomicina
3.2. Inhibidores de la fosforilación oxidativa
Antibiótico que bloquea por
completo la oxidación y
fosforilación al bloquear el flujo
de protones por medio de la ATP
sintasa.

13. 3.3. Fundamento para el homogeneizado hepático
La finalidad del homogeneizado hepático es la de obtener
MITOCONDRIAS PURAS que puedan realizar la Cadena
Respiratoria y que brinden el sistema enzimático necesario para
ello (NAD, FAD, CITOCROMOS), es decir, se rompe la membrana
celular mediante choques hiposmóticos para así, poder añadir las
diferentes sustancias que nos permiten experimentar en qué
momento se produce o no la Cadena Respiratoria
El término homogeneización se
refiere al rompimiento de la
célula o tejido del cual se
pretende extraer la organela o la
molécula de interés biológico
Los procedimientos de homogeneización más comunes son:
• La purificación de cada uno de los principales organelos
subcelulares representó un gran logro en la Biología celular al
hacer posible el estudio detallado de sus estructuras y
funciones metabólicas.
• La purificación se inicia con la rotura de la pared celular, de la
membrana plasmática, o de ambas. Las células deben estar
suspendidas en una solución con pH y concentración de sales
apropiada. Normalmente se emplea sacarosa isotónica (0,25%)
o una combinación de sales similar a las de la célula.

14. Succinato
deshidrogenasa
subunidad A
(SDHA)
Succinato
deshidrogenasa
subunidad B
(SDHB)
Succinato
deshidrogenasa
subunidad C
(SDHC)
Succinato
deshidrogenasa
subunidad D
Hidrofílicas
Hidrofóbicas
3.4. Fundamento del método para el sistema succinato
La enzima succinato deshidrogenasa (SDH), succinato coenzima Q reductasa o complejo II mitocondrial es un complejo
proteico ligado a la membrana interna mitocondrial que interviene en el ciclo de Krebs y en la cadena de transporte de
electrones, y que contiene FAD (flavín-adenín-dinucleótido) unido covalentemente.
La enzima está compuesta de cuatro subunidades, dos
hidrofílicas y dos hidrofóbicas:
Es una flavoproteína (Fp) que tiene unida
covalentemente como cofactor una molécula de FAD.
También contiene el sitio de unión del succinato.
Contiene tres clústers de hierro-azufre: 2Fe-2S, 4Fe-
4S y 3Fe-4S.
Une el complejo proteico a la membrana de la
mitocondria.
Une el complejo proteico a la membrana de la
mitocondria.

15. 3.4. Fundamento del método para el sistema succinato
La succinato deshidrogenasa actúa separando dos átomos
de hidrógeno que entre sí se hallan en posición trans de
los átomos de carbono metilénicos del succinato
Esta enzima posee algunas características de una enzima
alostérica: es activada por el succinato, el fosfato, el ATP
y la coenzima Q reducida, y es inhibida por el malonato,
un análogo estructural del succinato.
Por otro lado, esta enzima se constituye como una de las
dianas moleculares en la intoxicación por cianuro,
compuesto que inhibe su acción y así bloquea la
producción de ATP, induciendo a hipoxia celular.

16. 3.5. Fundamento del método para el sistema P-fenilendiamina
Estructuralmente, el complejo IV es una proteína integral de membrana que incluye varios grupos prostéticos metálicos, así
como 13 subunidades, en mamíferos. El complejo posee dos grupos hemo, un citocromo a y otro a3, así como dos centros de
cobre (uno denominado CuA y el otro CuB centers).
Aproximadamente el 90% del consumo celular del oxígeno se debe a la acción de este complejo que cataliza la reducción del
oxígeno para formar agua. Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores más fuertes como es el caso de ión cianuro
(CN-), azida (N3-), monóxido de carbono (CO) y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente este complejo enzimático.
Con ello se ve interrumpido el transporte electrónico y se deja de utilizar el O2 generando una condición de cianosis celular.
La actividad del complejo citocromo C oxidasa se puede demostrar mediante la oxidación de aceptores electrónicos
artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de citocromos de los complejos de la cadena
respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos
oscuros.
La p-fenilendiamina es un indicador que cambia de color a marrón oscuro al oxidarse, para lo cual el citocromo c debe actuar
como el aceptor de los electrones que la p-fenilendiamina cede; en el sistema debe haberse agregado fracción mitocondrial u
homogeneizado total.

17. 4. Desarrollo
teórico de la
práctica

18. MATERIALES
1
4.1.1. Materiales
4.1. PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIÓN DE CADENA RESPIRATORIA
Se utilizará para hacer los choques hipoosmóticos con agua destilada y
trituración del hígado fresco y aislamiento del extracto conteniendo la
cadena respiratoria
2
MORTERO
GASA
En el presente laboratorio se utilizará para el filtrado del homogenizado
hepático.
3
TUBOS 16x16
Se utilizará en este laboratorio para contener pequeñas muestras líquidas
o sólidas (homogeneizado y reactivos).

19. 5
4.1.1. Materiales
4.1. PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIÓN DE CADENA RESPIRATORIA
Permitirá aislar y analizar materiales de estudio en este caso el hígado.
6
PLACA PETRI
BISTURÍ
En esta práctica para seccionar el hígado, además eliminar
completamente la grasa y el tejido conectivo.
Se empleará en este laboratorio para llevar un líquido y reactivos de un
lugar a otro, de forma muy precisa.
PIPETAS
4

20. 4.1.2. Material Orgánico
4.1. PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIÓN DE CADENA RESPIRATORIA
En el presente laboratorio el
hígado será triturado para poder
obtener el homogeneizado
hepático el cual presentará el
sistema de la cadena respiratoria.
HÍGADO
1
Material
Orgánico

21. BUFFER
FOSFATO DE
SODIO 0.1 M, PH
7.4
1
REACTIVOS
4.1.3. Reactivos
4.1. PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIÓN DE CADENA RESPIRATORIA
La función del buffer fosfato salino es
mantener un pH fisiológico

22. HOMOGENEIZAD
OR DE TEJIDOS
1
EQUIPOS
4.1.4. Equipos
4.1. PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIÓN DE CADENA RESPIRATORIA
Se utilizará para la trituración del
tejidos.

23. 4.1.5. FUNDAMENTO DEL MÉTODO
4.1. PROCEDIMIENTO PARA EXTRACCIÓN DE CADENA RESPIRATORIA
El homogeneizado hepático tiene la finalidad de proveer los componentes de la cadena
respiratoria.
Se llama homogenización a la técnica que consiste en disgregar los tejidos y romper
las membranas plasmáticas de las células, con lo que se liberan los orgánulos
subcelulares y el citosol. Los homogeneizados se utilizan, sobre todo como punto de
partida para obtener por centrifugación diferencial las distintas fracciones
subcelulares: núcleo, mitocondrias.
La finalidad del homogeneizado hepático es la de obtener MITOCONDRIAS PURAS
que puedan realizar la Cadena Respiratoria y que brinden el sistema enzimático
necesario para ello (NAD, FAD, CITOCROMOS), es decir, se rompe la membrana
celular mediante choques hipoosmóticos para así, poder añadir las diferentes
sustancias que nos permiten experimentar en qué momento se produce o no la Cadena
Respiratoria.

24. • Obtener 30gr de tejido hígado de res. El animal debe ser sacrificado una hora antes y poner el
extracto en hielo
• Eliminar completamente la grasa y el tejido conectivo.
• Colocarlo en un mortero de porcelana y triturarlo.
• Agregar 10 ml de agua destilada (choques hipoosmóticos) para sacar las mitocondrias en baño
de H2O helada
• Agitar continuamente durante 15 minutos utilizando el moledor del mortero.
• Tamizar a través de una gasa fina para eliminar el líquido.
• Repetir el lavado 2 veces, para eliminar al máximo los sustratos naturales.
• Transferir el tejido lavado a un homogeneizador.
• Agregar el volumen igual de Buffer Fosfato 7.4 PH 0.1 M y mezclar lo mejor posible.
• Refrigerar o colocar en un recipiente con hielo para evitar el deterioro de las enzimas.
• Agitar enérgicamente para favorecer la difusión del oxígeno.
• Dejar reposar 30 minutos, agitando continuamente.
• Tomar una alicuota homogenizada para los tubos de prueba
4.1.6. Preparación de material / MÉTODO

25. 4.1.6. Preparación de material / MÉTODO
Nota:
En el extracto tenemos las mitocondrias aisladas
y con ellas la cadena respiratoria, el cual contiene
un sistema enzimático que se pretende demostrar
esta práctica.

26. 1
Preparación del
extracto: obtener
mitocondrias por
homogenizado,
trituración del tejido
hepático y choques
hipoosmóticos con
agua destilada.
2
3
4.1.6. Preparación de material / MÉTODO
Obtener 30gr de tejido hígado de res fresco.
El animal debe ser sacrificado una hora antes y
poner el extracto en hielo
Eliminar completamente la grasa y el tejido conectivo
Colocarlo en un mortero de porcelana y triturarlo.

27. 4
5
6
7
4.1.6. Preparación de material / MÉTODO
Agregar 10 ml de agua destilada (choques
hipoosmóticos) para sacar las mitocondrias en baño
de H2O helada
Agitar continuamente durante 15 minutos utilizando el
moledor del mortero.
Tamizar a través de una gasa fina para eliminar el
liquido
Repetir el lavado x 2 veces, para eliminar al máximo los
sustratos naturales.

28. 8
9
10
Transferir el tejido lavado a un homogeneizador
para la trituración del tejidos.
4.1.6. Preparación de material / MÉTODO
Agregar el volumen igual de Buffer Fosfato
7.4 PH 0.1 M y mezclar lo mejor posible.
Refrigerar o colocar en un recipiente con hielo para
evitar el deterioro de las enzimas.

29. 11
12
13
Agitar enérgicamente para favorecer la difusión del
oxígeno.
4.1.6. Preparación de material / MÉTODO
Dejar reposar 30 minutos, agitando continuamente
Tomar una alicuota homogenizada para los tubos de
prueba

30. 4.2. Sistema succinato
4.2.1. Materiales
1
2
3
6 TUBOS DE ENSAYO
6 PIPETAS
1 GRADILLA
Contener los diversos reactivos que se añadirán de acuerdo
al orden establecido en la practica, para poder demostrar el
funcionamiento de la cadena transportadora de electrones.
Medir la alícuota de un líquido, en este caso el
homogeneizado y reactivos los cuales podrán mezclarse
en cantidades exactas
Instrumento que sostiene los tubos de ensayo, además
permite almacenarlos, ordenarlos y refrigerar muestras
(homogeneizado hepático)

31. 4
5
6
GUANTES
LENTES
MASCARILLA KN95
4.2. Sistema succinato
4.2.1. Materiales
Prevenir la propagación de microorganismos o cualquier
otro agente que podrían llegar a afectar a nuestra salud
o alterar el resultado del experimento
Evitar la entrada de objetos, o productos químicos en
los ojos, que terminen dañando la salud de la persona
que realiza la practica
Impide que partículas dañinas ingresen a nuestro cuerpo
al momento de realizar la practica.

32. 2.6
DICLOROFENOLINDOFE
NOL 0.02
BUFFER FOSFATO DE
SODIO 0.1 M , pH: 7.4
SUCCINATO 0.1 M
4.2. Sistema succinato
4.2.2. Reactivos
1
2
3
La función del buffer fosfato salino es
mantener un pH fisiológico.
2,6-Diclorophenolindofenol (DCPIP, DCIP o
DPIP)
Es aceptor de electrones a nivel del citocromo c,
actúa a este nivel dando un color azul al
interactuar con electrones. Hace que los electrones
fugen de la mitocondria.
El succinato (sustrato inicial de la cadena corta de
la cadena respiratoria)

33. 4.2. Sistema succinato
4.2.2. Reactivos
4 5
6
Es un compuesto
químico altamente
tóxico, inhibidor de la
citocromo c oxidasa.
Compuesto químico que
es inhibidor del complejo
NAD y la citocromo Q.
Es un inhibidor competitivo de la reacción
de la succinato deshidrogenasa y bloquea
la transformación del succinato a fumarato.
CIANURO DE SODIO 0.1 M
BARBITURATO DE SODIO
0.1 M
MALONATO 0.1 M
7
En el extracto tenemos las
mitocondrias aisladas y con ellas
la cadena respiratoria, el cual
contiene el sistema enzimático
que se pretende demostrar en
esta práctica.
HOMOGENEIZADO
HEPÁTICO

34. 4.2.3. PROCEDIMIENTO PARA EL SISTEMA SUCCINATO
/ MÉTODO
La succínico deshidrogenasa es una enzima que se encuentra asociada a
la membrana interna de la mitocondria, esta remueve 2 protones y 2
electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación
asociada a la coenzima FAD, que transfiere los electrones a la cadena
de transporte de electrones. Este proceso es inhibido en forma
competitiva con la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el
malonato, malato, oxalacético y oxálico, los cuales se unen
fuertemente al sitio activo de la enzima, lo que genera la acumulación
de succinato. El proceso se puede evidenciar in vitro mediante el uso de
un aceptor electrónico artificial como el 2.6 diclorofenolindofenol, que
es coloreado cuando entra en contacto con los electrones.

35. 4.2.4. Metodología: sistema Succinato

36. RESULTADOS DEL SISTEMA
SUCCINATO
TUBO 02
TUBO
01
TUBO 03
No existe complejo enzimático por lo que el resultado es negativo ya que la
cadena respiratoria está ausente. Por lo tanto no hay cambio de color a azul.
No se agregó succinato que es sustrato inicial de la cadena corta de la cadena
respiratoria. Por lo tanto al no haber sustrato, el resultado es negativo y no hay
cambio de color a azul.
El resultado es positivo, sí hay cambio a color azul, de este modo deduce que la
cadena respiratoria estará presente y el sistema estará completo.

37. El resultado es positivo por lo tanto hay cambio de color a azul, debido que la reacción
pudo darse por la vía corta debido a que el Barbiturato de sodio es un inhibidor del
NAD y la citocromo Q, lo cual detiene el paso de electrones a nivel de complejo I en la
vía larga de la cadena respiratoria, más no es un inhibidor de la vìa corta.
RESULTADOS DEL SISTEMA
SUCCINATO
TUBO 04
TUBO 05
TUBO 06
El resultado es negativo, por lo tanto no hay cambio de color y la cadena
respiratoria no funciona, debido a que el malonato es un inhibidor competitivo de
la vía corta de la cadena respiratoria donde bloquea la transformación del
succinato a fumarato a nivel del complejo II.
El resultado es negativo, por lo tanto no hay cambio de color a rojo, la cadena respiratoria
esta ausente debido a el cinuanuro de sodio que actúa sobre la citocromo oxidasa
mitocondrial y por lo tanto sobre el bloqueo del transporte de electrones.

38. 4.3.1. Materiales
4.3. Sistema P-fenilendiamina
1
6 TUBOS DE ENSAYO
Contener los diversos reactivos que se añadirán de acuerdo
al orden establecido en la practica, para poder demostrar el
funcionamiento de la cadena transportadora de electrones.
2
5 PIPETAS
Medir la alícuota de un líquido, en este caso el
homogeneizado y reactivos los cuales podrán mezclarse en
cantidades exactas
3
1 GRADILLA
Instrumento que sostiene los tubos de ensayo, además
permite almacenarlos, ordenarlos y refrigerar muestras
(homogeneizado hepático)

39. 4
5
GUANTES
LENTES
Prevenir la propagación de microorganismos o cualquier
otro agente que podrían llegar a afectar a nuestra salud
o alterar el resultado del experimento
Evitar la entrada de objetos, o productos químicos en
los ojos, que terminen dañando la salud de la persona
que realiza la practica
4.3.1. Materiales
4.3. Sistema P-fenilendiamina

40. BUFFER FOSFATO DE
SODIO 0.1 M , pH: 7.4
4.3.2. Reactivos
1
2
3
La función del buffer
fosfato salino es
mantener un pH
fisiológico.
Dador artificial de electrones a nivel del
complejo I.
4.3. Sistema P-fenilendiamina
CIANURO DE SODIO 0.1 M
Es un inhibidor de la
citocromo oxidasa C
P - FENILENDIAMINA
1%

41. 4.3.2. Reactivos
4
5
6
Compuesto químico que
es inhibidor del complejo
NAD y la citocromo Q.
Es un inhibidor competitivo de la reacción
de la succinato deshidrogenasa y bloquea
la transformación del succinato a fumarato.
BARBITURATO DE SODIO
0.1 M
MALONATO 0.1 M
En el extracto tenemos las mitocondrias aisladas y con
ellas la cadena respiratoria, el cual contiene el sistema
enzimático que se pretende demostrar en esta práctica.
HOMOGENEIZADO
HEPÁTICO
4.3. Sistema P-fenilendiamina

42. 4.3.3. PROCEDIMIENTO/ FUNDAMENTO DEL MÉTODO PARA EL
SISTEMA P-FENILENDIAMINA
La cadena de transporte de electrones o fosforilación oxidativa es un proceso que
se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido por una
serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroproteínas. El
complejo citocromo oxidasa es el componente final de la cadena y está constituido
por el citocromo a y a3 y dos iones Cu (II). Aproximadamente el 90% del consumo
celular de oxígeno se debe a la acción de este complejo. Esta enzima es sensible a
la presencia de aceptores electrónicos más fuertes como el cianuro, azida y
monóxido de carbono, entre otros, los cuales inhiben irreversiblemente este
complejo enzimático y se interrumpe el transporte de electrones produciéndose una
cianosis celular. La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse
mediante la oxidación de sustancias como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia
del sistema de citocromos. Esta sustancia es muy reactiva así que se condensa y
polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros (color rojizo).

43. 4.3.4. SISTEMA P-FENILENDIAMINA (VÍA LARGA
DE LA CADENA RESPIRATORIA): COMPONENTES

44. RESULTADOS DEL SISTEMA P-FENILENDIAMINA
No hay cambio de color a rojo, no se agregó homogeneizado hepático, el cual
proporciona la cadena respiratoria, por lo cual la cadena respiratoria estará
ausente.
TUBO 1
TUBO 2
La cadena respiratoria estará presente y el sistema estará completo. Por lo tanto
sí hay cambio a color rojo
TUBO 3
No hay cambio de color a rojo, debido a que; se agregó también 0.5 mL de
cianuro de sodio 0.1M, el cual es un inhibidor común de la cadena respiratoria a
nivel del complejo IV.

45. RESULTADOS DEL SISTEMA P-FENILENDIAMINA
TUBO 4
TUBO 5
No hay cambio de color a rojo,se agregó también 0.5 mL de Barbiturato de sodio
0.1M, el cual es un inhibidor de la vía larga de la cadena respiratoria a nivel del
complejo I.
Sí hay cambio de color a rojo, la reacción pudo darse por la vía larga y tiene 0,5
mL de homogeneizado hepático, el cual proporciona la cadena respiratoria.

46. 5. Desarrollo de
la práctica en
forma virtual

47. 1 2 3 4 5 6
5.1. Metodología Sistema Succinato
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA RESPIRATORIA):
COGER 6 TUBOS Y ROTULARLOS DEL 1 AL 6
PASO 01

48. PASO 02
TUBO 01
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA): AUSENCIA DE CADENA RESPIRATORIA
(HOMOGENEIZADO HEPÁTICO)
En el tubo 01 no hay cambio de
color a azul debido a que aún
cuando se agregó 1.5mL de
Buffer fosfato de sodio 0.1M y
pH 7.4, lo que nos asegura que la
reacción será favorecida por el
medio, 1mL de 2.6
diclorofenolindofenol el cual es
el aceptor artificial de
electrones; no se agregó
homogeneizado hepático, por lo
cual la cadena respiratoria está
ausente
NO FUNCIONA LA VÍA
CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA
Esperamos unos minutos y
observamos

49. PASO 03
TUBO 02
NO FUNCIONÓ LA VÍA
CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA
Esperamos unos minutos y
observamos
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA): AUSENCIA DE SUSTRATO (SUCCINATO)
En el tubo 02 no hay cambio de
color a azul debido a que aún
cuando se agregó 1.2mL de
Buffer fosfato de sodio 0.1M y
pH 7.4 que nos asegura que la
reacción será favorecida por el
medio, 1mL de 2.6
diclofenolindofenol el cual es el
aceptor artificial de electrones y
0.5mL de homogeneizado
hepático que proporciona la
cadena respiratoria; no se
agregó el sustrato que iniciará la
reacción (succinato).

50. PASO 04
TUBO 03
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA): SISTEMA COMPLETO (FUNCIONAMIENTO
DE LA CADENA)
En el tubo 03 sí hay cambio de
color a azul debido a que se
agregó 1mL de Buffer fosfato de
sodio que nos asegura que la
reacción será favorecida por el
medio, 1mL de 2.6
diclofenolindofenol el cual es el
aceptor artificial de electrones,
0.2mL de succinato a 0.1M que es
el sustrato que iniciará la
reacción y por último se agrego
0,5 mL de homogeneizado
hepático, que proporciona la
cadena respiratoria.
Completando así el sistema
FUNCIONÓ LA VÍA CORTA
DE LA CADENA
RESPIRATORIA
Esperamos unos minutos y
observamos

51. SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA RESPIRATORIA): SISTEMA
COMPLETO (FUNCIONAMIENTO DE LA CADENA RESPIRATORIA)

52. PASO 05
TUBO 04
NO FUNCIONÓ LA VÍA
CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA
Esperamos unos minutos y
observamos
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA): ACCIÓN DEL MALONATO.
En el tubo 04 no hay cambio de color a
azul debido a que aún cuando se agregó
0.5mL de Buffer fosfato de sodio, 1mL de
2.6 diclorofenolindofenol que es el
aceptor artificial de electrones, 0.2mL de
succinato a 0.1M que el sustrato que
iniciará la reacción, 0.5 mL de
homogeneizado hepático que
proporciona la cadena respiratoria, tiene
también 0.5mL de malonato a 0.1M que
es un inhibidor de la vía corta de la
cadena respiratoria que bloquea la
transformación de succinato a fumarato.
Por tanto no se produce la reacción

53. SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA RESPIRATORIA): ACCIÓN DE MALONATO

54. PASO 06
TUBO 05
NO FUNCIONÓ LA VÍA
CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA
Esperamos unos minutos y
observamos
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA): ACCIÓN DEL CIANURO DE SODIO
En el tubo 05 no hay cambio de
color debido a que aún cuando se
agregó 0.5mL de Buffer fosfato
de sodio, 1mL de 2.6
diclorofenolindofenol que es el
aceptor artificial de electrones,
0.2mL de succinato a 0.1M que el
sustrato que iniciará la reacción,
homogeneizado hepático que
proporciona la cadena
respiratoria tiene también 0.5mL
de cianuro de sodio a 0.1M que es
un inhibidor de la citocromo
oxidasa C (complejo IV de la
cadena respiratoria)

55. SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA RESPIRATORIA): ACCIÓN DEL CIANURO DE SODIO

56. PASO 07
TUBO 06
FUNCIONÓ LA VÍA CORTA
DE LA CADENA
RESPIRATORIA
Esperamos unos minutos y
observamos
SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA
RESPIRATORIA): INACCIÓN DEL BARBITURATO DE SODIO
(INHIBIDOR DE LA VÍA LARGA DE LA CADENA RESPIRATORIA)
En el tubo 06 sí hay cambio de color
a azul debido a que aún cuando se
agregó barbiturato de sodio,
inihibidor del complejo I (que
interfiere en la vía larga de la cadena
respiratoria) la reacción pudo darse
por la vía corta porque ya se tenía el
sistema dado por: 0.5mL de Buffer
fosfato de sodio, 1mL de 2.6
diclorofenolindofenol que es el
aceptor artificial de electrones,
0.2mL de succinato a 0.1M que el
sustrato que iniciará la reacción y 0,5
mL homogeneizado hepático que
proporciona la cadena respiratoria).

57. SISTEMA DE SUCCINATO (VÍA CORTA DE LA CADENA RESPIRATORIA): INACCIÓN DEL BARBITURATO DE SODIO
(INHIBIDOR DE LA VÍA LARGA DE LA CADENA RESPIRATORIA)

58. Buffer Fosfato 0.1 M ,
pH: 7.4
2,o mL 1,5 mL 1,0 mL 1,0 mL 1,0 mL
1 2 3 4 5
5.2. Metodología Sistema P - Fenilendiamina
Se agrega Buffer fosfato de sodio 0,1 M, Ph 7,4 a los 5 tubos
PASO 01

59. CIANURO DE SODIO 0.1
M
- - 0.5 mL - -
1 2 3 4 5
5.2.2. Metodología Sistema P - Fenilendiamina
El tubo 3 agregar 0,5 mL de Cianuro de sodio 0,1M
PASO 02

60. MELONATO 0,1 M - - - 0,5 mL -
1 2 3 4 5
5.2.2. Metodología Sistema P - Fenilendiamina
El tubo 4 agregar 0,5 mL de Malonato 0,1M
PASO 03

61. BARBIRURATO DE
SODIO 0,1 M
- - - - 0,5 mL
1 2 3 4 5
5.2.2. Metodología Sistema P - Fenilendiamina
En el tubo 5 agregar 0,5 mL de Barbiturato de Sodio 0,1
M.
PASO 04

62. P - FENILENDIAMINA 0,5 mL 0,5mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
1 2 3 4 5
5.2.2. Metodología Sistema P - Fenilendiamina
Agregar 0,5 ml de P-Fenilendiamina a todos los
tubos.
PASO 05

63. Homogenizado hepático - 0,5mL 0,5 mL 0,5 mL 0,5 mL
2 3 4 5
1
5.2.2. Metodología Sistema P - Fenilendiamina
Finalmente agregar 0,5 mL de homogenizado hepático a
los tubos 2,3,4 y 5
PASO 06

64. INTERPRETACIÓ
N
TUBO 1
BUFFER FOSFATO DE SODIO
0.1 M , PH:7,
2,0 mL
CIANURO DE SODIO 0,1 M -
MALONATO 0,1 M -
BARBITURATO DE SODIO 0,1
M
-
P - FENILENDAMINA 1% 0,5 mL
HOMOGENIZADO HEPÁTICO -
5.2.3. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
No hay cambio de color a rojo, no se agregó
homogeneizado hepático, el cual
proporciona la cadena respiratoria, por lo
cual la cadena respiratoria estará ausente.
1

65. RESULTADOS
TUBO 2
BUFFER FOSFATO DE SODIO
0.1 M , PH:7,
1,5 mL
CIANURO DE SODIO 0,1 M -
MALONATO 0,1 M -
BARBITURATO DE SODIO 0,1
M
-
P - FENILENDAMINA 1% 0,5 mL
HOMOGENIZADO HEPÁTICO 0,5 mL
5.2.3. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
2
La cadena respiratoria estará presente y
el sistema estará completo. Por lo tanto
si hay cambio de color

66. RESULTADOS
TUBO 3
BUFFER FOSFATO DE SODIO
0.1 M , PH:7,
1,0 mL
CIANURO DE SODIO 0,1 M 0,5 mL
MALONATO 0,1 M -
BARBITURATO DE SODIO 0,1
M
-
P - FENILENDAMINA 1% 0,5 mL
HOMOGENIZADO HEPÁTICO 0,5 mL
5.2.3. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
3
No hay cambio de color a rojo, debido a
que; se agregó también 0.5 mL de cianuro
de sodio 0.1M, el cual es un inhibidor común
de la cadena respiratoria a nivel del
complejo IV.

67. RESULTADOS
TUBO 4
BUFFER FOSFATO DE SODIO
0.1 M , PH:7,
1,0 mL
CIANURO DE SODIO 0,1 M -
MALONATO 0,1 M 1,5 mL
BARBITURATO DE SODIO 0,1
M
-
P - FENILENDAMINA 1% 0,5 mL
HOMOGENIZADO HEPÁTICO 0,5mL
4
5.2.3. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
Sí hay cambio de color a rojo, la
reacción pudo darse por la vía larga y
tiene 0,5 mL de homogeneizado
hepático, el cual proporciona la cadena
respiratoria.

68. RESULTADOS
TUBO 5
BUFFER FOSFATO DE SODIO
0.1 M , PH:7,
1,0 mL
CIANURO DE SODIO 0,1 M -
MALONATO 0,1 M -
BARBITURATO DE SODIO 0,1
M
0,5 mL
P - FENILENDAMINA 1% 0,5 mL
HOMOGENIZADO HEPÁTICO 0,5 mL
5.2.3. RESULTADOS E INTERPRETACIÓN
5
No hay cambio de color a rojo,se agregó
también 0.5 mL de Barbiturato de sodio
0.1M, el cual es un inhibidor de la vía larga
de la cadena respiratoria a nivel del
complejo I.

69. INTERPRETACI
ÓN
En esta práctica través del sistema P-Fenilendiamina se pone en
evidencia el funcionamiento de la vía larga de la cadena respiratoria
y la influencia de los inhibidores como el cianuro y el barbiturato,
cuya acción tiene como consecuencia el no funcionamiento de la
cadena respiratoria, debido a que la van a inhibir a nivel de la
citocromo c y el complejo I respectivamente, lo cual evita el cambio
en la coloración a rojo, por último se evidencia que el malonato no
inhibe la vía larga de la cadena respiratoria ya que actúa a nivel del
complejo II (vía corta de la cadena respiratoria) por lo cual al
utilizarlo en este sistema el cambio de color a rojo sí se observará.

70. Conclusiones
6. Conclusiones y Recomendaciones
• La cadena respiratoria presenta dos vías, una vía corta y una larga, la primera puede
evidenciarse a través del sistema de succinato y la segunda a través del sistema P-
Fenilendiamina.
• La cadena respiratoria presenta cuatro complejos (I,II,III y IV), de los cuales el complejo III
y el complejo IV constituyen una vía común para ambas vías de la cadena respiratoria.
Recomendacione
s
• El hígado debe ser fresco para que las enzimas no sufran desnaturalización por agentes
externos como pH, temperatura, etc.
• El cianuro es un compuesto altamente toxico que en casos de ingestión puede llegar provoca
la muerte, por lo tanto debe ser manipulado con responsabilidad

71. 7. Referencias Bibliográficas
• Nieves Sanz Garcia, Uso de la técnica de perifusion de células hepáticas. Universidad de salamanca,
2.020, julio
• Biomodel (online) Disponible en: http://biomodel.uah.es/tecnicas/centrif/inicio.htm
• Tecnología Médica (online). Disponible en: http://morfocitologia.blogspot.com/2008/06/tecnicas-
de-fragmentacion-y-separacion_19.html
• Inhibidores de la fosforilación oxidativa | Volviendo a lo básico. (2020). Retrieved 18 August 2020,
from http://www.ffis.es/volviendoalobasico/5inhibidores_de_la_fosforilacin_oxidativa.html
• ¿Qué es el donador de electrones y el receptor de electrones? - Definición. (2020). Retrieved 23
August 2020, from https://www.radiation-dosimetry.org/es/que-es-el-donador-de-electrones-y-
el-receptor-de-electrones-
definicion/#:~:text=En%20f%C3%ADsica%20de%20semiconductores%2C%20un,un%20semiconductor%2
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