El documento describe los métodos de secuenciación de ADN desarrollados por Maxam-Gilbert y Sanger. Estos métodos permiten establecer el orden exacto de las bases A, C, G y T a lo largo de un fragmento de ADN y han sido fundamentales para secuenciar genomas completos y aplicaciones como el diagnóstico de enfermedades.

1. Secuenciar ????
Establecer el orden exacto de las 4 bases
(A,C,G,T) a lo largo de un fragmento de ADN.

2. Métodos básicos de secuenciación
Método químico de Maxam y Gilbert
Maxam, A.M. and Gilbert,W.
(1977) A new method for sequencing DNA.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 560-564.
Método enzimático de Sanger
Sanger, F., Micklen, S.,and Coulson, A.R.
(1977) DNA sequencing and chain terminating
inhibitors.
Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463-5467

3. Frederick Sanger y Walter
Gilbert compartieron, en
1980, el premio Nobel de
química por haber
desarrollado
independientemente métodos
de secuenciación del ADN .
Sanger ganó anteriormente
el premio Nobel de 1959 por
la secuenciación de la
proteína insulina.
F. Sanger W. Gilbert

4. Método químico de Maxam y Gilbert
El fragmento de ADN se marca en sus extremos
con Ɣ 32P ó Ɣ 32S dATP por acción de la
Polinucleótido Quinasa.
Las moléculas marcadas se rompen con
reacciones químicas específicas para cada una
de las cuatro bases.
Los productos luego se resuelven en
función de su tamaño en geles de
poliacrilamida.

5. Extremo marcado radioactivamente 5' o 3‘.
El tratamiento químico rompe la unión
glicosídica entre la ribosa y el nucleótido.
Reacciones químicas específicas
–G : DMS, piperidina
–A + G: DMS, ácido fórmico,piperidina
– C+T: Hidracina, piperidina
–C : Hidracina en 1.5M NaCl, piperidina(rompe la unión
fosfodiester)
Electroforesis en gel + Autoradiografía

8. USOS
Secuenciar oligonucleótidos sintéticos
Analizar modificaciones en la
estructura del adn (ejemplo: metilación
de bases)
Estudiar la estructura secundaria del
ADN o su interacción con proteínas
(ejemplo: experimentos de protección
química).

9. Método de secuenciación de Sanger
Desarrollado en 1977 por Frederick Sanger.
Método Bioquímico (usa una polimerasa).
Basado en la incorporación de
Dideoxinucleótidos (ddNTPs) que detienen el
crecimiento de la cadena de ADN.

11. Los dideoxinucleótidos no tienen OH
en carbono 2' ni en 3' de la
desoxirribosa, por lo que no pueden
formar enlaces fosfodiéster.

12. Durante la secuenciación se llevan a cabo cuatro
reacciones de síntesis separadas incluyendo en
cada una de ellas pequeñas cantidades de los
dideoxinucleótidos (ddNTP: ddGTP; ddATP, ddCTP,
ddTTP)

13. se requiere:
+ Primer Marcado
+ ADN polimerasa
+ 4 dNTPs
+ ddATP
Al incorporarse un dideoxinucleótido finaliza la copia del
templado y se generan fragmentos de distintos tamaños.
Los ddNTP compiten
con los dNTP
para ser incorporados.
produciendo
una mezcla de cadenas
de distintas
longitudes.

14. La sustitución de uno de
los dNTPs por el mismo
nucleótido marcado
radiactivamente permite
la visualización de las
bandas de distinta
longitud por
autoradiografía.

15. En el gel la separación de las
distintas bandas se produce
en función
de su tamaño y la secuencia
puede
determinarse leyendo las
bandas de los
cuatro carriles.

16. Los protocolos de secuenciación
automática:
Son una alternativa al método de Sanger.
Se utilizan compuestos fluorescentes para
“marcar” al “primer” ó a los terminadores.
Los productos de la reacción se detectan
directamente durante la electroforesis.
Los fluoróforos son excitados por la luz de
un láser y luego el equipo detecta la fluorescencia
emitida.
La reacción se realiza en un ciclador

17. Las reacciones de secuenciación
automática pueden emplear:
Terminadores fluorescentes
Primers fluorescentes

18. Secuenciación empleando
terminadores fluorescentes
Se realiza una única reacción de
secuencia
en presencia de los cuatro ddNTPs, cada
uno de ellos marcados con una sonda
fluorescente distinta.

19. Las sondas empleadas son:
A ---> JOE.
Emisión: verde. Derivado de
fluoresceína
C ---> FAM.
Emisión: azul. Derivado de
fluoresceína
G --> TAMRA.
Emisión: amarillo. Derivado de
rodamina
T --> ROX.
Emisión: rojo. Derivado de
rodamina

20. Secuenciación empleando
primers fluorescentes
Se realizan cuatro reacciones de secuencia
distintas en cada una de las cuales se añade el
“primer” marcado en 5´ con una sonda
fluorescente distinta, junto con la polimerasa, los
dNTPs y el ddNTP correspondiente.
En la secuenciación cíclica solo se utiliza UNO de los
dos primers a la vez.
Si utilizáramos al mismo tiempo ambos “primers”,
como en un PCR común, resultarían dos secuencias
solapadas ( la del templado y la de su cadena
complementaria).

26. Aplicaciones de la secuenciación de ADN
Secuenciación genómica
Evaluación del clonado en vectores
Diagnóstico de enfermedades :
bacterianas
virales
protozoos
hongos
cáncer
genéticas
Detección de polimorfismos (single nucleotide
polymorphism)
Forense
ADNs fósiles