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Secuenciación.pptx
Este documento describe varios métodos de secuenciación de ADN, incluyendo el método de Sanger, el método de Maxam y Gilbert, y métodos de nueva generación como la pirosecuenciación. El método de Sanger utiliza didesoxinucleótidos para terminar aleatoriamente la síntesis del ADN complementario, mientras que el método de Maxam y Gilbert degrada químicamente el ADN. Los métodos modernos como la pirosecuenciación detectan los productos de la incorporación de nucleótidos en tiempo real sin necesidad de
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- 2. Métodos de secuenciaciónmejor conocidos Métodos de secuenciación mejor conocidos “Método Sanger” “Método de terminación de cadena” y “Método dideoxi de secuenciación “Método Maxam & Gilbert” “Método de Pirosecuenciación”
- 3. Método de Sanger •ADN problema • Primer modificado • ADN polimerasa I dATP dCTP Nucleótidos terminadores dGTP dTTP Desoxinucleótido Didesoxinucleótido Reactivos empleados
- 4. Efecto de laeliminación del grupo 3’-OH en los ddXTP
- 5. Efecto de laadición aleatoria de lo ddXTPs durante el proceso de elongación “En cada tubo se obtendrán fragmentos de ADN con diferente tamaño en donde el nucleótido terminador será el didesoxinucleótido”
- 6. “En cada tubose obtendrán fragmentos de ADN con diferente tamaño en donde el nucleótido terminador será el didesoxinucleótido” Determinar el peso molecular de los fragmentos y con base en su peso molecular y el tipo de terminador utilizado se determinará la secuencia de nucleótidos del ADN problema.
- 7. Autoradiografia de ungel de secuenciación por método de Sanger y la secuecia de nucleótidos interpretada en el.
- 8. Variantes del métodoSanger Polimerasas empleadas Fragmento Klenow de la polimerasa I de E. coli Polimerasas termoestables como la polimerasa Taq. Marcaje de los fragmentos Isotopo radiactivo32P Moléculas fluorescentes Sitio de marcaje Marcaje del iniciador Marcaje incorporado en la cadena Marcaje del nucleótido terminal
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- 12. Método Químico: Maxam& Gilbert Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. Degradación química del ADN Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño Análisis de los fragmentos por electroforesis Metodología básica para la secuenciación por el método de Maxam & Gilbert
- 13. Método Químico: Maxam& Gilbert 1. Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. 2. Degradación química del ADN 3. Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño 4. Análisis de los fragmentos por electroforesis • Los extremos 5’ del ADN de interés son marcados radioactivamente con 32P. • Con enzimas de restricción se descarta el extremo de una de las hebras de ADN. • Se adicionan muestras con múltiples copias a cuatro recipientes de reacción.
- 14. Método Químico: Maxam& Gilbert 1. Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. 2. Degradación química del ADN 3. Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño 4. Análisis de los fragmentos por electroforesis • Cada tubo de reacción es sometido a un método de degradación de ADN diferente que escinde a las moléculas en lugares distintos.
- 15. 1. Cortede las purinas Metilación de A y G con dimetil sulfato (DMS). Después, la reacción es tratada en condiciones alcalinas; la molécula de ADN se fragmenta en las purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras que corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces más rápido), y bandas claras que corresponden a las adeninas
- 16. 2. Cortede adeninas. Esta reacción es una variación de la anterior. Las purinas metiladas se tratan inicialmente con un ácido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas. Después de un tratamiento alcalino las guaninas también son cortadas. Este tratamiento genera una serie de bandas oscuras y claras que también corresponden a las adeninas, y las guaninas, respectivamente
- 17. 3. Cortede pirimidinas. Esta reacción utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina para completar la reacción. 4. Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reacción de hidracina con tiamina, y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en citosina
- 18. Ejemplos de reactivosutilizados en la etapa de escisión
- 19. Método Químico: Maxam& Gilbert 1. Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. 2. Degradación química del ADN 3. Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño 4. Análisis de los fragmentos por electroforesis Obtención de fragmentos de diferente tamaño
- 20. Método Químico: Maxam& Gilbert Análisis de los fragmentos mediante electroforesis 1. Marcaje del ADN problema por su extremo 5’ o 3’. 2. Degradación química del ADN 3. Obtención de múltiples fragmentos de diferente tamaño 4. Análisis de los fragmentos por electroforesis
- 22. Diferencias principales entreambos métodos En comparación con el método Sanger, el Maxam-Gilbert es el más adecuado para determinar la secuencia de fragmentos cortos de ADN, debido a que puede determinar la secuencia desde la primera base. En cambio, el método de Sanger sólo permite la lectura a partir de la base 10-20. Las reacciones de secuenciación del método enzimático se pueden realizar en unas horas, en cambio las del método de Maxam-Gilbert tardan al menos un día y, además, las reacciones del método de Sanger son más “puras”, con menos contaminantes que puedan afectar la resolución del gel.
- 23. Métodos de nuevageneración Desde el año 2008 la nueva generación de métodos de secuenciación se ha presentado con la aparición de diversas técnicas sin base en el método Sanger. Algunos de los métodos más sobresalientes que hoy en día son usados para la secuenciación de ADN son: Pirosecuenciación Illumina sequencing Roche 454 Genome Sequencing
- 24. Pirosecuenciación La pirosecuenciaciónse basa en la formación de cadenas de ADN y en la detección del grupo pirofosfato liberado durante la incorporación de nucleótidos trifosfato en dicha cadena. Enzimas usadas en el proceso Polimerasa ATP sulfurilasa Luciferasa Apirasa Enzimas utilizadas en la pirosecuenciación
- 25. 1.-El equipo liberaun dNTP determinado 2.-Al generarse el enlace fosfodiéster, se libera pirofosfato (PPi) 3.-La sulfurilasa usa como sustrato a al PPi para generar ATP 4.- El ATP es sustrato de la luciferasa, el cual libera una señal de fluorescencia que es detectado por la cámara CCD 5.-La enzima apirasa elimina el exceso de ATP y de nucleótidos no incorporados. *La liberación de dNTPS es realizada en forma secuencial.
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- 27. Costo del serviciode secuenciación Empresa Costo del servicio de secuenciación TACGen $2.00- 3.50 / por muestra ACGT $2.50 / por muestra CCIB DNA Core (MGH) $2.12-$3.38 / por muestra Genomics & Epigenomics Shared Resource $3.25 / por muestra Nucleic Acid Shared Resource $5.0 / por muestra >48 muestras: $3.31 / por muestra Empresa Costo del servicio de secuenciación Functional Biosciences, Inc $7.00 / por muestra DNASU Core Facility Arizona State University $3.70 / por muestra >48 muestras: $3.00 / por muestra Genomics Core Facility $3.75 / por muestra Eurofins $2.5 / por muestra La siguiente tabla muestra algunos ejemplos del precio actual que algunas empresas ofrecen para el servicio de secuenciación. *Los precios varían de acuerdo al número de muestras, su volumen y a la relación con la empresa del servicio
- 28. Bibliografía Campio RdN,Caultec JC. Instituto de Biotecnología-UNAM. Secuenciación de Ácidos Nucléicos. 2014 Junio. http://www.ibt.unam.mx/computo/pdfs/ met/secuenciacion_acidos_nucleicos.pdf Blackburn, G. M. and M. Gait (1996), Nucleic Acids in Chemistry and Biology, 2nd Ed., Oxford, U. Pr., NY, EUA. Ansorge, W., J. Zimmerman, C. Schwager, J. Stegemann, H. Erfle, and H. Voss (1990) One label, one tube, Sanger DNA sequencing in one and two lanes on a gel. Nucleic Acids Res 18(11): 3419-3420
Notas del editor
- #4 El método de secuenciación enzimático salió casi al mismo tiempo que el de Maxam y Gilbert, pero ha sido más utilizado. Esto se debe, en gran parte, a que se han realizado grandes avances en la automatización de esta técnica, lo cual se discutirá más adelante. El método de Sanger se basa en el uso de la ADN polimerasa para sintetizar cadenas de ADN con una terminación específica. Con este método se generan fragmentos de ADN de todos los tamaños posibles que se puedan distinguir entre sí, por el tipo de marcaje que llevan o por la incorporación de un terminador específico. Las enzimás del tipo de la ADN polimerasa requieren de un templado de ADN de cadena sencilla, y realizan la síntesis de la hebra complementaria extendiéndola a partir de un iniciador en dirección 5’ a 3’. Entre los componentes de la reacción se incluyen nucleótidos que no tienen un grupo hidroxilo en su extremo 3’ (ddNTP), para poder obtener una terminación especifica en las cadenas. Una vez que el ddNTP se incorpora como el residuo terminal, evita que la cadena de ADN sintetizada continúe extendiéndose. La incorporación de los ddNTPs es al azar, de tal forma que se obtienen fragmentos de todos los tamaños posibles que terminan en un residuo especifico.
- #8 El método de Sanger tiene varias ventajas sobre el método de Maxam- Gilbert (Blackburn y Gait, 1996). Las reacciones de secuenciación del método enzimático se pueden realizar en unas horas, en cambio las del método de Maxam-Gilbert tardan al menos un día. Las reacciones del método de Sanger son más “puras”, con menos contaminantes que puedan afectar la resolución del gel.
- #20 Desde que se reporto este método, no se han encontrado reactivos químicos específicos que corten las bases A o T, por lo que se utiliza la estrategia de corte descrita en la figura 4. Esta estrategia permite distinguir entre los nucleótidos que se encuentran al final de cada corte y deducir la secuencia de ADN.