Este documento describe los diferentes métodos de secuenciación de ADN, incluyendo los métodos de primera generación como Sanger y pirosecuenciación, los métodos de segunda generación como secuenciación por síntesis utilizada por Illumina, y los métodos de tercera generación como secuenciación en tiempo real de Pacific Biosciences y Oxford Nanopore. Explica los principios, procedimientos y aplicaciones de cada método para determinar el orden de las bases nucleotídicas en una molécula de ADN.

1. BIOTECNOLOGÍA
M. VERÓNICA TAIPE TAIPE
ExtensiónElCarme

2. SECUENCIACIÓN DEL ADN

3. SECUENCIACIÓN DEL ADN
La secuenciación de ADN es el proceso de lectura de
bases de nucleótidos en una molécula de ADN.
Secuenciar una molécula de ADN consiste en
determinar en qué orden se disponen los nucleótidos
(A, T, C y G) que componen la molécula.

4. Se puede secuenciar:
El genoma completo
Regiones genómicas

5. MÉTODOS DE
SECUENCIACIÓN
PRIMERA GENERACIÓN
SEGUNDA GENERACIÓN
TERCERA GENERACIÓN

6. SECUENCIACIÓN DE
PRIMERA GENERACIÓN

7. SECUENCIACIÓN DE SANGER
El método Sanger, didesoxi o
secuenciación por terminación de la
cadena, fue diseñado por Fred
Sanger en 1977.

8. Para la secuenciación por el método de Sanger se necesitan:
 un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
 un cebador para iniciar la síntesis de ADN
 los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP
y dTTP)
 la enzima ADN-polimerasa
 los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP,
ddCTP y ddTTP)

9. electroforesis en gel de poliacrilamida

10. SECUENCIACIÓN DE SANGER MEJORADO
El método Sanger mejorado
también se lo conoce con el
nombre de secuenciación cíclica.

11. Para la secuenciación por el método de Sanger mejorado se
necesitan:
 un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
 un cebador para iniciar la síntesis de ADN
 los cuatro desoxirribonucleótidos trifosfato (dATP, dGTP, dCTP
y dTTP)
 la enzima Taq-polimerasa
 los cuatro didesoxirribonucleótidos trifosfato (ddATP, ddGTP,
ddCTP y ddTTP) marcados con un fluoróforo distinto

12. electroforesis en gel de poliacrilamida
Electroforesis capilar

13. ELECTROFEROGRAMA

14. PIROSECUENCIACIÓN
La pirosecuenciación es un método
enzimático, que se basa en la detección
de una molecula pirofosfato (PPi)
liberada durante la síntesis de ADN

15. Para la secuenciación por el método de
PIROSECUENCIACIÓN se necesitan:
 un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
 un cebador para iniciar la síntesis de ADN
 tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S)
 cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y
apirasa
 adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
 luciferina

16. pirograma
Pirofosfato

17. 454 PIROSECUENCIACIÓN
Desarrollado por la compañía 454 Life
Sciences (ahora Roche Diagnostics),
amplifica el ADN dentro de gotas de
agua en una solución de aceite
“emulsión de PCR”

18. Para la secuenciación por el método de 454
PIROSECUENCIACIÓN se necesitan:
 un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
 un cebador para iniciar la síntesis de ADN
 tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S)
 ADN polimerasa
 nanoesferas de secuenciación
 cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa
 adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
 luciferina

19. Preparación de una genoteca

20. PCR en emulsión (em-PCR)

21. Depósito de las esferas recubiertas de ADN en una placa que contiene
cientos de miles de pocillos

22. pirosecuenciación

23. análisis de las imágenes

24. SECUENCIADORES SOLID
(SUPPORT OLIGONUCLEOTIDE LIGATION DETECTION)
Desarrollado por Applied Byosistem (ahora
Termofisher), utilizan técnicas enzimáticas de
ligación y de emulsion de PCR, similar al de 454 a
excepción del anclaje final de las nanosesferas a
una superficie de cristal donde se da la
secuenciación.

25. Para la secuenciación por el método de 454
PIROSECUENCIACIÓN se necesitan:
 un ADN de cadena sencilla que actúa como molde
 un cebador para iniciar la síntesis de ADN
 tres desoxirribonucleótidos trifosfato (dGTP, dCTP y dTTP) más
desoxiadenosina alfa-tiotrifosfato (dATP•S)
 ADN polimerasa
 nanoesferas de secuenciación
 cuatro enzimas: ADN polimerasa, ATP sulfurilasa, luciferasa y apirasa
 adenosina 5'-fosfosulfato (APS)
 luciferina

27. SECUENCIACIÓN DE
SEGUNDA GENERACIÓN

28. SECUENCIACIÓN POR SÍNTESIS
Desarrollado por la compañía Illumina, permite
abaratar costos y ofrecer lecturas mas largas, sin
embargo, se requiere de una gran inversion
inicial y de mantenimiento, para poder adquirir y
mantener uno de los equipos que ofrece.
.

30. SECUENCIACIÓN DE
TERCERA GENERACIÓN

31. SECUENCIACIÓN EN TIEMPO REAL (SMRT)
SINGLE MOLECULE REAL TIME
Se caracteriza por asociar una polimerasa a una
matriz y seguir en tiempo real el proceso de
síntesis de una sola molécula de ADN, no se
construye bibliotecas, y aumenta la tasa de
producción de la secuencia Los más conocidos
son: Pacific Biosciences y Oxford Nanopore.

32. PLATAFORMAS PACIFIC BIOSCIENCES (PACBIO)
Esta tecnología permite obtener lecturas de hasta 1500
pb con un resultado final aproximado de 60-75 Mb. El
principal problema en el registro es la velocidad a la que
cada polimerasa sintetiza ADN, debido a las fluctuaciones
propias de cada enzima, por lo que cada enzima tiene
que controlarse individualmente y las adiciones de
nucleótidos deben ser registradas a la velocidad
adecuada en tiempo real.

34. PLATAFORMAS OXFORD NANOPORE
Secuenciador portable que utiliza un bioporo
microscópico similar a una canal iónico de una
membrana plasmática, por el que transitan las moléculas
de ADN, produciendo una interrupción del voltaje a
través de un micro canal y cuyo registro permite
identificar la secuencia de nucleótidos

37. BIBLIOGRAFÍA
Rojas, P. 2018. Métodos de secuenciación de ADN
https://www.thermofisher.com/content/dam/LifeTech/Documents/PDFs/sequencing_h
andbook_FLR.pdf