Este documento describe un estudio sobre mutaciones en el gen c-KIT en pacientes pediátricos con mastocitosis. Se encontró que el 86% de los pacientes tenían mutaciones en c-KIT, incluida la mutación D816V. Sin embargo, en contraste con la mastocitosis en adultos, muchos pacientes pediátricos tenían mutaciones en otros codones de c-KIT en lugar del codón 816. Esto sugiere que las mutaciones en c-KIT juegan un papel importante en la mastocitosis pediátrica pero la enfermedad puede

1. Mastocitosis pediátrica es una enfermedad clonal asociada con D816V y otras mutaciones activadas de c-KIT Ingrid M. Rivera P. Bodemer C, Hermine O, Palme F, Yang Y, Grandpeix-Guyodo C, Leventhal P et all Pediatric Mastocytosis Is a Clonal Disease Associated with D816V and Other Activating c-KIT Mutations Journal of Investigative Dermatology 2010;130:804-815

2. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Grupo heterogéneo de trastornos clínicos Acumulación anormal de mastocitos en diversos tejidos, especialmente en piel y órganos hematopoyéticos Suele aparecer en la infancia o edad adulta temprana. Niños: se limita a la piel, pero puede presentar síntomas sistémicos debido a la liberación de los mediadores de los mastocitos Mastocitosis

3. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Mastocitosis Clasificación Mastocitosis indolente A) Sólo cutánea .Urticaria pigmentosa (UP) .Mastocitosis cutánea difusa .Mastocitosis cutánea eritrodérmica .Mastocitoma .Telangiectasia macular eruptiva persistente B) Sistémica .Médula ósea .Gastrointestinal .Sistema óseo .Hepatoesplenomegalia .Linfadenopatía .:t UP

4. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Mastocitosis Clasificación 2) Enfermedad hematológica: determina el curso de la enfermedad. Mieloproliferativa B) Mielodisplásica 3) Leucemias de células mastoides: sobrevida limitada a pesar de la terapia. 4) Mastocitosis linfadenopática con eosinofilia (:!: UP) (Mastocitosis agresiva)

5. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Proliferación clonal de las células mastoides secundaria a un aumento de la función de la proto-oncogén c-KIT Es considerado un trastorno mieloproliferativos clonal El gen c-kit codifica un tipo de transmembrana III de la tirosina quinasa que es el receptor del factor de células madre (SCF) Mastocitosis del adulto

6. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations .

7. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations C-KIT La proteína posee: -Dominio extracelular de fijación de ligando, compuesto por cinco regiones Ig -Dominio de transmembrana -Dominio intracelular regulador negativo juxtamembrana -Proteína citoplásmica división de la tirosina quinasa de dominio de una inserción en la adenosina trifosfato de las regiones de unión y fosfotransferasa

8. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations C-KIT Las dos isoformas en KIT difieren en la presencia o ausencia de cuatro aminoácidos (GNNK + ò -) en el región de la juxtamembrana del dominio extracelular Normalmente, el GNNK – es la forma predominante

9. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations C-KIT Se han encontrado una variedad de mutaciones No está claro cómo la heterogeneidad en las mutaciones de c-KIT están involucradas en la mastocitosis del adulto  diversidad de presentaciones clínicas. Mayoría pacientes con mastocitosis de inicio en adultos se han reportado tener la mutación D816V y menos frecuente V560G Son mutaciones constitutivamente activas de c-KIT  proliferación clonal

10. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations C-KIT KIT está implicado en otros trastornos proliferativos  Tumores del estroma gastrointestinal (GIST)  eficaz tto con Mesilato de Imatinib GIST  la mayoría de las mutaciones se encuentran dentro de el dominio intracelular juxtamembrana. La ubicación de la mutación es importante: dominio fosfotransferasa (D816V)  resistencia espontánea a imatinib mesilato, como en la mayoría de las mastocitosis de inicio en adultos

11. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Mastocitosis . La mutación D816V de c-KIT, que se encuentra dentro y activa el dominio kinasa, se asocia frecuentemente con mastocitosis en el adulto Estudios anteriores de niños con mastocitosis: Longley et al., 1996; Büttner et al., 1998  no encontraron esta mutación Longley et al., 1999  encontró esta mutación en el 7%: Yanagihori et al., 2005  64,3% Verzijl et al., 2007  25%: Estudios sobre el papel de las mutaciones de c-KIT en la mastocitosis la infancia se han centrado en el codón 816 e incluyeron relativamente pocos pacientes

12. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Mastocitosis . Objetivo: Examinar la asociación de mutaciones de c-KIT con la mastocitosis de inicio en la infancia

13. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Materiales y métodos Pacientes Estudio clínico multicéntrico Px con Inicio en la infancia de mastocitosis cutánea Edades 0 – 16 años Signo de Darier positivo y confirmado por histologia Registro clínico específico: tipo, historia familiar, y examen clínico Muestras de biopsia de una lesión cutánea

14. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Materiales y métodos Pacientes Tipo de mastocitosis: Mastocitoma: una a tres placas elevadas o nódulos, marrón rojizo. Urticaria pigmentosa: máculas, pápulas, nódulos, distribución aleatoria, marrón rojizo Mastocitosis cutánea difusa: infiltración difusa de la piel por los mastocitos y eritema mayor, con vesículas frecuentes Mastocitosis sistémica: pruebas cutáneas y extracutáneas de infiltración por los mastocitos

15. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Materiales y métodos Screening de la mutación El ARN total fue extraído de las muestras de biopsia cutánea ARN a través de transcripción inversa  ADNc  secuencia que codifica c-KIT se amplio por PCR Determinaron las mutaciones

16. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Materiales y métodos Determinación de la relación de isoforma GNNK / GNNKþ (S / L) Wild-type (tipo salvaje) y las isoformas mutantes de c-KIT, fueron simultáneamente detectados, utilizando primes (cebadores) fluorescentes La isoforma corta (GNNK) produjo un fragmento 404-bp, y la isoforma larga (GNNKþ) produjo un fragmento de 416-pb. La relación de corto a largo de las isoformas (S / L) fue calculada para cada paciente, muestras tanto de tipo salvaje y los alelos mutados.

17. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Materiales y métodos Análisis de ADN genómico Fue purificado de la sangre utilizando el ADN QIAamp Blood Mini Kit Amplificado con cebadores intrónicos Inmunoprecipitación y Western blotting Las células cebadas fueron transitoriamente transfectadas con los plásmidos Expresión de c-KIT tipo salvaje o mutantes Tratados con o sin 250 ng / ml 1 SCF

18. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Materiales y métodos Análisis estadístico Estadística descriptiva, números, y las tasas para las variables categóricas y discontinuas Elementos de distribución paramétricas y no paramétricas para las variables continuas. La correlación entre los fenotipos y genotipos fue examinado por la comparación de las frecuencias utilizando W2-test o prueba exacta de Fisher y mediante la comparación de las medias mediante t de Student o el test de Mann-Whitney U-test.

19. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Características clínicas de los pacientes 65 pacientes con mastocitosis de inicio en la infancia. Formulario completo  54 pacientes Detección de mutación  50 casos Edad media: 7,0 ± 4,7 años. 38 (58%) hombres y 27 (42%) mujeres, con igual distribución de las diferentes formas de mastocitosis Tipo de mastocitosis: UP 80%, mastocitoma 11%, y MCD 9%.

20. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Resultados .

21. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Características clínicas de los pacientes 13% de los casos presentaba historia familiar Edad de inicio: media 3,0 ± 3,5 años Antes de los 2 años  75% Entre los 3 y 9 años  13% Alrededor de 14 años  12% Niveles séricos de triptasa determinada en 17 casos  normal

22. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados

23. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Análisis de codón c-KIT 816 29 niños (58%)  secuencia de tipo salvaje (WT) (Asp) en el codón 816 18 niños (36%)  mutación D816V 2 niños (4%)  mutación D816Y (MS) 1 niño (2%)  mutación D816I

24. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Identificación de mutaciones en otros codones 58% pacientes carecían de los cambios en el codón 816 Se identificaron varias mutaciones nuevas en c-KIT: Exón 8 1 niño (2%)  Inserción de FF en el codón 419 (InsFF419) 7 niños (16%)  delección única de D419 1 niño (2%)  2-supresión BP con un 1-sustitución de BP entre los codones 417-419 1 niño (2%)  sustitución de una cisteína en el codón 443 con una tirosina (C443Y)

25. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Identificación de mutaciones en otros codones Exón 9 1 niño (2%)  sustitución de una serina en el codón 476 con una isoleucina (S476I) 5 niños (10%)  duplicación interna del tándem (ITD) 5 niños (10%)  sustituciones K509I Exón 10 14 pacientes (28%)  sustitución en el codón 541 (M541L)

26. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados 43 de los 50 pacientes (86%)  mutaciones en el c-KIT.

27. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Identificación de mutaciones en otros codones Polimorfismo KIT se informó en la mastocitosis y en el población normal, y parece mejorar la respuesta a la sólo los bajos niveles de SCF Para evaluar si la mutación M541L se encuentra en el mismo alelo como la c-KIT mutación D816V  análisis de genotipo de 11 de 14 M541L los pacientes positivos Análisis de secuencias para toda la región del c-KIT de codificación para todos los pacientes. Sorprendentemente, todas las mutaciones recientemente identificados se excluyen mutuamente de las mutaciones en el codón 816

28. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Análisis de ADN genómico para mutaciones c-KIT Las muestras de sangre estaban disponibles para 13 pacientes, haciendo posible analizar en el ADN genómico, la presencia de mutaciones de c-KIT Una de estas 13 muestras fue de un paciente con una forma familiar de la mastocitosis. Las mutaciones en c-KIT no se encontraron en ninguna de estas muestras, indicando que en estos casos, las mutaciones fueron somáticas en lugar de ser de la línea germinal.

29. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Efecto de las mutaciones sobre la actividad de KIT en células cebadas Se examinaron si las mutaciones identificadas causaban activación ligando independiente de KIT. Células cebadas transitoriamente transfectadas con plásmidos expresando WT-KIT tipo o kit que contiene las diferentes mutaciones Después del tratamiento de las células con o sin 250 ng / ml 1 de SCF, la la fosforilación de la tirosina de KIT fue evaluada por Western blot

30. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados SCF estimula la fosforilación de tirosina en KIT de tipo salvaje, y, como se esperaba, en la Mutación D816V activada constitutivamente la fosforilación de la tirosina en KIT Es importante destacar que todas las otras mutaciones probadas dieron lugar a una fosforilación ligando-independiente de la tirosina de KIT, excepto para la variante M541L

31. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Expresión de la relación de las isoformasGNNK+ y GNNK en los pacientes Las isoformas de KIT  GNNK (corto (S)) y GNNK+ (largo (L))  se ha demostrado que la señal se transmite a través de diferentes vías y tienen distintas actividades de transformación La disregulación de la relación entre la expresión de estas isoformas pueden participar en la mastocitosis. Se examinó la relación entre la expresión de las isoformas GNNK y GNNK+ (S / L)  47 pacientes. Había poco o ninguna diferencia en la relación S / L con las mutaciones

32. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Correlación genotipo-fenotipo y la comparación de los casos familiares frente a los esporádicos Análisis de las relaciones genotipo-fenotipo  44 casos No hubo correlación clara entre los fenotipos (afectación cutánea) y los genotipos de los pacientes Excepción de una ausencia de mutaciones en el codón 816 en los niños cuyos mastocitosis se produjo entre la edades de 3 y 16 años (datos no mostrados).

33. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Resultados Correlación genotipo-fenotipo y la comparación de los casos familiares frente a los esporádicos Análisis de las relaciones entre genotipo y si el caso era familiar o esporádico  48 casos No había una correlación clara entre el genotipo frente a la enfermedad esporádica o familiar Excepto por un ausencia del exón 8, 9 y 11 mutaciones en pacientes con la forma familiar de la enfermedad. Análisis de las relaciones entre fenotipo y si el caso era familiar o esporádico  no se realizó (pocos pacientes en cada categoría)

34. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations Se analizaron la secuencia de codificación completa de ARNm c-KIT de las lesiones cutáneas de 50 niños entre 0 y 16 años de edad con mastocitosis esporádica o familiar. 86% de los pacientes tenían mutaciones en el c-KIT. La mutación estaba presente en D816V  35% de los niños, incluidos dos de los cuatro niños con la forma familiar de la enfermedad (2  D816Y y 1  D816I) 44% de los niños tenían mutaciones en los exones 8, 9, y 11, que eran mutuamente excluyentes de las mutaciones del codón 816. Todas los mutaciones detectadas activadas del c-KIT tirosina quinasa. No encontraron ninguna correlación entre fenotipo-genotipo, las isoformas S/L o entre el genotipo y las formas familiares o esporádicos Discusión

35. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations CONCLUSIÓN A pesar de la elevada tasa de regresión espontánea, la mastocitosis de inicio en la infancia suele ser una enfermedad clonal asociada con la activación de mutaciones en el c-KIT

36. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations

37. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations

38. Pediatric Mastocytosis and c-KIT Mutations . Conflicto de intereses Los autores afirman no existe ningún conflicto de intereses