Este documento discute los criterios para seleccionar y validar nuevos métodos microbiológicos, así como los requisitos regulatorios para métodos alternativos. Describe diferentes estrategias y parámetros que deben evaluarse durante la validación de métodos, incluyendo exactitud, especificidad, límites de detección y cuantificación. También resume los próximos cambios propuestos en los requisitos de validación de métodos en la Farmacopea de los Estados Unidos.

1. VALIDACIÓN DE
MÉTODOS
MICROBIOLÓGICOS

2. ¿BAJO CUÁLES CRITERIOS SELECCIONAR UN NUEVO MÉTODO
A IMPLEMENTAR Y VALIDAR PARA EL PROCESAMIENTO
ASÉPTICO?
Desempeño analítico o diagnóstico (exactitud, límite de
detección …).
Aceptabilidad por los órganos reguladores o clientes.
Rapidez.
Versatilidad (más de una aplicación, más de un m.o., …).
Disponibilidad y accesibilidad de reactivos, equipos,
utensilios.
Nivel de automatización de operaciones y análisis de datos.
Complejidad en el manejo, mantenimiento, necesidad de
entrenamiento.

3. ¿SE ACEPTAN MÉTODOS ALTERNATIVOS EN LA INDUSTRIA
FARMACÉUTICA?
“Se pueden usar métodos y/o procedimientos
alternativos que proporcionen alguna ventaja en
cuanto a exactitud, sensibilidad, precisión,
selectividad o adaptabilidad a la automatización o
a la reducción de datos computarizados o en otras
circunstancias especiales.“ Aunque …
Los métodos farmacopeicos siguen siendo los
válidos para arbitraje en EE.UU.
Novartis ha obtenido la aprobación regulatoria en más de 30 países para
liberar sus vacunas empleando la técnica de bioluminiscencia por ATP
Según la USP 41:

4. Los métodos estándar (farmacopeicos) se consideran
validados.
Un método específico destinado al uso en un laboratorio
específico para ensayar un producto específico debe
demostrar que es apropiado para recuperar bacterias,
levaduras y mohos en presencia del producto específico.
El técnico debe demostrar que los criterios de desempeño
del método estándar de ensayo pueden ser alcanzados
por el laboratorio antes de introducirlo en el proceso de
ensayo de rutina (verificación) y que el método específico
es apropiado para el producto específico (incluyendo
muestras positivas y negativas).

5. La FDA de los EE.UU. propuso eliminar la referencia a la
exigencia del método del ensayo de esterilidad recogido
en la Farmacopea, permitiendo el uso de un método
alternativo validado acorde a protocolos establecidos, y
que demuestre que detecta consistentemente la presencia
de m.o. viables contaminantes.

6. Verificación de los métodos analíticos en la
industria farmacéutica
La verificación de los métodos se debe ejecutar para
asegurar el cumplimiento con los requisitos regulatorios
o de la Farmacopea.
Se realiza un estudio comparativo para evidenciar la
necesidad de ejecutar alguna verificación adicional que
necesite un producto específico (análisis de brechas o gap
analysis en inglés).
Transferencia de un método analítico
Antes de la transferencia efectuar verificación y si
existieran desviaciones, investigarlas.

7. Equivalencia
Cuando los resultados de las pruebas a partir de dos
procedimientos son lo suficientemente cercanos para el
uso previsto de los procedimientos.
La demostración de la equivalencia requiere una medición
previamente especificada del grado de similitud
requerido de los resultados.

8. No inferioridad
Demostración de que el método alternativo no es peor
que el método farmacopeico en más de una cantidad
pequeña previamente especificada.
Esta cantidad se conoce como margen de no inferioridad
o δ.
El objetivo es demostrar que un producto nuevo no es
inaceptablemente peor que uno anterior.

9. Adecuación al propósito:
 Grado en que la aplicabilidad de un método se
ajusta a los criterios o requerimientos
acordados entre el analista y el usuario final
(cliente) que hace uso de los informes o datos
generados a través de un método de ensayo.
 Adaptación de un método para un fin previsto.

10. Idoneidad para el fin previsto:
La medida en que los datos obtenidos en un proceso
de medición permiten al usuario adoptar decisiones
correctas, tanto desde el punto de vista técnico como
administrativo, para alcanzar el fin establecido.
 Cada material de ensayo debe ser evaluado para
verificar su potencial interferencia o por la
posibilidad de obtener resultados erróneos (falsos
positivos y falsos negativos).
 Interferencia de residuos de células, m.o. muertos,
células de mamíferos, ….

11. Aplicabilidad:
 Los analitos, matrices y concentraciones para
los cuales puede utilizarse satisfactoriamente
un método de análisis con el fin de determinar
su conformidad con una norma.
Aptitud del método:
 Se ensaya sólo exactitud y precisión
 Se ejecutan tres pruebas independientes

12. ALCANCE DE LA VALIDACIÓN DE MÉTODOS ANALÍTICOS
MICROBIOLÓGICOS ALTERNATIVOS SEGÚN LA
FARMACOPEA DE EE.UU.
Capítulo 1223: Validación de métodos microbiológicos
alternativos.
Capítulo 1223.1 Validación de métodos alternativos para
valoraciones microbiológicas de antibióticos.

13. Futuro del Capítulo 1225: Validación de procedimientos
del compendio.
Según las Buenas Prácticas de Manufactura, se requiere
que los métodos empleados para asegurar el
cumplimiento de las especificaciones de los productos
farmacéuticos con las especificaciones establecidas, deben
cumplir con los estándares de exactitud y fiabilidad.

14. Capítulo 1225: Validación de procedimientos del
compendio.
NUEVO ENFOQUE: Análisis sistemático de tendencia del
desempeño y necesidad de optimizar y revalidar.
Se espera que entre el 201 y el 2020 se complete la
redacción de el desarrollo de Métodos Rápidos
Farmacopeicos de ensayos de Esterilidad.

15. Capítulo 1226: Verificación de procedimientos
farmacopeicos.
Para procedimientos farmacopeicos que se llevan a cabo
por primera vez para lograr resultados aceptables con el
personal, equipo y reactivos disponibles.

16. USP 41. Capítulo 1210: Métodos Estadísticos para la
Validación de Procedimientos Analíticos.
• Entrada en vigor en el 2018.
• Complemento del capítulo <1225> Validación de
métodos Farmacopeicos.
• Aplicable a métodos farmacopeicos y a una variedad de
otros métodos analíticos.
• Incluye: exactitud, precisión, rango, límite de
detección y cuantificación y linealidad.

17. USP Capítulo 1220: “Lifecycle Management of Analytical
Procedures” (Ciclo de vida del procedimiento analítico).
• Debe entrar en vigor en el 20???. Se cuenta con el
documento: “USP PF Stimuli Paper”.
• No es mandatorio.
• Aplica el concepto de ciclo de vida a los métodos.
• Integra la validación, transferencia y verificación al
ciclo de vida del método.
• Diseño (desarrollo), calificación del desempeño y
verificación continuada del desempeño del método.
• Introduce el criterio de Perfil Analítico de Destino
(Analytical Target Profile: ATP).

18. Propuesta de nuevo capítulo en la USP: Capítulo 1200:
“Requirements for Compendial Validation” (Requisitos
para la validación de procedimientos farmacopeicos)
• Debe entrar en vigor en el 20???.
• Establece los medios para determinar la aceptabilidad de
los datos obtenidos durante la validación de un
procedimiento.
• Proporciona un enfoque sistemático y criterios que
permiten evaluar los datos de validación.
• Incluye parámetros medibles y criterios claros.
• Los procedimientos de aceptabilidad se evalúan por 6
estudios estandarizados (precisión, exactitud, especificidad,
rango, exactitud, detectabilidad y elimina LOQ y
Linealidad).

19. Capítulo 1224: Transferencia de Procedimientos
Analíticos.
• Se aplica a la transferencia de un procedimiento no oficial
de un laboratorio a otro.
• Covalidación entre dos o más laboratorios
(reproducibilidad).
• Revalidación o revalidación parcial (aceptable para la
transferencia de métodos validados).

20. REQUISITOS GENERALES PARA LA VALIDACIÓN Y
ACEPTACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
ALTERNATIVOS
Se exige comprobar la aptitud del método en dos
aspectos fundamentales:
La aptitud de la tecnología para la prueba específica
(ejemplo, si se respeta el tamaño de muestra).
Inhibición y mejoramiento que puede representar
mejoría o deterioro de la señal específica por algunos
productos.

21. COMO REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN SE DEBEN
EJECUTAR DIFERENTES ACTIVIDADES Y ANÁLISIS
(enfoque industria farmacéutica):
• Análisis de riesgo (¿se puede implementar el ejercicio?).
• Planificación de la validación (recursos, personal, …).
• Especificaciones de usuario (en especial para equipos).
• Calificación del diseño (verificación documentada de
equipos o sistemas).
• Especificaciones funcionales del diseño (documento que
describe funciones de equipos o sistemas, manuales,
guías, PNOs, …).
• Matriz de trazabilidad de los requerimientos
(documento de trazabilidad de cumplimiento de todos los
requisitos).

22. COMO REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN SE DEBEN
EJECUTAR DIFERENTES ACTIVIDADES Y ANÁLISIS
• Entrenamientos y procedimientos normalizados
operacionales (PNOs).
• Integración de sistemas.
• Pruebas de aceptación en fábrica y en el lugar (FAT y SAT).
• Calificación de la instalación (IQ).
• Calificación operativa (de la operación) (OQ).
• Validación de programas computarizados.
• Calificación del desempeño (PQ).

23.  Comprensión total del experimento de validación.
 Análisis de reducción de la cantidad de experimentos
sin detrimento de arribar a una conclusión errónea.
 Elaboración de planes de preparación de muestras,
principios generales, diseño experimental, colecta de
datos, evaluación estadística, selección de criterios de
aceptación.
 Aceptación formal del protocolo firmada.
El nuevo capítulo 1210 de la USP 41 (no es
mandatorio) propone antes de la validación:

24.  Rango aceptable de parámetros operacionales
(T, tiempo, ...) que impactan en el desempeño del
método.
 Diseño estadístico de experimentos (DOE) para
determinar la robustez.
 Definición del impacto de la tolerancia (rudeza) sobre
la precisión (analista, día, lote de reactivos, proveedor
de reactivos, instrumentos, ...) basada en análisis de
riesgo o por intuición.
 Definición del rango.
 Cantidad de laboratoristas que serán necesarios para
la lectura de resultados.
El nuevo capítulo 1210 de la USP 41 propone
incluir en la etapa pre-validación la definición de:

25. Parámetros a validar Métodos cuantitativos Métodos cualitativos
USP (1223) Ph. Eur. (5.1.6) USP (1223) Ph. Eur. (5.1.6)
Exactitud SI SI NO Puede,
sustituyendo al
límite de detección
Precisión SÍ SÍ N0 NO
Especificidad SÍ SÍ SÍ SÍ
Límite de detección SÍ SI/NO SÍ SI/NO
Límite de cuantificación SÍ SÍ NO NO
Linealidad SÍ SÍ NO NO
Rango (intervalo) SÍ SÍ NO NO
Tolerancia (rudeza) SÍ SÍ (precisión
intermedia)
SÍ NO
Robustez SÍ SÍ SÍ SÍ
Equivalencia SÍ SÍ SÍ SÍ
Repetibilidad SÍ SÍ SÍ SÍ
DIFERENTES REQUISITOS EN DIFERENTES BLOQUES

26. PRÓXIMOS REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN DE
MÉTODOS PARA MEDICAMENTOS
Panel de expertos de la USP (Febrero 2016)
Prioridad alta, media y baja para requisitos del usuario
para incluir en la USP los métodos rápidos de esterilidad .
 Especificidad.
 Disponibilidad de instrumentos y reactivos.
 Disponibilidad de estándares de referencia.
 Integridad de los datos.
 Facilidad del uso/simplicidad del ensayo y de la
interpretación de resultados.
 Bajas tasas de falsos positivos y negativos.
 Límite de detección.
 Idoneidad del método.

27. Panel de expertos de la USP (Febrero 2016)
 Seguridad para el paciente mejorada.
 Aceptabilidad regulatoria.
 Robustez y confiabilidad del equipamiento.
 Preparación de muestras.
 Cantidad de muestras, ej. Número mínimo de
artículos a ensayar y cantidad por contenedor.
 Tiempo en obtener el resultado.
 Manejo del material en condiciones asépticas
(sistemas cerrados o abiertos).
PRÓXIMOS REQUISITOS PARA LA VALIDACIÓN DE
MÉTODOS PARA MEDICAMENTOS

28. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
ESTRATEGIAS PARA MEDICAMENTOS
Enfoque No 1:
 Cada m.o. en soluciones seriadas con un
inóculo ajustado para alcanzar que en el 50 %
de los casos se detecte crecimiento en el
método de referencia.
 Cada método se ensaya con varias réplicas.
 Análisis estadístico con prueba de
Chi-cuadrado.

29. Enfoque No 2:
 Método de NMP.
 Para series decimales: en el rango 10-1 a 10-2.
 Para series de diluciones al doble de 5 a 10-1.
 Para ambos métodos 5 réplicas en cada una de
las 3 diluciones.
 Las diluciones deben garantizar al menos una
dilución positiva y una negativa.
 Análisis estadístico con prueba de Chi-cuadrado.
PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
ESTRATEGIAS PARA MEDICAMENTOS

30. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
OPCIONES PARA DEMOSTRAR EQUIVALENCIA
PARA MEDICAMENTOS
PROCEDIMIENTO ACEPTABLE: no significa equivalencia,
indica que el método alternativo cumple con el
desempeño mínimo o aceptable (inóculo estándar,
material de referencia, rango de m.o. para el recobrado o
cierto nivel de ATP).
EQUIVALENCIA DEL DESEMPEÑO: resultados
equivalentes o superiores del nuevo método vs. el
existente (exactitud, precisión, especificidad, límite de
detección, límite de cuantificación, robustez, rudeza).
Para algún parámetro puede no alcanzarse la
equivalencia.

31. PROTOCOLO DE VALIDACIÓN
OPCIONES PARA DEMOSTRAR EQUIVALENCIA
PARA MEDICAMENTOS
EQUIVALENCIA DE LOS RESULTADOS: similar al de
EQUIVALENCIA DEL DESEMPEÑO, pero se exige que el método
alternativo debe brindar resultados numéricos equivalentes o
mejores.
No se puede ensayar la misma muestra por los dos métodos, lo
que implica que se debe mostrar un valor de tolerancia.
EQUIVALENCIA DE LAS DECISIONES: similar a la EQUIVALENCIA
DE LOS RESULTADOS, pero se exige que los resultados aprobados
o reprobados sean comparados en frecuencia.
Se puede emplear el método de NMP para análisis cualitativos.
Para evaluar instrumentos se aplica la hipótesis de inferioridad
de una sola cola.

32.  Se utilizan primero cultivos puros.
 Se realizan los ensayos de ambos métodos en paralelo.
 Se emplean diseños experimentales aleatorizados.
 Número considerable de réplicas.
Criterios de aceptación: según pruebas estadísticas.
EQUIVALENCIA: medida de cuán similares son los
resultados del ensayo con respecto al método que se
pretende sustituir.
EQUIVALENCIA PARA MÉTODOS SEGÚN USP 40

33.  Se debe demostrar que los métodos alternativos
producen resultados equivalentes o mejores que el
método de referencia para cualquier atributo de
calidad dado.
 Se ensambla la evidencia estadística para demostrar
la equivalencia o, en términos estadísticos, la no
inferioridad.
 Sin embargo, esto puede no ser posible cuando los
dos métodos generan distintas señales.
.
EQUIVALENCIA PARA MÉTODOS SEGÚN USP 40

34. Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP 40
.
Equivalencia de las decisiones
Los resultados obtenidos mediante los procedimientos
de ensayos de esterilidad son indicadores de la
presencia o ausencia de m.o. en la muestra que
generan una DECISIÓN.
Para demostrar la aceptabilidad del procedimiento alternativo
con respecto al procedimiento microbiológico vigente, el
laboratorio debe demostrar que el nuevo procedimiento es
tan bueno o mejor que el procedimiento vigente en términos
de la capacidad para detectar la presencia de m.o.

35. ENFOQUE 1: USO DE RESULTADOS DE PRESENCIA Y AUSENCIA
Se basa en demostrar equivalencia de las decisiones
La hipótesis de no inferioridad para este enfoque es que la
proporción de muestras que producen una señal para el nuevo
procedimiento (PN) es no menor que alguna cantidad (Δ >O)
menor que la proporción para el procedimiento farmacopeico
vigente (PC).
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP
.
Resultado = PN – PC ≥ - Δ
Δ – margen de no inferioridad, por lo general = 0,20
Se calcula un intervalo de confianza inferior de - 0,20 para un
95 % de confianza.
PN ≥ PC - 0,20
P- proporción de muestras positivas al nivel de biocarga estudiado

36. Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP 40
.
 Si el laboratorio concluye que su nuevo
procedimiento es menos sensible que el
procedimiento farmacopeico, se requerirá un
mayor número de muestras para mantener
estos niveles de potencia.

37. Codificación de parámetros para
MUESTRAS INDEPENDIENTES (no apareadas):
 NA muestras analizadas por el método alternativo.
 NC muestras analizadas por el método de referencia (otras).
 XA muestras positivas por el método alternativo.
 XC muestras positivas por el método de referencia.
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP
.

38. Donde: R - cociente de las varianzas en las cuales se determina
la potencia.
ρ̂A = XA/NA
ρ̂C = XC/NC
Θ = NC/NA
a = 1 + Θ
b = - [R(1 + Θ ρ̂C) + Θ + ρ̂A ]
c = R(ρ̂A + Θ ρ̂C)
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP 40
.

39. Concluir la no inferioridad si Z > zα donde zα es el
punto porcentual superior a de una distribución
normal estándar.
ρ̂A =
ρ̂C = ρ̂A/R
V = ρ̂A (1- ρ̂A) + R2 ρ̂C (1 - ρ̂C)
NA NC
Z = (ρ̂A - Rρ̂C)
𝐕
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP 40
.
−𝒃 − 𝒃 𝟐 − 𝟒𝒂𝒄
𝟐𝒂

40. Para muestras apareadas:
 Se construye tabla 2 x 2
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP
.
Alternativo
Estándar Total por
filas
Positivos Negativos
Positivos X11 X10 XA
Negativos X01 X00 N - XA
Total por
columna XC N - XC N

41. Se concluye la no inferioridad si Z > zα
Donde: zα es el punto porcentual superior a de una
distribución normal estándar.
L = [X10 – R X01 + (1 – R)X11]/N
V = XA(X10 + X01)/XC
3
Z =
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP
.
Alternativo
Estándar
Total por
filas
Positivos Negativos
Positivos X11 X10 XA
Negativos X01 X00 N - XA
Total por
columna XC N - XC N
𝐋
𝐕

42.  Uso de procedimientos estándar para NMP para cada
una de las N muestras.
 Idealmente, se usan las mismas muestras para los
dos procedimientos, aunque no es estrictamente
necesario.
ENFOQUE 2: COMPARACIÓN DE RESULTADOS DE NMP
Convierte resultados cualitativos en cuantitativos.
Equivalencia para Procedimientos Microbiológicos
Cualitativos Alternativos según la USP 40
.
μA – μC ≥ log(R) o antilog(μA – μC) ≥ R
Donde: μA y μC: medias en la escala logarítmica para los
procedimientos alternativo y farmacopeico, respectivamente.

43.  Para cada producto nuevo que se va a analizar usando el
método microbiológico alternativo validado, realizar la
prueba de aptitud conforme a lo descrito en los métodos de
prueba general.
 Número de unidades y cantidad prescrita de muestra
requerida.
 Determinar la sensibilidad para determinar la ausencia de un
efecto del producto que obstruya la señal del método.
APTITUD: demostración de la falta de mejoría o
inhibición por parte del producto de la señal generada
por el método.
APTITUD DEL MÉTODO SEGÚN USP

44.  Para métodos cualitativos, se determina la recuperación de
organismos de desafío según se indica en los capítulos
(62), (71) y (1227).
 Después de que un método alternativo ha demostrado ser
equivalente a la prueba farmacopeica con un producto,
no es necesario repetir los parámetros de equivalencia
para cada producto nuevo; únicamente es necesario
verificar la aptitud del método para cada producto
adicional.
APTITUD DEL MÉTODO SEGÚN USP 40
.