1. La técnica de PCR en tiempo real permite la detección y cuantificación del virus de la psorosis de los cítricos mediante la medición de la fluorescencia emitida durante la amplificación del ARN viral. 2. Se implementó un protocolo de RT-PCR en tiempo real para detectar el virus en hojas de naranja afectadas por psorosis en el estado de Nuevo León, México. 3. Los resultados permitirán determinar la concentración viral presente en las muestras y monitorear la enfermedad.

1. Julián Danilo Bonilla
070100062009
Germán Andrés Caicedo
070150052009

2. Técnica de laboratorio
usada para reproducir
segmentos ácidos
nucleídos mediante un
proceso cíclico, que Cuantificación
genera gran cantidad extremadamente difícil,
de copias que pueden ya que la PCR da origen
ser usadas en estudios a la misma cantidad de
o análisis posteriores producto
independientemente de
la cantidad inicial de
moléculas de DNA
presente en las muestras
- Higuchi et al
- Producto es monitoreado durante el
curso de la reacción y no en el punto
final (end point)
- Sondas fluorescentes

3. PCR En Tiempo
Real
Técnica de amplificación y cuantificación de ADN y
ARNm que utiliza tecnologías fluorescentes para
evidenciar la amplificación de una secuencia corta
sistemas
fluorescentes
sondas de
agentes
hidrolisis y de
intercalantes
hibridación
Sondas
sondas Taqman molecular Sondas FRET
Beacons

4. Fluorocormos que aumentan su fluorescencia
cuando se unen a una doble cadena de DNA
SYBR Green

5. Facilita las condiciones Unión inespecífica a
de optimización y es cualquier doble cadena
mas barato que las de DNA y también a los
sondas especificas dímeros de cebadores
(fluorescencia inespecífica)

6. Desventajas Soluciones
Fundamento: Buen diseño de los
Curva De Fusión cebadores y
condiciones optimas
(melting curve) de reacción
Diferentes moléculas de DNA de doble cadena se
abren a diferente temperaturas
Factores
Concentración de La longitud de Estructura Factores químicos
que hacen parte de
guanina y fragmento de secundaria y los componentes de
citosina amplificación terciaria reacción

7. 1. Las sondas Taqman
2. Sondas Molecular Beacons
3. Sondas FRET

8. Oligonucleótidos lineales que son etiquetados con un fluorocromo
donador (reporter) en la porción 5’ como FAM (6-carboxifluoresceína) y un
aceptor (quenber) en la porción 3’ como TAMRA (6-
carboxitetrametilrodamina).
Dependen de la actividad 5’ nucleasa de la Taq ADN polimerasa para su
ruptura durante la síntesis de una nueva hebra.

9. Cada
amplicon
nuevo
sintetizado
Señal emitida
se genera
Antes que los
fragmento cebadores
de
amplificación
o secuencia
blanco
El lugar en
el que
anilla la
sonda

10.  Oligonucleótidos de cadena simple
 zona de apareamiento de bases interna
 No dependen de su hidrólisis
Forman una
para generar la señal horquilla
fluorescente (harpin)

11. La emisión de
fluorescencia se da
durante la etapa de
anillamiento
la sonda se linealisa
lo que permite que
los fluorocromos se
separen
el donador emita su
señal la cual es
detectada por el
equipo.

12. Se compone de dos Una de la sonda lleva una
sondas que se unen molécula donadora en su
específicamente a porción 3’ y la otra lleva un
secuencias del ADN aceptor en su porción 5’
blanco.

13. se da la trasferencia de La fluorescencia
energía hacia el aceptor se excitar a la Cuando la emitida es
que absorbe la energía molécula directamente
sondas se anillan
emitida por el donador y la donadora en una proporcional al
longitud de onda al ADN blanco,
emite en otra longitud de estas se unen aumento de
determinada
onda ADN en cada
ciclo

14. En PCR en tiempo real se deben manejar una serie de
conceptos relacionados con el análisis e interpretación de
graficas generadas por el software luego de un proceso de
amplificación.
Fase inicial o
background
La curva de Fase
Componentes
amplificación exponencial
Fase de meseta
o plateau

16. • Nivel basal de la fluorescencia emitida
• Definido durante los primeros ciclos de la PCR
Línea base • Programada en cada software de PCR en tiempo real
(baseline)
• Es el punto de corte de la fluorescencia por encima de la línea base
Umbral
• A partir de esta línea de corte se calcula los valores de Ct
(threshold)
• Refleja el punto en el cual un numero suficiente de amplicones se
ha acumulado dentro de la reacción y se presenta un crecimiento
Ct o CP exponencial
(threshold cycle)

17.  Parámetro que permite establecer la
confiabilidad de la estimación del numero de
copias y se debe calcular para cada reacción.
 Directamente en el software.
Debe estar entre el 90 y el 100%
Doble de moléculas de DNA que en
el ciclo anterior

18. cuantificación
relativa
(expresión de cuantificación
un gen absoluta
determinado (numero
en un exacto de
momento copias de un
estableció del gen)
ciclo celular)
Establecer un
numero relativo
de copias
cuando se
utiliza un gen de
referencia.

19. Método mas sensible para
la detección y cuantificación
de niveles de expresión de
genes a partir de muestras
pequeñas de tejido
Depende de una RT-PCR en
tiempo real (retro
transcripción o kinetic RT-
PCR)
mide el cambio relativo en los
niveles de expresión de
ARNm y se basa en comparar
los niveles de expresión de
una muestra problema frente
a un gen constructivo

20. Se utiliza una curva de calibración,
la cual se realiza con diluciones
seriadas de un estándar con una
concentración conocida
La curva estándar produce una relación lineal
entre Ct y la concentración inicial de ARN o
ADN, lo que permite la determinación de la Son altamente reproducibles y
concentración de muestras desconocidas con permiten generar datos
base a sus valore de Ct específicos y sensibles.

21. Control sin DNA
Control Negativo de Control Positivo de
(NTC) con solo
Extracción Reacción
mezcla de reacción.
• Muestra negativa a • Muestra positiva a • Es muy importante
la que se realiza la que se realiza incluir los NTCs
todo el proceso de todo el proceso de siempre en cada
extracción. extracción. reacción para
asegurar que lo
• No debe generar • Debe generar
que se esta
curva de curva de
midiendo no
amplificación. amplificación.
corresponde a
algún tipo de
contaminación.

22.  El equipo necesario:
1. Termociclador
2. Lector de fluorescencia
3. Filtros
4. Fuente lumínica (lámpara halógena, LED o
un laser)

23. TERMOCICLADOR
• Permite el análisis de los datos para reportar
la cuantificación, análisis de curvas de fusión
y la discriminación alélicas
LECTOR DE FLUORESCENCIA
• Es una seria de componentes que colectan la luz
a través de varios dispositivos ópticos que
permiten el paso y la salida de la luz visible sobre
el tubo de reacción gracias a un grupo de filtros
que detectan todo el rango de la luz visible.
FUENTE LUMINICA
• Genera las longitudes de onda requeridas
para excitar los fluorocromos utilizados en la
PCR

24. • Identificar pequeñas • La utilización de las • En la detención de
mutaciones o curvas de fusión para el patógenos de
polimorfismos en genes genotipaje, ya que cada importancia medica, con
causantes de fragmento generado gran énfasis en ensayos
enfermedades tendría diferente tamaño cuantitativos para virus,
heredadas. y por ende, diferente Tm. bacterias, levaduras y
parásitos protozoos.
1. 2. 3.

25. • En oncología ya que se • en la detección de
requiere de pequeñas mutaciones puntuales,
cantidades de tejido y es diagnostico, seguimiento
útil en ensayos de y respuesta al
amplificación y expresión tratamiento.
de genes, duplicación y
delección genética
4. 5.
• Monitorización para la
seguridad de alimentos,
bioterrorismo, en la área
de biotecnología, etc.
VIDEO
6.

26.  Permite obtener resultados reproducibles,
confiables, rápidos y ofrece gran cantidad de
aplicaciones.
 Facilita la cuantificación de ADN y ARN sea mas
precisa ya que se utilizan curvas estándar y los
resultados se basan en la obtención de los
valores de Ct
 Algunas complicaciones se pueden solucionar si
se tiene un experimento diseñado y realizado
rigurosamente y con lo controles adecuados.

27. Detección cuantitativa del virus psorosis de cítricos
mediante RT–PCR tiempo real
Quantitative diagnosis of citrus psorosis virus by real time
RT–PCR
Implementar un protocolo de RT–PCR tiempo
real para la detección del CPsV y determinar
concentración viral en hojas de árboles de
naranja Mars afectados por psorosis en el
Estado de Nuevo León (NL), México.