El documento describe los pasos del protocolo de extracción de ARN total a partir de una muestra de hígado, la síntesis de ADNc y la cuantificación del ARN extraído. Incluye la preparación de reactivos, extracción del ARN usando una columna, cuantificación espectrofotométrica, síntesis de ADNc y almacenamiento de las muestras para PCR.
Un examen general de orina, también llamado análisis de orina o uroanálisis, consiste en una serie de exámenes efectuados sobre la orina, constituyendo uno de los métodos más comunes de diagnóstico médico.1 Un examen completo consta de varias determinaciones: un examen macroscópico, un examen físico-químico, un examen microscópico y, si fuera necesario, un urocultivo. El análisis físico-químico se puede efectuar mediante tiras reactivas cuyos resultados se leen de acuerdo a los cambios de color.
Un examen general de orina, también llamado análisis de orina o uroanálisis, consiste en una serie de exámenes efectuados sobre la orina, constituyendo uno de los métodos más comunes de diagnóstico médico.1 Un examen completo consta de varias determinaciones: un examen macroscópico, un examen físico-químico, un examen microscópico y, si fuera necesario, un urocultivo. El análisis físico-químico se puede efectuar mediante tiras reactivas cuyos resultados se leen de acuerdo a los cambios de color.
La curva de calibración es un método de control de calidad por el cual aseguramos las correctas lecturas de analitos en la bioquímica clínica. En este trabajo cuantificamos los niveles de creatinina en sangre.
La curva de calibración es un método de control de calidad por el cual aseguramos las correctas lecturas de analitos en la bioquímica clínica. En este trabajo cuantificamos los niveles de creatinina en sangre.
¿Qué son las pruebas de PCR? Las pruebas de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) son una forma rápida y muy precisa de diagnosticar ciertas enfermedades infecciosas y cambios genéticos. Las pruebas detectan el ADN o el ARN de un patógeno (el organismo que causa una enfermedad) o células anormales en una muestra.
La prueba de proteína C reactiva mide el nivel de proteína C reactiva (PCR) en una muestra de sangre. La PCR es una proteína producida por el hígado. Normalmente, usted tiene niveles bajos de proteína C reactiva en su sangre. Su hígado libera más PCR en su torrente sanguíneo si usted tiene inflamación en su cuerpo. Los niveles altos de PCR pueden significar que tiene un problema de salud serio que causa inflamación.
La inflamación es la manera en que el cuerpo protege los tejidos y ayuda a sanar heridas, infección u otras afecciones. La inflamación puede ser aguda (repentina) y temporal. Por lo general, este tipo de inflamación es útil. Por ejemplo, si usted se corta la piel, puede tornarse roja, hinchada y causar dolor por unos días. Estos son síntomas de inflamación. La inflamación también puede ocurrir dentro del cuerpo.
Si la inflamación dura demasiado, puede dañar tejidos sanos. A esto se le llama inflamación crónica (de larga duración). Las infecciones crónicas, ciertos trastornos inmunitarios y otras afecciones pueden causar inflamación crónica dañina. La inflamación crónica también puede suceder si sus tejidos se dañan o irritan repetidamente, por ejemplo, por fumar o por químicos en el ambiente.
Una prueba de proteína C reactiva puede mostrar si usted tiene inflamación en su cuerpo y cuánta tiene. Sin embargo, la prueba por sí misma no determina qué está causando la inflamación o que parte del cuerpo está inflamada.
Análisis de calcio, magnesio y dureza total en aguas por titulación con EDTAALEXA CASTELO LOPEZ
Analizar calcio, magnesio y dureza total en aguas, mediante el método de complejometría, utilizando EDTA.Na2 para interpretar a que clasificación le pertenece, en base a su concentración en ppm y en mili equivalentes por litro.
2. Etapas
Hígado (Muestra)
1) Extracción de RNA total 1
RNA total
2) Síntesis de cDNA 2
cDNA
3
3) PCR
Producto PCR
3. 1) Extracción de RNA total
Materiales necesarios (esterilizados)
- Tubos eppendorf de 1 ml
- Tubos eppendorf de 0.6 ml
- Tubos eppendorf de 0.2 ml
- Puntas amarillas (p200)
- Puntas azules (p1000)
- Puntas blancas (p20 y p10)
- Puntas cortadas (p200)
- Vaso precipitado
4. 1) Extracción de RNA total
Previo a iniciar la técnica de purificación debemos
asegurarnos de:
Limpiar bien el sector (mesón y materiales) donde se
va a realizar la técnica con detergente, alcohol y
solución RNAsa ZAP en spray.
Calentar la placa térmica hasta 80°C
Preparar gel de agarosa al 1%
(Sugerencia: 0,3 gr. de agarosa en 30 ml
de TAE 1x + 2 ul de Bromuro de etidio)
T°
5. Protocolo
1) Muestras* Nitrógeno líquido
2) Agregar 100 ul de Solución de Lysis a tubo eppedorf de 1 ml (fondo cónico)
3) Extraer un trozo de muestra de hígado (-80°C, 2-3 mm de diámetro, 15 mg)
4) Homogenizar con bagueta hasta obtener un macerado (enjuagar pinza y bagueta
con Agua DEPC después de ser utilizada con cada muestra).
Luego agregar 100ul más de la misma solución de lysis y continuar con la
homogenización. Dejar en hielo y centrifugar a 10000 rpm por 1 minuto.
6. Protocolo
5) En un segundo tubo eppendorf de 1 ml; agregar 200ul de etanol frío al 64%.
6) Extraer el sobrenadante del lisado con punta cortada y agregarlo a los tubos
con etanol (mezclar lento por inversión).
7) Colocar las columnas (filtro) en tubos de recolección. Humedecer con
solución de lisis o con etanol 64% (1 gota aprox.) el filtro de la columna.
*Calentar solución de elusión a 80°C (se utilizan 60uL por muestra)
8) Agregar al filtro con punta cortada la mezcla obtenida en el paso 6 (siempre
dejándola en hielo) y centrifugar a 10500 rpm durante 30 segundos, luego
eliminar el filtrado.
7. Protocolo
9) Agregar a la columna 700ul de la solución de lavado #1 (Wash Solution 1) y
dejar en hielo.
10) Centrifugar a 10500 rpm por 30 segundos. Eliminar el filtrado.
11) Agregar 500ul de solución # 2/3 (Wash Solution Concentrate).
12) Centrifugar a 10500 rpm por 30 segundos. Eliminar filtrado.
13) Repetir pasos 11 y 12.
14) Secar la columna con un pulso adicional (10500 rpm por 30 seg). Eliminar
filtrado.
8. Protocolo
15) Traspasar la columna (filtro) a otro* tubo eppendorf de recolección y
agregar 25ul de solución de elusión previamente calentada a 80°C.
16) Centrifugar a 10500rpm por 30 segundos, esta vez conservando el filtrado
(ácidos nucleicos).
17) Agregar 25 ul de la solución de elusión y volver a centrifugar a 10500rpm
por 30 segundos. También se debe conservar el filtrado.
18) Agregar 10 ul más de la misma solución de elusión y centrifugar a 10500rpm
por 30 segundos. Conservar el filtrado (contiene el RNA total).
9. Protocolo
19) Separar el filtrado en 2 tubos eppendorf con 3 ul* cada uno.
Correr en el Gel
Cuantificar RNA en Espectrofotómetro (260nm y 280nm)
Lo que queda se guarda a -80°C para ser utilizado posteriormente en la
síntesis de cDNA
10. Preparación de la muestra para determinar
integridad del RNA
5 uL de agua DEPC
2 uL de azul de bromofenol
2 uL de muestra
Cargar 9 uL de la mezcla en el gel de agarosa 1%
(30 min. / 80 Volts)
Observar en el Transiluminador UV
13. Medición de la contaminación de la muestra de
RNA con Proteínas
Blanco: 1 ml de agua bidestilada
2 uL de la muestra + 1000 ul de agua bidestilada
Diluída 500 veces
Medir la absorbancia a 260nm y 280nm.
Calcular la relación 260nm/280nm RNA/proteínas (Aceptable > 1,6).
Calcular la concentración de RNA en la muestra.
Concentración de RNA (ug/ml) = Abs 260 nm * factor de dilución (500) * 40
(ug/ml ug/ul)
14. EJEMPLO
Abs. 260nm = 0,013
[RNA] (ug/ml) = Abs260nm * 500 * 40
[RNA] (ug/ml) = 0,013 * 500 * 40
[RNA] = 260 ug/ml
260 ug 1000 ul
x 1 ul
x = 0,26 ug RNA / ul
15. 2) Síntesis de cDNA
En un tubo eppendorf de 0.2 ml, mezclar el Primer, RNA, dNTP mix y llevar a un
volumen de 12 uL con Agua DEPC:
Componente Cantidad
Primer (Random Primer)* 1 uL
RNA (10pg – 5ug)* x uL
10 Mm dNTP Mix 2 uL
Agua DEPC Llevar a 12 uL
16. El cálculo de los uL de RNA depende de la cantidad que se desee utilizar
(10pg – 5ug).
Ejemplo: x ug 1 uL
y ug z uL
x = ug calculados a partir de la absorbancia a 260 nm
y = ug elegidos para realizar la síntesis de cDNA
z = uL que se deben agregar al tubo para obtener la cantidad elegida
17. EJEMPLO
Abs. 260nm = 0,013 0,26 ug RNA / ul
ug de RNA total escogidos = 0,5 ug * (Constante)
0,26 ug RNA 1 ul Componente Cantidad
0,5 ug RNA x Primer (Random Primer) 1 uL
RNA (0,5 ug) 1,92 uL
x = 1,92 ul 10 Mm dNTP Mix 2 uL
Agua DEPC 7,08 uL
Volumen Total 12 uL
- Denaturar el RNA y los primers incubando a 65°C por 5 min.
- Poner en hielo 1
18. Preparar el Master Mix:
Componente 1 Reacción 10 Reacciones
5X cDNA Synthesis Buffer 4 uL 40 uL
0.1 M DTT 1 uL 10 uL
RNase OUT (40u/uL) 1 uL 10 uL
Agua DEPC 1uL 10 uL
ThermoScript RT (15 1uL 10 uL
units/uL)
Vortexear el 5X cDNA Synthesis Buffer por 5 seg. justo antes de usar
19. • Pipetear 8 uL del Master Mix y agregar en cada uno de los tubos que contienen el
RNA (siempre en hielo)
8 uL
Master Mix 5X*
1 2 3 4
20. Transferir los tubos a un termociclador según el siguiente programa*:
Random Primer: 25°C por 10 min.
Corresponde al Programa E29
55°C por 40 min. (R1HEXAM) del Termociclador
85°C por 5 min. Thermo
4° C por 000*
*El programa depende del primer usado (Random Primer, oligoDT, GSP)
Una vez obtenido el cDNA, guardar los tubos a -20°C para ser utilizados
posteriormente en el PCR