La RT-PCR permite detectar la amplificación de DNA durante la reacción, a diferencia de la PCR tradicional que solo detecta el resultado final. Esto hace que la RT-PCR sea más precisa y rápida, pudiendo detectar diferencias pequeñas en la amplificación. La reacción de PCR tiene tres fases: exponencial, lineal y de meseta; siendo la fase exponencial muy específica y precisa para detección.
Análisis de expresión génica en el hipotálamo humano en depresión por microdisección láser y PCR en tiempo real: la presencia de múltiples desequilibrios del receptor
La reacción en cadena de la polimerasa es una reacción enzimática in vitro que amplifica millones de veces una secuencia específica de ADN durante varios ciclos repetidos en los que la secuencia blanco es copiada fielmente.
Inventada en 1985 por KaryB.Mullis
Premio Nobel de Química, 1993
La idea básica de la técnica es sintetizar muchas veces un fragmento de ADN utilizando una polimerasa que puede trabajar a temperaturas muy elevadas, ya que proviene de la bacteria Thermus aquaticus que vive a altas temperaturas (79°C a 85°C), de ahí su nombre comercial mas conocido: taq polimerasa.
DNA molde o templado:
contiene la región que queremos amplificar.
Primers:
Secuencias cortas de DNA (oligonucleótidos) que delimitan la zona que queremos amplificar. Deben ser complementarios a cada uno de los extremos de la región a amplificar. Se sintetizan in vitro de un modo preciso para que a partir de su región 3‟, la polimerasa inicie la síntesis en dirección correcta.
Mezcla de los 4 deoxirribonucleótidos trifosfato que componen el DNA.
DNA Polimerasa: polimerasa capaz de resistir elevadas temperaturas (TaqPol)
Termocicladora: Una máquina que haga ciclos controlados de temperatura (Máquina de PCR, PCRra)
Al final de la PCR, para saber si la reacción transcurrió eficientemente, los ampliaciones son visualizados a través de una electroforesis en geles de agarosa.
PCR anidada
En esta variante de PCR, el producto de una amplificación es utilizado como molde para realizar una segunda amplificación con iniciadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada. Este tipo de PCR es altamente específica
PCR múltiple.
Se lleva a cabo la reacción de PCR tradicional, pero con mas de 2 primers, para amplificar varias regiones al mismo tiempo.
PCR in situ
Es una PCR que se realiza en preparaciones fijadas sobre un portaobjeto. Consiste en una reacción de PCR en secciones histológicas o células, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificación. Se realiza para ello una primera amplificación del ADN blanco y luego detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera puede detectarse cantidades pequeñísimas del material genético.
PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR).
Este tipo de PCR utiliza como molde inicial el ARN y se requiere de una transcriptasa inversa, para realizar la conversión del ARN a un tipo de ADN llamado ADNc.
1.er paso: retrotranscripción a partir del ARN.
2º paso: amplificación a partir de la primera hebra de ADNc.
3.er paso: PCR estándar.
PCR en tiempo real.
La PCR cuantitativa o PCR en tiempo real es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico
Huella digital genética
Test de paternidad
Detección de enfermedades hereditarias
MÉTODOS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS: “NESTED PCR O PCR ANIDADA”Carlos Joel Beltran Ube
La PCR anidada es una modificación de la PCR diseñada para aumentar la sensibilidad de la reacción del ensayo. Esta modificación consta de dos grupos de cebadores dirigidos contra la misma diana. El primer grupo de cebadores se desarrolla de la manera usual, mientras que el segundo grupo son cebadores situados internamente o anidados con respecto al primer grupo.
María Ángeles Baridon: Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicosBiocientificaSA
Presentación de María de los Ángeles Baridon: "Métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos" en el Curso Básico y Taller de PCR en Tiempo Real. HIGA Rossi La Plata, 22 y 23 de Noviembre, 2012.
Organiza: Laboratorio de Virología y Biología Molecular
H.I.G.A. R. Rossi - La Plata.
Auspicia: Servicio de Docencia e Investigación - HIGA Rossi La Plata y Comunidad Vita - Biocientífica S.A.
1. PCR EN TIEMPO REAL (Real-Time PCR) (RT-PCR) Benjamín Paz Aliaga UCSM-2004 Mientras la PCR tradicional detecta la amplificación en el punto final de la reacción con RT-PCR se detecta la amplificación mientras ocurre la reacción
8. KARY B MULLIS , EL DESCUBRIDOR DE LA PCR PREMIO NOBEL EN QUIMICA EN 1993
9. PCR EN TIEMPO REAL (Real-Time PCR) (RT-PCR) Benjamín Paz Aliaga UCSM-2004 Mientras la PCR tradicional detecta la amplificación en el punto final de la reacción con RT-PCR se detecta la amplificación mientras ocurre la reacción
Real time PCR is a kinetic approach, where you look at the reaction in the early stages while it is still linear. There are many real time machines available. This is the one we use (the BioRad Icycler IQ real time PCR instrument). The lid slides back and then we put samples in a 96-well plate format inside, so one can look at a lot of samples simultaneously. The machine contains a sensitive camera which monitors the fluorescence in each well of the 96-well plate at frequent intervals during the PCR reaction. In our case, as DNA is synthesized, more SYBR green will bind and the fluorescence will increase.
The real-time machine is connected to a computer and software on the computer is needed to run the real time PCR machine in real-time mode.
So how do we measure differences in concentration of DNA or cDNA? This graph shows a series of 10-fold dilutions of a sample. As one dilutes the sample, it takes more cycles before the amplification is detectable. The blue line here is the same sample we have been following all along. Note that although the reactions show an orderly series of curves in order of dilution as they cross the orange line, if one looks at the upper parts of the curve, they are rather variable. Thus, if we stopped all these reactions at eg 33 cycles and ran a gel, it would indicate that the blue, red and purple reactions had the same amount of amplification, even though the reactions shown by the purple and red lines differ by a factor of 100 in the amount of dna. Reactions which differed by a factor of 2 would expect to be 1 cycle apart (samples that differ by 10 would be ~3.3 cycles apart). Is there any way to check that the correct fragments were amplified? One way to do some checking on the products is to do a melting curve.
