Reconocimiento de los instrumentos

CURSO: Análisis instrumental de productos Agroind.
CICLO: VI
DOCENTE
ING. RODRIGUEZ PAUCAR Gilbert.
INTEGRANTES:
VEGA VIERA, Jhonas Abner
MUÑOZ ROJAS Andrea Gisela.
NUEVO CHIMBOTE - PERÚ
"AÑO DE LA PROMOCIÓN DE LA INDUSTRIA RESPONSABLE Y DEL COMPROMISO CLIMÁTICO"

ANALISIS INSTRUMENTAL DE
PRODUCTOS AGROINDUSTRIALES
MUÑOZ ROJAS, Andrea Gisela. VEGA VIERA, Jhonas Abner. Página 2
I. INTRODUCCION
La cromatografía es uno de los principales métodos para la separación de especies químicas estrechamente relacionadas en mezclas complejas. La cromatografía es un método físico de separación basada en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil.
En todas las separaciones cromatografías la muestra se disuelve en una fase móvil, que puedes ser un gas líquido o un fluido supercrítico. Esta fase móvil se hace pasar através de una fase estacionaria inmiscible, la cual se mantiene fija en una columna o sobre una superficie sólida. Las fases se elegir de tal forma que los componentes de la muestra se distribuyen de modo distinto entre la fase móvil y la fase estacionaria se mueven lamentablemente con el flujo; por el contrario los componentes que unen débilmente a la fase estacionaria, se mueve con rapidez. Como consecuencia de la distinta movilidad, los componentes de la muestra se separan en bandas discriminadas que pueden analizarse cualitativa y/o cuantitativa.
CROMATOGRAFÍA
La característica que distingue a la cromatografía de la mayoría de los métodos físicos y químicos de separación, es que se ponen en contacto dos fases mutuamente inmiscibles. La fase estacionaria y la móvil. Una muestra que se introduce en la fase móvil es transportada a lo largo de la columna que contiene una fase estacionaria distribuida. Las especies de la muestra experimentan interacciones repetidas (repartos) entre la fase móvil y la fase estacionaria. Cuando ambas fases se han escogido en forma apropiada los componentes de la muestra se separan gradualmente en bandas en la fase móvil. Al final del proceso los componentes separados emergen en orden creciente de interacción con la fase estacionaria. El componente menos retardado emerge primero, el retenido más fuertemente eluye al último. El reparto entre las fases aprovecha las diferencias entre las propiedades físicas y/o químicas de los componentes de la muestra. Los componentes adyacentes (picos) se separan cuando el pico que sale después es retardado lo suficiente para impedir la sobreposición con el pico que emergió antes.

Una amplia gama de selección de materiales para las fases móvil y estacionaria, permite separar moléculas que difieren muy poco en sus propiedades físicas y químicas. En un sentido amplio, la distribución de un soluto entre dos fases es el resultado del balance de fuerzas entre las moléculas del soluto y las moléculas de cada fase. Refleja la atracción o repulsión relativas que presentan las moléculas o iones de las fases competidoras por el soluto y entre sí. Estas fuerzas pueden ser de naturaleza polar, proviniendo de momentos dipolares permanentes o inducidos, o pueden deberse a fuerzas de dispersión del tipo London.
II. OBJETIVO.
- Reconocer los equipos de cromatografía e identificar sus partes: HPLC y cromatografía de gases.
- Identificar y aplicar la lógica de manejo de los equipos, así como cuidados que se deben tener antes, durante
III. CROMATOGRAFIA
Parámetros teóricos que afectan la separación cromatográfica
El comportamiento cromatográfico de un soluto puede describirse de diversas formas. Considero ahora importante introducir las definiciones de algunos términos importantes para la cromatografía en columna (ver figura 1), como son:
 Tiempo de retención, tr. El tiempo que un soluto permanece en la columna, se mide desde el momento de la inyección hasta la elusión del pico máximo. Es característico del soluto para condiciones de operación constantes. Auxiliar en la identificación de los solutos.
 Tiempo muerto, to. El tiempo requerido para eluir un soluto que no se retiene en la fase estacionaria. Tiempo que un soluto permanece en fase móvil. Representa el espacio vacío de la columna.

 Tiempo de retención ajustado, t’r. Mide el tiempo que el componente permanece en fase estacionaria.
t’r = tr - to
 Ancho a la base, Wb. Es la porción de la línea base intersectada por las tangentes al pico. Para un pico gaussiano es igual a 4. Tradicionalmente usado en el cálculo de la eficiencia del sistema.
 Ancho a la mitad de la altura, W_. Una medida más reproducible, adecuada para evaluar manualmente la eficiencia del sistema (platos teóricos).
 Número de platos teóricos (N). Cada plato teórico representa un equilibrio teórico de distribución del soluto entre las fases. El número total de platos teóricos de una columna representa el poder de separación de la columna. Una buena columna tiene un número alto de platos teóricos. Se calcula con cualquiera de las ecuaciones:
Comportamiento cromatográfico de los solutos.
- Comportamiento de retención
El comportamiento de retención refleja la distribución del soluto entre la fase móvil y la estacionaria. El volumen de fase móvil necesario para transportar la banda de soluto desde el punto de inyección, a través de la columna, hasta el detector (en el máximo del pico del soluto) se define como el volumen de retención, Vr. Se puede obtener directamente del cromatograma multiplicando el tiempo de retención correspondiente, tr, por el gasto o flujo volumétrico, Fc, expresado como el volumen de fase móvil por unidad de tiempo.
El gasto o flujo volumétrico, en términos de los parámetros de la columna, depende la sección transversal de la columna vacía, la porosidad total del relleno (empaque) de la columna y la velocidad lineal promedio de la fase móvil.

- Coeficiente de repartición
Cuando un soluto entra al sistema cromatográfico inmediatamente se reparte o distribuye entre la fase móvil y la estacionaria. Si la fase móvil se para en cualquier momento el soluto establece un equilibrio de distribución entre las dos fases. La concentración en cada fase está dada por el coeficiente termodinámico de partición (o reparto):
Donde Cs y Cm son las concentraciones de soluto en la fase estacionaria y móvil, respectivamente.
Cuando K = 1, el soluto se encuentra igualmente distribuido entre las dos fases. El coeficiente de reparto determina la velocidad promedio de cada zona de soluto, más específicamente, del centro de la zona de soluto conforme la fase móvil avanza a lo largo de la columna.
- Resolución
El grado de separación o resolución de dos bandas adyacentes se define como la distancia entre los picos (o centros) dividida entre el ancho promedio de las bandas. Si la retención y el ancho de la banda se miden en unidades de tiempo (ver figura 2), la resolución está dada por:
Donde los tiempos de retención y los anchos se expresan en las mismas unidades. La resolución mínima aceptable en mezclas sencillas es 1.0 (ver figura 3), una resolución de 1.5 representa separación a la línea base.

La resolución alcanzada en un sistema es proporcional al producto de la selectividad, la eficiencia y la capacidad del sistema, que son los tres más importantes parámetros de control en una columna cromatográfica, siendo la expresión analítica para Rs la siguiente:
( ) √ ( )
Selectividad capacidad eficiencia
La resolución de picos adyacentes puede mejorarse ya sea aumentando la separación de los picos o disminuyendo los anchos de los picos individuales. Esto involucra la selectividad de la columna cuando se alejan más los picos y la eficiencia cuando se intenta disminuir el ancho del pico.

- Factor de Capacidad
El factor de capacidad o retención k es la cantidad más importante de cromatografía en columna.
Relaciona el equilibrio de distribución de la muestra dentro de la columna con las propiedades termodinámicas de la columna y con la temperatura. Para un conjunto dado de parámetros de operación, k es una medida del tiempo transcurrido en la fase estacionaria en relación el tiempo transcurrido en fase móvil. Se define como el cociente de los moles de un soluto en la fase estacionaria entre los moles en la fase móvil:
La razón volumétrica de fases, Vm / Vs, se denota usualmente por b. Así, k’ = K / b. Dicho de otra forma, la razón de reparto es el tiempo adicional que una banda de soluto requiere para eluir, en comparación con un soluto no retenido (para el cual k’ = 0), dividido entre el tiempo de elusión de una banda no retenida:
- Capacidad
La capacidad en un intercambiador iónico es una medida cuantitativa de su habilidad de tomar contra-iones intercambiables. La capacidad puede ser expresada como la capacidad iónica total, capacidad disponible o capacidad dinámica. La capacidad iónica total es el número de sustituyentes cargados por gramo drenado de intercambiador iónico o por mL de gel hidratado.
La capacidad total puede medirse por titulación con un ácido o base fuerte.
- Eficiencia
La eficiencia de la columna está relacionada con el ensanchamiento de la banda que se encuentra en la columna y puede ser calculada:
Donde W1/2 es el ancho del pico a una altura media del pico

Y se expresa como un número de platos teóricos (N) para la columna bajo condiciones experimentales específicas. La eficiencia es conocida frecuentemente como el número de platos teóricos por metro de cama cromatográfica, o expresada como H que es la longitud de la cama (L) dividida por el número de platos teóricos.
H = L / N
A partir de que el valor observado de N depende de factores experimentales tales como la velocidad de flujo y la carga de la muestra, es importante que las comparaciones sean hechas bajo condiciones idénticas. En el caso de la cromatografía de intercambio iónico, la eficiencia se mide bajo condiciones isocráticas, usando una sustancia que no interacciona con la matriz como por ejemplo, la acetona. Mejorar la cinética del sistema aumenta la eficiencia de la separación.
Una de las principales causas del ensanchamiento de zona en una cama cromatográfica es la difusión longitudinal de moléculas de soluto. El efecto se minimiza si las distancias disponibles para difusión, en ambos la fase móvil y la fase estacionaria, son mínimas. En la práctica esto se logra usando tamaños de cuentas uniformes y pequeños. La mayor eficiencia se logra con minicuentas de 3mm de diámetro, no porosas diseñadas para aplicaciones analíticas y micropreparativas. Después del tamaño de cama, el segundo factor importante es una buena técnica experimental. Las camas cromatográficas empaquetadas irregularmente y burbujas de aire en ellas, producirán canales, ensanchamiento de la zona y pérdida de la resolución. Las buenas separaciones requieren columnas bien empaquetadas.
- Selectividad
La selectividad (a) se define la habilidad del sistema para separar los picos, por ejemplo la distancia entre dos picos. El factor de selectividad puede ser calculado del cromatograma usando la expresión:
Una buena selectividad es un factor muy importante, mejorar la selectividad implica alterar la termodinámica del sistema cromatográfico.

Rs está relacionada de forma lineal con la selectividad pero relacionada de forma cuadrática con la eficiencia. Esto significa que un incremento de cuatro veces en la eficiencia es necesario para duplicar la resolución en condiciones isocráticas.
La selectividad en la cromatografía de intercambio iónico depende no solo de la naturaleza y número de grupos iónicos en la matriz, también depende del pH y fuerza iónica.
IV. Etapas en la realización de una cromatografía
Cromatografía en columna Cromatografía plana (papel o capa fina) 1.- Preparación del soporte y fase estacionaria. 1.- Preparación del soporte y fase estacionaria. 1.1.- Equilibrado de la columna. 2.- Aplicación de la muestra. 2.- Aplicación de la muestra. Secado. 3.- Elución: a) Lavado de componentes no retenidos. b) Liberación, desplazamiento o elución propiamente dicha de los componentes retenidos. 3.- Desarrollo de la cromatografía. 4.- Recolección de fracciones o análisis del efluente en continuo. 4.- Secado de la placa. 5.- Análisis, cuantificación o revelado. 5.- Revelado y cuantificación en su caso. 6.- Regeneración de la fase estacionaria.
Recogida del efluente
El efluente de una columna se suele recoger en forma de pequeñas porciones o fracciones, comúnmente con la ayuda de un dispositivo mecánico llamado colector de fracciones.
Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un número determinado de gotas o un cierto volumen. A continuación el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una célula fotoeléctrica; cada gota interrumpe el haz de luz y así se cuenta.

Detección
Los componentes de la muestra separados se detectan en el efluente:
a. Mediante su análisis en continuo. Por ejemplo:
o midiendo absorbancia a 280 nm para proteínas
o midiendo absorbancia a 260 nm para ácidos nucleicos
o midiendo radiactividad.
b. O bien mediante el análisis de las fracciones una vez recogidas.
o cualquier tipo de análisis (absorbancia, radiactividad, ensayo enzimático, ensayo biológico...)
V. TIPOS DE CROMATOGRAFÍA
La cromatografía puede clasificarse de acuerdo al tipo de equilibrio involucrado, mismo que es gobernado por el tipo de fase estacionaria utilizada. Así la cromatografía puede ser de (1) adsorción, (2) partición, (3) intercambio iónico, (4) exclusión, y (5) afinidad (ver figura 4).
1. Cromatografía de adsorción
La fase estacionaria es un sólido en el que los componentes de la muestra son adsorbidos. La fase móvil puede ser un líquido (cromatografía líquido-sólido) o un gas (cromatografía gas-sólido); los componentes se distribuyen entre dos fases a través de la combinación de los procesos de adsorción y desorción. La cromatografía de capa fina (TLC) es un ejemplo especial de cromatografía por adsorción en la cual la fase estacionaria es un plano, en la forma de un soporte sólido en un plato inerte.
2. Cromatografía de partición
La fase estacionaria de la cromatografía de partición es un líquido soportado en un sólido inerte.
Otra vez, la fase móvil puede ser un líquido (cromatografía de partición líquido- líquido) o un gas (cromatografía de partición gas-líquido, GLC). La cromatografía en papel es un tipo de cromatografía de partición en la cual la fase estacionaria es una capa de agua adsorbida en una hoja de papel.

Estas son clasificaciones arbitrarias de la técnicas cromatográficas, y algunos tipos de cromatografía se les considera juntas como una técnica separada, como la cromatografía de gases para la cromatografía gas-sólido y gas-líquido. En cualquier caso, los equilibrios sucesivos son los que determinan cuanto tiempo el analito permanecerá unido o se moverá con el eluyente (fase móvil).
La cromatografía de gases es la técnica a elegir para la separación de compuestos orgánicos e inorgánicos térmicamente estables y volátiles. La disponibilidad de detectores versátiles y específicos, y la posibilidad de acoplar el cromatógrafo de gases a un espectro de masas o a un espectrofotómetro de infrarrojo, amplían aún más la utilidad de la cromatografía de gases.
Un cromatógrafo de gases consiste en varios módulos básicos ensamblados para: 1) proporcionar un gasto o flujo constante del gas transportador (fase móvil), 2) permitir la introducción de vapores de la muestra en la corriente de gas que fluye, 3) contener la longitud apropiada de fase estacionaria, 4) mantener la columna a la temperatura apropiada (o la secuencia del programa de temperatura), 5) detectar los componentes de la muestra conforme eluyen de la columna, y 6) proveer una señal legible proporcional en magnitud a la cantidad de cada componente.
Sólo aprox. 20% de los compuestos conocidos permiten ser analizados por cromatografía de gases, ya sea porque son insuficientemente volátiles y no pasan a través de la columna, o porque son térmicamente inestables y se descomponen en las condiciones de separación.
La cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra. La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra con ambas fases, móvil y estacionaria. Tales interacciones esencialmente no existen en la fase móvil para la cromatografía de gases. La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.

El recobro de la muestra es fácil en la HPLC. Las fracciones separadas se recolectan en forma sencilla, colocando un recipiente abierto al final de la columna. El recobro es usualmente cuantitativo (exceptuando la adsorción irreversible en la columna) y los componentes separados son fácilmente asilados del disolvente de la fase móvil. Adicionalmente al tipo usual de compuestos orgánicos, la cromatografía líquida en columna puede manejar separaciones de compuestos iónicos, productos lábiles de origen natural, materiales poliméricos y compuestos polifuncionales de alto peso molecular.
En el modo normal de operaciones de partición líquido-líquido, una fase estacionaria polar (p. ej. agua, metanol) se usa con una fase estacionaria no polar (p. ej. hexano). Esto favorece la retención de compuestos polares y la elusión de compuestos no polares y se le conoce como cromatografía fase normal. Si se utiliza una fase estacionaria no polar con una fase móvil polar, entonces los solutos no polares serán retenidos y los solutos polares eluidos. Esto se conoce como cromatografía por fase reversa.
El mecanismo de separación en cromatografía de fase reversa depende de interacciones hidrofóbicas entre las moléculas de soluto en la fase móvil y el ligando hidrofóbico inmovilizado en la fase estacionaria. La naturaleza actual de las interacciones de unión hidrofóbica asume que la interacción de unión es el resultado de un efecto entrópico favorable. Las condiciones iniciales de unión de la fase móvil usadas en la cromatografía de fase reversa son acuosas lo cual indica un grado alto de estructuras de agua organizadas alrededor de las moléculas de soluto y el ligando inmovilizado. A medida que el soluto que une al ligando hidrofóbico inmovilizado disminuye el área hidrofóbica expuesta hacia el disolvente. Así, el grado de organización de la estructura de agua disminuye con un favorable aumento de entropía en el sistema.
3. Cromatografía de intercambio iónico
La separación en la cromatografía de intercambio iónico depende la adsorción reversible de moléculas de soluto cargadas, a una resina con grupos iónicos de carga opuesta. El mecanismo de separación se basa en un equilibrio de intercambio iónico. Muchos de los experimento de intercambio iónico se llevan a cabo en cinco etapas.
La primera etapa es un equilibrio en el cual el intercambiador iónico se encuentra en las condiciones apropiadas de pH y fuerza iónica, lo que permitirá la unión de las

moléculas de soluto. En este estado inicial, los grupos que se intercambiarán están asociados con sus respectivos contra-iones (usualmente aniones o cationes simples, como cloruro o sodio).
En una segunda etapa se encuentra la aplicación de la muestra y su adsorción, en la cual las moléculas del soluto llevan a cabo el apropiado desplazamiento de carga de los contra-iones y se unen reversiblemente al gel. Las substancias que no se unen son eluídas de la cama del intercambiador usando el buffer inicial.
En la tercera etapa, se lleva a cabo la desorción de la muestra cambiando las condiciones de elusión, al desfavorecer la formación del enlace iónico de las moléculas de la muestra y la cama del intercambiador. Esto normalmente se logra aumentando la fuerza iónica del buffer de elusión o cambiando su pH.
En las cuartas y quintas etapas corresponden a la remoción de sustancia no eluídas bajo las condiciones experimentales previas y regresar al equilibrio de las condiciones iniciales para la siguiente purificación.
La separación de diferentes sustancias se lleva a cabo porque éstas tienen diferentes grados interacción con el intercambiador iónico debido a diferencias en sus cargas, densidades de carga y distribuciones de carga en su superficie. Estas interacciones pueden ser controladas variando condiciones como la fuerza iónica y el pH. Las diferencias en propiedades de carga de compuestos biológicos son a menudo considerables, y tomando en cuenta que la cromatografía de intercambio iónico es capaz de separar especies con propiedades poco diferentes.
Se pueden llevar a cabo separaciones por intercambio iónico en una columna, mediante un procedimiento en lote o por adsorción en cama extendida.
La matriz. Un intercambiador iónico consiste de una matriz sólida insoluble a la cual se unen de forma covalente grupos cargados. Los grupos cargados se asocian a contra- iones móviles. Estos contra-iones pueden intercambiarse reversiblemente a otros iones de la misma carga sin alterar la matriz.
La matriz puede tener carga positiva o negativa y los contra-iones también. Los intercambiadores cargados positivamente tienen contra-iones cargados negativamente (aniones) disponibles para ser intercambiados por lo que son llamados intercambiadores aniónicos. Intercambiadores cargados negativamente tienen contra-

iones cargados positivamente (cationes) y se les conoce como intercambiadores catiónicos.
La matriz puede estar hecha de compuestos inorgánicos, resinas sintéticas o polisacáridos. Las características de la matriz determinan sus propiedades cromatográficas tales como su eficiencia,capacidad y recuperación, así como su estabilidad química, fuerza mecánica y fluidez. La naturaleza de la matriz afectará su comportamiento hacia sustancias biológicas y el mantenimiento de la actividad biológica.
- Grupos cargados. La presencia de grupos cargados es una propiedad fundamental de un intercambiador iónico, y el tipo de grupo determina el tipo y fuerza del intercambiador iónico; su número total y disponibilidad determina la capacidad. Hay una variedad de grupos que pueden escogerse para usarse en intercambiadores iónicos; algunos de estos se muestran a continuación.
Se usan los grupos sulfónico y amino cuaternario para formar intercambiadores iónicos fuertes, los otros grupos formar intercambiadores iónicos débiles. Los términos fuertes y débiles se refieren a la extensión de variación de ionización con pH y no a la fuerza del enlace.
Los intercambiadores iónicos fuertes están completamente ionizados en un amplio rango de pH mientras que con los intercambiadores iónicos débiles, el grado de disociación y la capacidad de intercambio varían más marcadamente con el pH.

4. Cromatografía de exclusión por tamaño
En la cromatografía de exclusión puede separarse moléculas solvatadas de acuerdo a su tamaño y habilidad a penetrar en una estructura tamiz (la fase estacionaria).
La separación en cromatografía de partición y en cromatografía de intercambio iónico se logra de diferentes interacciones de solutos con la fase móvil y la fase estacionaria. En contraste, la separación en cromatografía de exclusión por tamaño se lleva a cabo por diferencias en tamaño molecular y la habilidad de diferentes moléculas para penetrar los poros de la fase estacionaria a diferentes tamaños o magnitudes.
La cromatografía de exclusión por tamaño se usa extensivamente para las separaciones preparativas de macromoléculas de origen biológico, así como para la purificación de polímeros orgánicos sintéticos.
5. Cromatografía de afinidad
Este tipo de cromatografía utiliza interacciones altamente específicas entre un tipo de moléculas de soluto y una segunda molécula unida covalentemente (inmovilizada) a la fase estacionaria. Por ejemplo, la molécula inmovilizada podría ser un anticuerpo específico para una proteína particular.
Cuando una mezcla cruda que contiene miles de proteínas se pasa a través de una columna, sólo una proteína reacciona con el anticuerpo que está unido a la columna.

Después de lavar todos los otros solutos de la columna, la proteína deseada es desplazada del anticuerpo cambiando el pH, la fuerza iónica o la polaridad.
Las interacciones entre las moléculas del ligando y blanco pueden ser el resultado de interacciones hidrofóbicas o interacciones electrostáticas, fuerzas de van der Waals y/o puentes de hidrógeno.
La purificación por afinidad requiere un ligando bioespecífico que puede ser unido covalentemente a una matriz cromatográfica. El ligando acoplado debe retener su afinidad específica de enlace hacia las moléculas blanco, y después de lavar el material no unido, la unión entre la molécula blanco y el ligando debe ser reversible y permitir que las moléculas blanco sean removidas en forma activa. Cualquier componente puede ser usado como un ligando para purificar a su compañero respectivo. Algunas interacciones biológicas típicas usadas frecuentemente en cromatografía de afinidad son:
 Enzima <----> sustrato análogo, inhibidor, cofactor.
 Anticuerpo <----> antígeno, virus, célula.
 Lecitina <----> polisacárido, glicoproteína, receptor de superficie celular, célula.
 Ác. nucleico <----> secuencia base complementaria, histonas, polimerasa de ácidos nucleicos, proteína de unión al DNA.
 Hormona, vitamina <----> receptor, proteína acarreadora.
 Glutatión <----> glutatión-S-transferasa o proteínas de fusión GST
 Iones metálicos <----> proteínas de fusión poli (his), proteínas nativas con histidina, residuos de cisteína y/o triptofano en sus superficies.

- La matriz. Es un soporte inerte al cual un ligando puede ser directa o indirectamente acoplado.
Algunas características importantes para ésta son:
 Adsorción no específica extremadamente baja es esencial ya que el éxito de la cromatografía de afinidad depende de interacciones específicas,
 Los grupos hidroxilo en los residuos de azúcar pueden servir para unirse a un ligando,
 Proporcionando una plataforma ideal del desarrollo del medio de afinidad,
 la estructura de poro abierta asegura una capacidad de unión alta, aún para biomoléculas grandes porque el interior de la matriz estaría disponible para el ataque de ligandos,
 Propiedades de fluido buenas para la rápida separación,
 Estabilidad bajo un rango de condiciones experimentales tales como pH alto y bajo, detergentes y agentes disociadores.
- El ligando. Es la molécula que se une reversiblemente a moléculas específicas o grupo de moléculas, capacita la purificación por cromatografía de afinidad.
La selección del ligando para cromatografía de afinidad está influenciado por dos factores:
El ligando debe presentar una afinidad de unión específica y reversible para la sustancia blanco y debe tener grupos químicamente modificables que permitan ser unidos a la matriz sin destruir su capacidad de unión.
- Brazo espaciador. El sitio de unión de una proteína blanco a menudo se localizan dentro de la molécula y un medio de afinidad preparado con pequeños ligandos acoplados directamente a la columna puede exhibir una capacidad de unión baja debido a interferencias estéricas, por ejemplo, el ligando no podría accesar al sitio de unión de la molécula blanco. En estas circunstancias un brazo espaciador se pone entre la matriz y el ligando para facilitar la unión específica. El brazo espaciador puede ser diseñado para maximizar la unión específica.

- Aplicaciones
La cromatografía de adsorción es particularmente adecuada para el análisis de moléculas no ionizantes, insolubles en agua y relativamente simples, que frecuentemente son isómeros o compuestos muy relacionados. El intervalo de compuestos que pueden separarse se extiende desde los hidrocarburos muy polares hasta compuestos polifuncionales fuertemente polares. Esta cromatografía se ve poco influida por las diferencias en peso molecular y más por los grupos funcionales específicos. En consecuencia, la separación por adsorción de compuestos que difieren solamente en el grado o tipo de sustitución alguilo, como en los miembros de las series homólogas, es pobre. Esta cromatografía se utiliza en la separación de la vitamina D3 y sus metabolitos las vitaminas A, D y E (y compuestos muy relacionados a estas vitaminas), muchas drogas de abuso (LSD, por ejemplo), antidepresivos tricíclicos, bloqueadores beta y los PTHamino ácidos. Los aceites naturales y los extractos de esencias se analizan fácilmente y los pigmentos menos polares de las plantas, tales como los carotenoides y las porfirinas, se han separado con éxito durante muchas décadas. Los ésteres también son factibles de ser separados, siendo los glicéridos y los ftalatos típicos de esta clase de compuestos. También han sido separadas en columnas de sílice las aflatoxinas y otras micotoxinas.
En química clínica cada vez se realiza con más frecuencia el análisis cuantitativo de las drogas de abuso por medio de la cromatografía de fase reversa. Los productos farmacéuticos que se analizan en forma rutinaria incluyen a los barbitúricos, drogas antiepilépticas, analgésicos y sedantes. Aplicaciones adicionales de los métodos de fase reversa son los conservadores alimentarios, herbicidas y azúcares. En el campo farmacéutico ha venido en aumento el uso de esta técnica a costa de la cromatografía de adsorción. Un amplio espectro de biomoléculas, lipofílicas o iónicas, pequeñas o grandes, pueden ser separadas debido a que el contenido de agua en la fase móvil puede variar desde el 100% hasta porcentajes muy bajos o ninguno en absoluto.
Los compuestos lipofílicos, tal como los triglicéridos, que tienen una solubilidad muy pobre en los disolventes acuosos de la fase inversa, con frecuencia pueden separarse con una fase inversano acuosa utilizando una columna empacada de octadecilo y disolventes orgánicos polares como el acetonitrilo o el tetrahidrofurano.
En la actualidad, la cromatografía ha alcanzado tal nivel de fineza y especialización que cada uno de sus tipos constituyen herramientas imprescindibles en las áreas de la ciencia y la tecnología, en la industria química, farmacéutica, cosmética, en estudios ambientales, en la clínica, en alimentos, etc.

- Cromatografía líquida HPLC.
En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija. La separación cromatográfica en HPLC es el resultado de las interacciones específicas entre las moléculas de la muestra en ambas fases, móvil y estacionaria
A diferencia de la cromatografía de gases, la cromatografía de líquidos de alto rendimiento (HPLC, de high-performance liquid chromatography) no está limitada por la volatilidad o la estabilidad térmica de la muestra.
La HPLC es capaz de separar macromoléculas y especies iónicas, productos naturales lábiles, materiales poliméricos y una gran variedad de otros grupos polifuncionales de alto peso molecular. Con una fase móvil líquida interactiva, otro parámetro se encuentra disponible para la selectividad, en adición a una fase estacionaria activa.
La HPLC ofrece una mayor variedad de fases estacionarias, lo que permite una mayor gama de estas interacciones selectivas y más posibilidades para la separación.
HPLC preparativa
Es la técnica escogida para aislamiento y purificación de productos de valor en las industrias químicas y farmacéuticas así como en la biotecnología y la bioquímica. La cromatografía preparativa comprende un amplio rango de aplicaciones, desde el aislamiento de 1μg de muestra para identificación espectroscópica hasta el aislamiento de un compuesto puro de una mezcla de 100 g.
- Aplicaciones
Campos de Aplicación de HPLC
• Fármacos: Antibióticos, sedantes esteroides, analgésicos
• Bioquímica: Aminoácidos, proteínas, carbohidratos, lípidos
• Productos de alimentación: Edulcorantes artificiales, antioxidantes, aflatoxinas, aditivos
• Productos de la industria química: Aromáticos condensados, tensoactivos, propulsores, colorantes
• Contaminantes: fenoles, Pesticidas, herbicidas, PCB

• Química forense: Drogas, venenos, alcohol en sangre, narcóticos
• Medicina clínica: Ácidos biliares, metabolitos de drogas, extractos de orina, estrógenos.
• Algunas aplicaciones importantes de la HPLC preparativa
• Separación y purificación de metabolitos
• Separación y purificación de los metabolitos de las drogas procedentes de muestras de orina
• Purificación y separación de enantiómeros
• Purificación de compuestos naturales
• Purificación y caracterización de enzimas y proteínas

Cromatografía de gases En cromatografía de gases la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna cromatográfica. La elución se produce por el flujo de una fase móvil que es un gas inerte, y a diferencia de la mayoría de los tipos de cromatografía, la fase móvil no interacciona con las moléculas del analito; su única función es la de transportar el analito a través de la columna. Respecto a la cromatografía líquida, la cromatografía de gases tiene la ventaja de disponer de detectores mucho más universales (por ejemplo, el de ionización de llama). Además, para numerosas aplicaciones, los métodos son más simples, más rápidos y más sensibles que los correspondientes a la cromatografía líquida de alta resolución. La instrumentación requerida para cromatografía de gases también es mucho más sencilla y económica que la empleada en HPLC. Sin embargo, en cromatografía de gases, la influencia de la temperatura sobre la distribución del equilibrio es considerable, a
Solvente
Reservorio de fase móvil
Automuestreador
Columna
Detector

diferencia de la cromatografía líquida. Por ello, la cromatografía de gases presenta limitaciones en tres casos: • compuestos poco volátiles, generalmente los de peso molecular superior a 300 u.m.a. • compuestos sensibles a una elevación de la temperatura incluso moderada (determinados compuestos de interés biológico) • compuestos que se encuentran en forma iónica (puesto que son e n general poco volátiles) Por esta razón, la cromatografía de gases se emplea cuando los componentes de la mezcla problema son volátiles o semivolátiles y térmicamente estables a temperaturas de hasta 350-400ºC. En cambio, cuando los compuestos a analizar son poco volátiles y/o termolábiles, la técnica separativa adecuada suele ser la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC). A menudo la cromatografía de gases se emplea para confirmar de la presencia o ausencia de un compuesto en una muestra determinada.
Aplicaciones
• Medioambientales: Análisis de pesticidas y herbicidas, análisis de hidrocarburos, semivolátiles y volátiles, análisis del aire...
• Alimentos y aromas: fragancias y aromas, aceites, bebidas, ácidos orgánicos, azúcares, FAMES, ésteres metílicos, triglicéridos, alcoholes...
• Química Industrial: alcoholes, ácidos orgánicos, aminas,aldehídos y cetonas, ésteres y glicoles, hidrocarburos, disolventes, anilinas, gases inorgánicos...
• Biociencia: drogas, fármacos, alcoholes y contaminantes en sangre, disolventes residuales...
• Derivadas del petróleo: gas natural, gases permanentes, gas derefinería, gasolinas, gasóleos, parafinas.

DETERMINACION DE LA VITAMINA C EN LA MANDARINA POR CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION (HPLC)
1. INTRODUCCIÓN
El ácido ascórbico (AA) es un nutrimento esencial para los humanos. Una baja ingesta causa una enfermedad, por deficiencia, conocida como escorbuto. Este ácido esta presente en forma natural en muchas frutas y verduras, además, estos alimentos son ricos en vitaminas antioxidantes, compuestos fenólicos y carotenos [1, 2].
La Food and Drug Administration (FDA, Dirección de Alimentos y Medicamentos), clasifica el ácido ascórbico sintético como un aditivo alimenticio "generalmente reconocido como seguro". Se adiciona a una amplia variedad de alimentos, tanto por razones nutricionales como técnicas.
Entre las funciones del AA, están la fijación del oxígeno:
Cuando los alimentos se embotellan o se enlatan estos contienen oxígeno, que podría reaccionar con varias moléculas del alimento, provocando rancidez, pérdida de color, entre otras características. Al agregar AA, este fija o elimina el oxígeno, como se observa en la figura 1.
Además la fijación de radicales libres y control del pardeamiento, [3 ], hacen que esta vitamina sea uno de los aditivos más empleados en la industrial de los alimentos. El AA, es conocido como una vitamina termolábil; varios autores, [4, 5] han estudiado la cinética de degradación térmica en jugos y frutas naturales, bajo diferentes condiciones de tratamiento; por ejemplo, la oxidación del AA al ácido de hidroascórbico y dicetogulónico, hace que se pierda la actividad vitamínica, razón por la cual, el seguimiento de la variación en la concentración

del AA en alimentos, es relevante para establecer los mecanismos que afectan su estabilidad y por tanto influyen en el tiempo de vida útil de los mismos. La mandarina es el fruto de las diferentes especies de cítricos llamados comúnmente mandarino, entre ellasCitrus reticulata, Citrus unshiu, Citrus reshni, así como sus híbridos, incluyendo Citrus × tangerina, cuya taxonomía está discutida.1 Pertenece al grupo de frutos llamados hesperidios y su pulpa está formada por un considerable número de gajos llenos de zumo o jugo; el cual contiene mucha vitamina C (27 mg/100g de fruta), flavonoides y aceites esenciales. Es elcítrico más parecido a la naranja, aunque de menor tamaño, sabor más aromático y con mayor facilidad para quitar su piel en la mayoría de las variedades, así como una acidez ligeramente inferior y una mayor proporción de azúcares simples. Estas propiedades hacen que se considere una golosina natural de fácil consumo para jóvenes y ancianos La determinación de AA por diferentes técnicas analíticas, ha sido ampliamente estudiada, teniendo en cuenta las propiedades fisicoquímicas de la molécula. (6,7) Torregrosa (8,9) cuantifica el AA en jugos de naranja y zanahoria por técnicas polarográficas, dadas las características redox del analito; empleando la gota de mercurio como electrodo de trabajo, pulso diferencial con velocidad de barrido de 10 mV/s y cuantificación por adición estándar.
2. MATERIALES Y MÉTODOS:
Materiales y Equipos
 Mandarina
 colador
 Pipeta
 Vaso precipitado
 Centriguga
 Micro jeringa
 Vial
 Equipo de cromatografía liquida de alto rendimiento (HPLC).
 Software para el procesado de datos cromatográficos.

Métodos
 Se extrajo el zumo de dos mandarinas.
 Se procedió a centrifugar la muestra para eliminar los residuos.
 Se diluyo el zumo hasta una concentración de 6ml de zumo/50ml de agua destilada.
 Con una micro jeringa introducimos 1.5 ml del zumo en un dial.
 Procedemos a la lectura
Después de la centrifugación
Se extrajo el zumo
Pasamos el centrifugado a un vaso precipitado para una mejor extracción
Añadimos 6ml del zumos en una fiola para la dilución

Aforamos a 50 ml
Colocamos en el Dial aprox 1.5 ml
PROCEDEMOS A LA LECTURA

3. RESULTADOS
En la siguiente imagen podemos observar el cronomatograma representativo de la vitamina C a una concentración de 6ml/50ml. El tiempo de retención obtenido fue de 6.1 min
4. CONCLUSIONES
 El sistema HPLC básico, las columnas, solventes y mantenimiento, son costosos comparados con los equipos y materiales utilizados en las técnicas convencionales para la determinación de iones; sin embargo, por los beneficios que aporta la cromatografía, resulta ser una inversión conveniente.  Una de las principales ventaja de esta técnica frente a otras metodologías analíticas clásicas es su especificidad, permitiendo la separación, identificación y cuantificación de los componentes orgánicos más complejos.  La HPLC analítica ha adquirido una especial importancia en el campo de la investigación y desarrollo científico, encargándose del control de calidad farmacéutico y el análisis medioambiental.

 Una de las características más resaltantes del HPLC es su alta resolución, su reproducibilidad, alta velocidad, y la capacidad de automatización que presentan; lo cual la hace ser una de las técnicas más empleadas en el análisis de diversas formulaciones cosméticas y alimentarias.  La cromatografía de gases es una técnica muy útil para de separación y determinación de compuestos orgánicos volátiles y semivolátiles que sean térmicamente estables.
5. DISCUSIONES
o La muestra y el extracto de la muestra deben protegerse de la luz y la oxidación, evitándose la luz solar directa y la luz brillante. La iluminación artificial es mejor proporcionada por tubos fluorescentes dorados o equivalentes. En ciertos casos, las diferentes etapas en el procedimiento deberían realizar en material de vidrio ámbar para prevenir la degradación.
o Dado que le calor también contribuye a la isomerización o a una posterior alteración de las vitaminas, debería evitarse el calor innecesario.
o En estudios poblacionales la técnica de HPLC tiene la ventaja de ser más rápida y permite el estudio de un mayor número de muestras, obteniendo resultados en pocos minutos, aún así no se deben excluir el uso de los métodos convencionales de electroforesis en vista de que algunos casos ameritan estudios complementarios para su identificación y así poder utilizar la vasta experiencia que se tiene en esta metodología.
o La señal del detector de una columna cromatográfica gas-líquido se ha utilizado generalmente para análisis cuantitativos y semicuantitativos. En

condiciones cuidadosamente controladas se consigue una exactitud (relativa) del 1 %. Como con la mayoría de los instrumentos analíticos, la fiabilidad se relaciona directamente con el control de las variables; la exactitud también depende en parte de la naturaleza de la muestra. La discusión general del análisis cuantitativo cromatográfico, dada anteriormente, se aplica tanto a la cromatografía de gases como a otros tipos; por esta razón no se hacen aquí más consideraciones sobre este aspecto.
6. BIBLIOGRAFIA
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 JHON, Z. y YUDKIN, R. En: The Lancet, 359; (2002)
 1969-1974.Willard, HH., Instrumental Methods of Analysis, Wadsworth, Inc., U.S.A., 1988.
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 JOHNSON, J. y BRADDOCK, R. Kinetics of ascorbic acid loss and nonenzymatic browning in orange juice serum: Experimental rate constants. En: Journal of Food Science, 60; (1995) 502-505.
 VIEIRA, Margarida. y TEIXEIRA, A. Mathematical modelling of the thermal degradation kinetic of vitamin C in cupuacu nectar. En: Journal of Food Engineering, 43; (2000) 1-7.
 KING, B. y SWITAISKI, Lydia. Keystone Beta basic and aquasil HPLC columns for the analysis if water soluble vitamins. En: International Lab mate, I; (2001); 1-7.
 TORRES, A. En: Ciencia Tecnología Alimentos, 2 (2001) 21-26.
 TORREGROSA, F. y ESTEVE, M. Ascorbic acid stability during refrigerated storage of orange carrot juice treated by high pulsed electric field and comparison with pasteurized juice. En: Journal of Food Engineering, (2005). Article in press.

 ESTEVE, M. y BLASCO, R. Ascorbic acid degradation kinetic in mushrooms in a high temperature short-time process controlled by a thermoresistometer. En: Journal of Food Quality, 37; (2004)171-175.
 Handbooks of Amersham Pharmacia Biotech: Ion Exchange Chromatography, Affinity
Chromatography, Hydrophobic Interaction Chromatography, Reversed Phase Chromatography, Sweden, 2002.  La cromatografía de gases y la espectrometría de masas: identificación de compuestos causantes de mal olor (M.C. Gutiérrez, M. Droguet) (https://upcommons.upc.edu/revistes/bitstream/2099/2733/1/5CROMGASES.pdf+&cd=10&hl=es&ct=clnk&gl=pe)
 http://biomodel.uah.es/tecnicas/crom/inicio.htm
 http://www.mncn.csic.es/docs/repositorio/es_ES/investigacion/cromatografia/principios_de_cromatografia.pdf
 https://es.scribd.com/doc/17065477/HPLC-Aplicaciones-en-compuestos- organicos
 http://www.scielo.cl/pdf/formuniv/v2n1/art03.pdf+&cd=10&hl=es&ct=clnk&gl=pe
 https://es.scribd.com/doc/17065477/HPLC-Aplicaciones-en-compuestos- organicos+&cd=1&hl=es&ct=clnk&gl=pe

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