Este documento describe la técnica de selección in vitro. La selección in vitro es un procedimiento de cultivo celular en el que las células son sometidas a un factor de presión de selección como una toxina, metal pesado u otro estresante con el fin de seleccionar líneas celulares tolerantes. Esto puede usarse para obtener resistencia a enfermedades, herbicidas, salinidad u otros estreses. El documento discute los métodos de selección directa e incremental y proporciona ejemplos de estudios que han usado esta técn

1. UNIVERSIDA NACIONAL
PEDRO RUIZ GALLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA
SELECCIÓN IN VITRO
Autor:
Pisfil Colchado Katheryn Georget

2. La selección in vitro es un
procedimiento del cultivo de
células y tejidos en la que estas
estructuras son sometida una
determinada presión de
selección con la finalidad de
seleccionar líneas celulares que
exhiban tolerancia de resistencia
al factor de presión ejercido.
Esta presión de selección esta
dada por diversos factores como
temperatura, sequía, metales
pesados, herbicidas, toxinas de
microorganismos patógenos, etc.
• Es el mejor método debido a su
capacidad de manipular
variaciones al resultado esperado.
• Es un método de variación
somaclonal: condición para
cambiar el somaclón con el
carácter deseado(Van Den
Bulk,1991;Karp,1995).
• Cuando la capacidad intrínseca de
variación de los cultivos crecidos in
vitro es potencializada a través de
la adición de un agente de
selección al medio de cultivo, es
posible obtener variantes
“somaclonales” con tolerancia a
ese agente de selección; esta
técnica se denomina “selección in
vitro”(Lesrari 2006).
SELECCIÓN IN VITRO

3. La selección in vitro puede aplicarse a poblaciones inicialmente homogéneas,
a poblaciones de células hibridas por fusión de protoplastos o a células
transformadas por ingeniera genética.
El procedimiento de selección es semejante al utilizado para bacterias en
experimentos de microbiología, con la diferencia de que en este caso las
bacterias permanecen libres en tanto que en las células vegetales tienden
a formar agregados celulares, lo que de alguna manera altera la
distribución de las células que se modifican, aun cuando los criterios de
aplicación de la genética microbiana sean los mismos (Murphy,1982).
Solo tal planta tolerante es capaz de crecer ,para obtener la planta con el
carácter deseado no toma mucho tiempo(Biswas et al2002)
El logro de la técnica de selección in vitro esta en la disponibilidad de :
-alta variación de la célula
-una fácil aplicación del método de selección in vitro(Widoretno,2003)
-el carácter deseado para ser heredado(Yusnita,2005)

4. Selección
por
resistencia
selección
visual.
selección
contraria o
“counterselecti
on”.
Selección
total.
Micromanipulacíon
El objetivo es mostrar y discutir las
potencialidades que ofrece la
selección in vitro en el
mejoramiento genético de los
cultivos y la obtención de las líneas
celulares productoras de
sustancias metabólicas
secundarias.
Collin & Dix(1990)consideraron
varias estrategias en el proceso de
selección in vitro:

5. selección
por
resistencia
Las células son cultivadas directamente bajo el factor
de presión de selección, el que puede ser
químico(p.e.una toxina) o físico( p. e. temperatura
alta).únicamente las células resistentes o tolerantes
que continúan su crecimiento serán seleccionadas
como líneas celulares resistentes a
enfermedades(cf.Jones,1990),marcadores
genéticos(cf.Negrutiu 1990),híbridos nucleares(cf.
Gleba &Shlumukov,1990) híbridos
citoplasmáticos(cf.Medgysey,1990)y células
transformadas(cf.Lindsey &Jones,1990).
Selección
visual
Aplicado cuando el fenotipo requerido no
tiene una ventaja requerida respecto las
células del cultivo inicial ,pero puede ser
visualmente identificado permitiendo su
rápida selección.Aplicado a cultivos que
acumulan pigmentos, como las antocianinas
o los pierden, como la clorofila; combinando
la selección por resistencia y la selección
visual, u ejemplo es la obtención de líneas
celulares resistentes a antibióticos.

6. selección
contraria
Basado en el hecho de que ciertas drogas pueden
matar solo células en división, en tanto que otras,
donde la inhibición es inhibida, por ejemplo, por una
deficiencia nutricional, pueden sobrevivir.es aplicado
en mutantes autotróficos y algún otro mutante letal
condicional, donde no se cuenta con un adecuado
procedimiento de selección (cf.Phythoud &
King,1990).
Selección
total
Aplicado para pruebas de crecimiento en medio de
cultivo no-adecuado, y es utilizado en la identificación
de auxotrofos(cf.Phythoud & KING, 1990)o en
pruebas bioquímicas inmunológicas para identificar
líneas celulares ,por ejemplo, productoras de
metabolitos secundarios(cf.Wilson,1990).

7. MICROMANIPULACIÖN
Cultivo de callos
Tamaño del explante
Cultivo en
tratamientos
crecientes del factor
estresante
Tiempo de duración
del cultivo
Cultivo de
suspensiones
celulares
Plaqueamiento de
suspensiones
celulares
Cultivo de
protoplastos
Cultivos
diferenciados

8. b) La selección a nivel celular, selección
in vitro, que se hace con el objetivo de obtener
resistencia a estreses bióticos o Figura 1: Estrategia para la producción comercial de
variantes somaclonales (izquierda) y gametoclonales (derecha) en arroz. 92 CARDONE,
Susana; OLMOS, Sofía; ECHENIQUE, Viviana abióticos y se utiliza generalmente para
caracteres tales como resistencia a toxinas fúngicas, herbicidas, concentraciones salinas
elevadas y temperaturas extremas.
Mediante esta estrategia pueden cultivarse explantos de distintos genotipos y observarse
el comportamiento de los callos frente al agente selectivo, en condiciones de laboratorio.
Una vez seleccionados los genotipos resistentes
se procede a la regeneraciónde las plantas, que son analizadas
para ver si expresan la resistencia a campo y luego son introducidas en el programa de
mejoramiento.
La selección efectuada sobre cultivos celulares in vitro
puede llevarse a cabo mediante dos modalidades:
- Selección directa en un
solo paso, donde el agente de
selección es utilizado en concentraciones
dobles o triple
de la MIC (concentración mínima
que produce un 100 %
de inhibición).
- Selección en varios pasos, donde la concentración
del agente selectivo es gradualmente
incrementada en cultivos sucesivos y
frecuentes

9. El primero es un método simple y efectivo,
ya que las células sensibles al agente morirían,
permitiéndo el crecimiento de las tolerantes.
Sin embargo, elevados niveles de
estrés serían deletéreos a nivel celular, eliminando
materiales que tal vez, con un mayor
nivel de diferenciación tisular hubiesen sido
capaces de regenerar plantas tolerantes. La
elección de un método u otro dependerá de
un monitoreo preliminar que proporciona
una indicación acerca de la reacción del tejido
vegetal a las concentraciones letales y
subletales del agente selectivo.
En la Figura 2 se representan las etapas
de la selección in vitro. En el ejemplo diferentes
líneas de arroz son evaluadas para tolerancia
al aluminio. La inducción y la proliferación
de callo en el medio de cultivo al que
se ha adicionado aluminio es indicadora de
la tolerancia del genotipo al metal en cuestión.
Una vez que se han regenerado las plantas
se requieren posteriores evaluaciones a
campo, en suelos con concentraciones elevadas
de aluminio, a fin de corroborar la tolerancia
evidenciada in vitro por los materiales

11. TOLERANCIA
A metales
pesados
A herbicidas
A salinidad
a estrés
hídrico
a
temperaturas
extremas

13. Tolerancia
a metales
pesados
Condición importante en que las
especies cultivadas puesto que las
especies cultivadas pueden
prosperar en suelos actualmente no
aprovechables en la agricultura.
Las suspensiones celulares
constituyen el mejor sistema para
seleccionar las líneas celulares que
expresen fenotípicamente una
condición selectiva para crecer en
condiciones estresantes, dada por
la suplementación al medio de
cultivo de condiciones es estables
o crecientes del metal ensayado.

14. Wu, L. ; Antonovics, J. 1978
Expesividad in vitro de tolerancia a altas concentraciones de metales pesados fueron
presenciados en Agrostis stolonifera L. Quienes observaron tolerancia en niveles
elevados de Zn y Cu,tolerancia tabien evidenciada en plantas regeneradas. El tejido
de callo se indujo a partir de brotes de t
Tejido de raíz y meristemas de un clon de la hierba Agrostis stolonifera tolerante a
ambos metales , zinc y el cobre, y de un clon de control tolerante a ninguno de metal.
Crecimiento del tejido de callo en medios que contienen zinc y cobre mostró que la
tolerancia a ambos metales se mantuvo en cultivo de tejidos. El patrón de captación
de metal en cultivo de tejidos se parecía a la absorción por las plantas enteras en ese
tejido tolerante tomó más metal que el tejido no tolerantes. Las plantas regeneradas a
partir de callos tenían la misma tolerancia de cobre y zinc como los clones parentales
originales independientemente de tiempo de crecimiento en cultivo de tejido y
disparar o el origen de la raíz del tejido. Los resultados apoyan la evidencia previa de
que la tolerancia de metal es genéticamente determinada y actúa a nivel celular.

15. Carole P. Meredith (1977 )*Selección y caracterización de variantes de aluminio
resistente de cultivos de células de tomate.
Variantes de aluminio resistente se obtuvieron a partir de células cultivadas de
tomate desafiando callos y cultivos en suspensión chapados con 200 M de aluminio
durante varios meses. Las frecuencias de aparición de las variantes se estiman en
2,03 × 10 -7 por célula en el callo y 8,32 × 10 -6 en cultivos en suspensión, y están de
acuerdo con los reportados por mutación espontánea. Las variantes generalmente
crecieron vigorosamente en la presencia de aluminio, aunque no tan bien como lo
hicieron en la ausencia de aluminio. Aunque varias variantes perdieron parte de su
tolerancia en ausencia de aluminio, para la mayor parte de ellos eran estables. Todas
las variantes analizadas tomaron de aluminio en la misma medida al igual que el
control. Se detectaron altos niveles de poliploidía en los cultivos celulares. El
comportamiento de las variantes resistentes sugiere que son el resultado de una
mutación, pero la posibilidad, de una base epigenética para la resistencia no se puede
descartar.

16. Plantas resistentes a cadmio, arsénico y mercurio
20 de febrero de 2003
Las plantas toleran los metales pesados de forma natural hasta un cierto límite. La
cuestión es ¿puede aumentarse el nivel de tolerancia? Para esa pregunta los
investigadores del Instituto de Bioquímica Vegetal y Fotosíntesis han hallado una
respuesta afirmativa y han conseguido desarrollar, a nivel de laboratorio, plantas que
son resistentes simultáneamente a cadmio, mercurio y arsénico (este último, un
metaloide).
«Todo surgió a raíz del hallazgo de que la biosíntesis cisteína, un aminoácido
implicado en el metabolismo de las plantas, está regulada por metales pesados»,
detalla Luis Carlos Romero, co-director del proyecto de investigación junto a Cecilia
Gotor. Cuando la planta absorbe metales pesados, explica este investigador, «estos
desencadenan la biosíntesis de cisteína, que a su vez genera la producción de
fitoquelatinas, que se unen a los metales pesados y los destoxifican». Este es uno de los
mecanismos de «asimilación y tolerancia» de los metales por parte de las plantas.
A partir de esta correlación directa, los investigadores han modificado plantas de
Arabidopsis para que sinteticen mayor cantidad de cisteína mediante la
sobreexpresión de uno de los genes implicados en el proceso, lo que aumentaría su
capacidad de destoxificar más cantidad de metales pesados. El resultado son plantas

17. Comparación de plantas silvestres (dos fotos arriba) y cuatro líneas
transformadas independientes más resistentes al cadmio

18. Tolerancia a herbicidas
La tolerancia a herbicidas, de una especie genotipo en particular,
es una característica fisiológica de interés agronómico .El aspecto
fundamental estriba en la relación que se establece entre el
herbicida con el metabolismo de las células de cultivo, inhibiendo o
no su crecimiento. Esto propicia que la técnica de selección in vitro
se restrinja a herbicidas que actúen en el nivel celular y no en el
nivel de tejidos organizados y órganos de plantas adultas.
Químicos :se refiere a la habilidad
que tiene un herbicida para
discriminar entre maleza y una
planta cultivada
Genético: se refiere al ensayo un
numero amplio de herbicidas en
particular, esperando la ocurrencia
de alguna mutación que otorgue el
enfoque de tolerancia.
Ambos enfoques pueden conciliarse al utilizar herbicidas potentes en
genotipos cuya tolerancia ha sido incrementada con manipulación genética
in vitro. cuadro

19. Picloram :induce cambios en el crecimiento y la
estructura de la planta de manera similar a 2,4-
D,considerado como regulador semejante a las
auxinas.
Paraquat :agente fitotóxico que genera una serie de
reacciones a través del transporte fotosintético.
Amitrol :herbicida biodegradable de amplio
espectro con una vida corta en el suelo .interfiere en
el desarrollo de cloroplastos en hojas jóvenes,
previniendo el ensamblaje de aparto fotosintético.
Sulfonilureas: clorosulfuron y sulfometurón, sitio
de acción de ambos herbicidas el acido acetohidroxi
sintetasa(AHAS)una enzima de la ruta metabólica
biosisntetica de aminoácidos de cadena
ramificada(Chaleff &Ray,1984) N.tabacum cv.
Xanthi.
o Chaleff &
Parsons,1978,obtuvieron líneas
celulares tolerantes ,en
suspenciones ceulares de
N.tabacum ,fueron sometidas
cuando e medio de cultivo fue
suplementado con 500 uM de
picloram, obteniéndose plantas
capaces de desarrollar en
presencia de 100 uM.
 Miller&Hughes,1980,regenearon
36 plantas de N.tabacum en
ausencia de paraquat, a partir de
líneas celulares capaces de crecer
en presencia de 100 uM del
herbicida.
 Thomas &Pratt,1982;líneas
celulares de hibrido
L.peruvianum x L.esculentum
fueron seleccionadas creciendo
en medios de cultivo
suplementado con 100-500 uM
de paraquat .

21. Tolerancia a la salinidad
Se define la tolerancia a la salinidad como la capacidad que tiene el
cultivo para soportar la salinidad del suelo sin experimentar efectos
perjudiciales en su desarrollo y/o producción. Las plantas desarrollan
diversas estrategias para ser más tolerantes a la salinidad. Por ejemplo,
restringiendo la extracción de sales y ajustando la presión osmótica a
través de la síntesis de sales compatibles como la prolina, la glicina-
betaína, y otros azúcares (Greenway y Munns 1980). Otra estrategia
seguida por las plantas es la acumulación de la sales en las vacuolas
celulares, controlando de esta forma la concentración de sales en el
citosol y manteniendo en las células una relación K+/Na+ alta (Glenn
1999).
En general la tolerancia de los cultivos a la salinidad se puede evaluar
siguiendo tres criterios:
La capacidad del cultivo para sobrevivir en suelo salino.
La producción del cultivo en suelo salino.
El rendimiento relativo del cultivo en suelo salino en comparación con la
producción, bajo las mismas condiciones de manejo, pero en
condiciones de no salinidad.

22. En M. crystallinum, el sodio es acumulado y depositado en un gradiente a lo
largo de su eje de crecimiento, con la mayor concentración depositada en las
partes jóvenes de las hojas, donde es secuestrado dentro de la gran vacuola
central de las células,se medió concentraciones particularmente altas de
sodio en células especializadas de las partes aéreas conocidas como células
vejiga (figura 1). Estas células, localizadas en la superficie de las hojas y de los
tallos, son células modificadas (tricomas) que se desarrollan durante el
crecimiento de la planta, y permanecen deprimidas en ausencia de sal, pero
su crecimiento se ve estimulado por la presencia de ésta (Adams et al.,
1998),esas funcionan como reservorios de agua para las células fotosintéticas
(mesófilo) que se encuentran dentro de la hoja (Rygol et al., 1989). Se
demostró que el secuestro del sodio dentro de la vacuola de M. crystallinum
se debe a la actividad de un intercambiador de sodio/protones (Na+ /H+ )
que es activado por la bomba de protones del tonoplasto (V-ATPasa, figura 2)
(Barkla et al., 1995). La actividad de estos dos transportadores es inducida
cuando las plantas o cultivos de células en suspensión son crecidos en
presencia de sal (Barkla et al., 1995). Cambios concomitantes a nivel de ARN
y proteína para varias sub-unidades de la VATPasa son causados por la sal
(Barkla y Pantoja, 1996). sugiere fuertemente que este intercambiador juega
un papel muy importante en la tolerancia a la salinidad. También se pudido
demostrar que existe una correlación muy estrecha entre los sitios de
acumulación de sodio dentro de la planta y la actividad del intercambiador
Na+ /H+ , encontrando una mayor acumulación de sodio y una mayor
actividad del intercambiador en las células vejiga, y en segundo lugar, en los

23. Mecanismos de tolerancia a la
salinidad

24. METODOS DE EVALUACIÓN Y SELECCIÓN PARA LA TOLERANCIA A LA
SALINIDAD
Debido al aumento constante de los suelos salinizados y a las diferencias sustanciales
en la reducción de la productividad de las distintas especies y variedades que se
cultivan en esas condiciones, es necesario establecer criterios y mé- todos objetivos y
seguros para evaluar su tolerancia, lo que alcanza gran importancia práctica en los
trabajos de mejoramiento genético, así como en las investigaciones cientí- ficas, para
profundizar en el conocimiento de los mecanismos que regulan dicha tolerancia. Un
criterio para medir la tolerancia de las plantas a la salinidad lo constituye el grado de
disminución de su productividad en condiciones salinas con respecto a la que se
obtiene en condiciones normaL. M. González, M. C. González y R. Ramírez 31 les; sin
embargo, realizar una evaluación en grandes grupos de cultivares por este método es
bastante difícil y en la mayoría de los casos imposible de realizar.. Los métodos para la
evaluación y selección de plantas tolerantes a la salinidad se basan en las distintas
formas de valorar los cambios fisiológicos que ocurren en ellas en condiciones
adversas extremas.limitaciones y formas de interpretar los resultados, lo que influye
sobre la selección de uno u otro en específico por el investigador para resolver un
determinado problema. Se han desarrollado varios mé- todos, sobre la base de las
afectaciones de la germinación, el crecimiento de las plántulas, supervivencia y
rendimiento, así como en base a diversos caracteres anatómicos y bioquímicos, usando
soluciones de NaCl o mezclando NaCl y CaCl2, en macetas con suelos de alta
concentración salina y en suelos con alta salinidad (9, 15, 16, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49,
50). En este sentido, los resultados obtenidos por el grupo de investigación sobre la
evaluación del germoplasma para tolerancia a la salinidad de nuestra institución han

30. Resistencia
patógenos
Selección utilizando
parásitos fúngicos
obligatorios
Selección utilizando
virus
Selección utilizando
parásitos
facultativos
tóxinas
Debido a su natraleza los virus permiten
la realización de estudios sobre
resistencia in vitro un un amplio numero
de sistemas y tejidos,lo que ha sido
expresado en callos,protoplastos y
suspensiones celulares(Murakishi et
al.,1984)
Utilizando hongos y bacterias
facultivas en interacciones con el
cultivo de callos.

31. Resistencia a toxinas
• Procedimiento de selección directa que ha
permitido confrontar las sustancias toxicas, de
bajo peso molecular ,que producen hongos
facultativos y bacterias en condiciones in vitro
e in vivo, con callos en crecimiento por
ejemplo factores de patogenicidad.

35. La técnica de selección in vitro tiene algunas ventajas
que hacen que su uso sea recomendable: a)
no implica técnicas de manipulación genética
molecular; b) permite la manipulación simultanea
de un numero prácticamente ilimitado
de células en un solo ciclo de selección, lo que
aumenta la probabilidad de obtener algún mutante
con una respuesta fenotípica adecuada a
los fines del mejoramiento; c) existen protocolos
de regeneración in vitro efectivos para
muchas especies de importancia económica,
lo que garantiza una aplicabilidad amplia de
la técnica; d) hay disponibilidad de muchas
técnicas moleculares para una discriminación
rápida y eficaz de variantes genéticos vs. variantes
epigenticos; e) no requiere de insumos
o infraestructura especializada y f) es una
técnica bien sustentada científicamente.
CONCLUSIONES.

36. En cuanto a los fines, la técnica se adapta
fácilmente a las siguientes necesidades:
a) Generación de germoplasma
resistente/tolerante a factores de estrés
abiótico (v.gr. estrés hídrico,
salinidad, metales pesados), condición que
generalmente tiene una base genética
compleja;
b) selección directa de mutantes con tolerancia
y/o resistencia a factores bióticos con base
genética mono génica;
c) generación de ornamentales
con características novedosas (v.gr.
tamaño, color, textura) y d) estudio y análisis
de los mecanismos de interacción molecular
entre las células de las plantas y los
fitopatogenos,asi como las respuestas de las
células vegetales a los estrés abióticos.