El documento describe los fundamentos de los cultivos vegetales in vitro. Explica que este método permite el cultivo de partes de plantas como órganos, tejidos y células en condiciones estériles y controladas. Además, detalla la historia de los cultivos vegetales in vitro, los objetivos de este método como la propagación masiva y obtención de plantas libres de patógenos, y los componentes clave como los medios de cultivo y reguladores de crecimiento.

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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTIN DE AREQUIPA
BIOTECNOLOGÍA AGRÍCOLA
• Historia. Fundamento de los Cultivos Vegetales in vitro.
• Fundamentos de diferenciación: callos, células meristemáticas,
organogénesis, embriogénesis.
• Medios de Cultivo y Factores medioambientales para cultivo "in vitro«
• Tecnología del cultivo "in vitro", equipamiento de un laboratorio.
Realización del Cultivo de Tejidos Vegetales "in vitro«
• Fenómenos Fisiológicos de plantas "in vitro": desarrollo de plantas y
caracteres morfo anatómicos. Nutrición y metabolismo. Reguladores de
Crecimiento. Tipos y características y reacciones del explante.
CAPÍT ULO II
CULTIVOS VEGETALES IN VITRO
CAPITULO II
¿Qué concepto tiene de
Cultivos Vegetales In vitro?
¿Qué objetivos persigue?
Historia de lo cultivos
vegetales?
¿Cuáles son los
fundamentos de los cultivos
vegetales?
PARA
RESPONDER
AL
FINALIZAR
LA CLASE
CULTIVOS VEGETALES IN VITRO
 En el avance logrado por las ciencias
biológicas en las últimas dos décadas se han
desarrollado técnicas que posibilita el estudio
de las plantas a nivel celular y molecular, ya
no solamente por reproducción sexual o
vegetativa. Estos nuevos enfoques conocidos
colectivamente como BIOTECNOLOGÍA, se
están convirtiendo en herramientas
poderosas para el mejoramiento el progreso
de la agricultura.
 El cultivo de tejidos es importante no
sólo porque es el área de la
biotecnología que tiene actualmente
mayor aplicación práctica en la
agricultura, sino por ser una
herramienta versátil para el estudio de
problemas básicos y aplicados de la
biología de las plantas, constituye en
efecto, el puente necesario para llevar
las manipulaciones genéticas desde
laboratorio hasta el campo.
CULTIVOS VEGETALES IN VITRO
Al cultivo de tejidos vegetales también se le
conoce como micropropagación o propagación
vegetal in vitro.
«el cultivo de tejidos in vitro que comprende,
en su acepción amplia, un heterogéneo grupo
de técnicas mediante las cuales un explante
(parte separada de un vegetal, por ejemplo:
protoplastos, célula, tejido, órgano) se cultiva
asépticamente en un medio de composición
química definida y se incuba en condiciones
ambientales controladas para su desarrollo».

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Por cultivos vegetales in vitro
se entiende el conjunto de
metodologías y de técnicas
que permiten el cultivo de
partes de una planta como
órganos, tejidos, células o
protoplastos en un
recipiente que contiene
sustancias nutritivas en
condiciones de
esterilidad y en
ambiente controlado.
 A Morgan (1901) se le atribuye el término de la
totipotencialidad celular.
 Haberlandt (1902) con la idea de la totipotencialidad
celular desarrolla el primer cultivo in vitro de tejidos
vegetales.
 White (1932) logra el primer cultivo in vitro estable
utilizando en sus experimentos ápices de raíces de
jitomate.
 En 1934 Gautheret logra proliferación celular in vitro
en tejidos cambiales provenientes de plantas adultas.
HISTORIA CULTIVOS VEGETALES IN VITRO
 En 1939 el mismo Gautheret, Nobecourt (en tejidos de
zanahoria) y White (en tejidos de tabaco) publican casi
simultáneamente la formación de una masa de células
parenquimatosas (callo) a partir de los explantes (tejidos)
utilizados en sus experimentos.
 Un factor importante en el desarrollo de las técnicas de
cultivo de tejidos vegetales, fue el descubrimiento de los
reguladoresde crecimiento.
 Overbeek (1941) observa el efecto de una sustancia
presente en el agua de coco que estimulaba la división
celular (efecto citocinínico). Cuando el agua de coco se
combinaba con 2,4-D, tenia un efecto positivo en el
desarrollo de tejidos de zanahoria y papa (Caplin y Steward
1948, 1952).
TOTIPOTENCIALIDAD
«Toda célula viviente de un organismo
multicelular es capaz de desarrollarse si se le
dan las condiciones externas apropiadas. La
célula tiene la habilidad de desarrollarse,
regenerando un organismo entero" (Dodds &
Roberts, 1982).
La nueva planta será genéticamente idéntica a la
planta madre, el desarrollo de ésta se da en un
periodo corto.
Se parte de la premisa:
A diferencia de las técnicas tradicionales de cultivo,
Permite
CULTIVOS VEGETALES IN VITRO
• Propagación de grandes volúmenes de plantas en
menor tiempo y en espacios reducidos.
• Obtención de plantas libres de patógenos.
• Plantas homocigotas.
• Producción de plantas en peligro de extinción.
• Estudios de ingeniería genética.
• Condiciones controladas de propagación.
• Espectro de especies, etc.

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Micropropagación
vegetal
El enorme potencial de esta
metodología ha propiciado
que en los últimos 25 años se
haya incrementado el número
de laboratorios de cultivo de
tejidos en el país para la
producción comercial de
plantas hortícolas,
ornamentales y frutales. VID
(Vitis vinifera)
ORQUIDEAS
(Cattleya sp.)
PIÑAPLÁTANO
(Musa paradisiaca)
 Estudios básicos de fisiología,
genética, bioquímica, y ciencias afines.
 Bioconversión y producción de
compuestos útiles
 Incremento de la variabilidad genética
 Obtención de plantas libres de
patógenos.
 Propagación de plantas.
 Conservación e intercambio de
germoplasma.
Los objetivos cultivo in vitro son:
1. Planta física: Laboratorio.
2. Métodos de cultivo.
3. Medios de cultivo: “Sustratos de
cultivo”.
4. Factores de micropropagación.
5. Técnica de siembra.
METODOLOGÍA DE LA
MICROPROPAGACIÓN
1. Planta física: Laboratorio.

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EQUIPOS DE LABORATORIO
EQUIPO
Autoclave y olla a presión, cámara de flujo laminar, destilador de
agua, balanzas: analítica y mecánica, estereoscopio binocular,
microscopio, cocinilla eléctrica, termómetro de máxima y mínima,
reloj horario, potenciómetro., refrigeradora, rotor magnético.
SEGURIDAD Y ASEPSIA EN EL
LABORATORIO DE CULTIVOS VEGETALES
2. Métodos de cultivo.
MÉTODOS DE MICROPROPAGACIÓN
MÉTODO DE
MICROPROPAGACIÓN
3. Medios de cultivo: “Sustratos de
cultivo”.
En los sistemas artificiales de cultivo del material separado de
la planta madre, es necesario adicionar al medio nutritivo
sintético todos aquellos nutrientes, vitaminas y reguladores
del crecimiento, que las células, tejidos u órganos recibirían a
través de las raíces o de los órganos fotosintetizadores de la
planta madre.
La regeneración depende de otros factores como la humedad,
la temperatura, la intensidad luminosa, el fotoperiodo y el
pH, entre otros.

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Mezcla de sustancias.
Sustancias orgánicas: N, P, K, Ca , Mg, Cl, Na,
Cu, Zn, Mn, Fe, Bo, Mo, Co y I.
Suplementos orgánicos complejos: leche de
coco, extracto de levadura.
Reguladores de crecimiento: Auxinas
Citoquininas, AG3, etc.
Fuente de carbono sacarosa: azúcar
Medio: semi-solido- solido- líquido.
MEDIOS DE CULTIVO
SALES MINERALES
MEDIO MURASHIGE Y
SKOOG
(MS) (1962)
MACRONUTRIENTES (mg/l) (mM)
NH4NO3 1650 20,60
KNO3 1900 18,80
CaCl2. 2H2O 440 3,0
MgSO4. 7H2 O 370 1,5
KH2 PO4 170 1,25
MICRONUTRIENTES (mg/l) (mM)
KI 0,83 5
H3 BO3 6,30 100
MnSO4. 4H2O 22,30 100
ZnSO4. 7H2O 8,60 30
CuSO4. 5H2O 0,025 0,1
CoCl2. 6H2O 0,025 0,1
Na2MoO4. 2H2O 0,250 1,0
Na2 EDTA 37,30 100
FeSO4.7H2O 27,80 100
VITAMINAS (mg/l) (µM)
Ácido Nicotínico 0,5 4,06
Pyridoxina HCl 0,5 2,43
Tiamina HCl 0,1 0,296
Glicina 2 26,6
CUADRO Nº 1 FUENTES Y FUNCION DE LOS MACRONUTRIENTES IN VITRO EN
LAS PLANTAS
MACROEL
EMENTOS
FUENTES DEL ELEMENTO
PARA ADICIONAR AL
MEDIO DE CULTIVO
ROL DETERMINADO
Nitrógeno
(N)
- Nitrato (NO3), Amonio (NH4)
- Nitrato de Amonio (NH4NO3)
Importante en la formación de proteínas.
Estimula el crecimiento de la planta.
Elemento correspondiente de la clorofila, alcaloides, ácidos nucleicos, algunas
fitohormonas y aminoácidos.
Fósforo (P) - Fosfato de Potasio (KH2PO4)
- Cloruro de Potasio (KCl)
Esta presente en forma abundante en las células meristemáticas (componente de la
lecitina y ácidos nucleicos).
Es necesario para ciertos procesos enzimáticos como la formación de alcohol a partir
de azúcares y las transformaciones de azúcares en almidón y viceversa.
Potasio (K) - Nitrato de Potasio (KNO3)
- Fosfato de Potasio (KH2PO4)
- Cloruro de Potasio (KCl)
Actúa como catalizador de varias enzimas siendo necesario para los siguientes
procesos:
- Síntesis de azúcares y almidón. Reducción de nitratos.
- Síntesis de clorofila y sntesis de proteínas.
- División normal de la célula.
Calcio(Ca) - Cloruro de Calcio
(CaCl2).2H2O
- Nitrato de Calcio
[Ca(NO3)2.4H2O]
Elemento constitutivo de las paredes celulares en forma de pectato de calcio.
Influye en la permeabilidad de la membrana celular, facilitando el movimiento de
carbohidratos y de aminoácidos en toda la planta.
Promueve el desarrollo de la raíz.
Magnesio
(Mg)
- Sulfato de Magnesio
(MgSO4.7H2O)
- Forma parte importante de la molécula de clorofila.
- Esta presente en el cloroplasto actuando como co-factor enzimático en una serie de
reacciones bioenergéticas de la fotosíntesis.
- Actúa como cofactor en casi todas las reacciones metabólicas de la respiración.
Azufre (S) - Sulfato (SO4) -Impulsa el desarrollo radicular y el pigmento verde profundo del follaje.
-Componente de los aminoácidos cistina, cisteína y metionina
Cloro (Cl) - Cloruro de Potasio (KCl)
- Cloruro de Calcio (CaCl.H2O)
-Componente para estimular la fotosíntesis.
Medio nutritivo: : Reguladores de crecimiento
Auxina
0.01 a 10 mg/l
• Acido indol Acético (AIA)
• Acido Indol Butirico
(IBA)
• Acido Naftalén Acético
(ANA)
• 2-4 D
Se disuelven en NaOH 1N
Citoquininas
0.03 a 10 mg/l
• Bencil adenina-(BA)
• Bencil amino purina (BAP)
• 2ip
• Zeatina
• Tridiazuron.
Se disuelven en HCl 1N
Giberelinas
Acido Giberélico(GA3)
elongación de tallos
En cultivo de meristemos
a. PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK
a.1. Preparación de soluciones stock de sales
nutritivas:
- Pesado de reactivos
- Preparación de soluciones
stock
b.2. Preparación de soluciones
stock de reguladores de
crecimiento.
b.3. Preparación de soluciones
stock para ajustar el ph.
Es una operación muy importante ya que los pesos deben ser
exactos y el equipo debe estar en buenas condiciones.
Manejo de la balanza analítica:
1. Se debe de verificar que la lectura de la pesada este en cero y
realizar el cálculo del reactivo que se va a pesar.
2. Colocar el papel aluminio, leer su peso, echar el reactivo
hasta alcanzar el peso calculado empaquetarlo y rotularlo.
3. Limpiar los platillos con un algodón y retirar las sustancias
químicas que hayan caído; para evitar la oxidación y
corrosión de los platillos.
1. PESADO DE REACTIVOS

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Pesar los siguientes
reactivos:
REACTIVOS PESO/GRAMOS
NH4 NO3 16,5 g
KNO3 19,0 g
CaCl2 .2H2O 4,4 g
KH2PO4 1,7 g
KI 0,223 g
H3BO3 0,063 g
MnSO4.4H2O 0,086 g
CuSO45H2O 0,085 g
CoCl2.6H2O 0,025 g
Na2MoO4.2H2O 0,0025 g
ZnSO4.7H2O 0,0025 g
•PREPARACIÓN DE SOLUCIÓN STOCK Ax10
Disolver cada reactivo
uno a uno con la ayuda
del agitador magnético
en 1000 ml de agua
destilada estéril.
REACTIVOS PESO/GRAMOS
SOLUCIÓN STOCK Bx10
MgSO4 7H2O 3,7g
SOLUCIÓN STOCK Cx10
Na EDTA 0,3725 g
FeSO4.7H2O 0,2785 g
SOLUCIÓN STOCK Dx10
Mio inositol 1g.
SOLUCIÓN STOCK Ex25
Glicina 0,0500 g.
Tiamina HCl 0,0100 g
Ac. Nicotínico 0,0120 g.
Piridoxina 0,0125 g.
•PREPARACIÓN
DE SOLUCIÓN
STOCK :
•Bx1O
•Cx10
•Dx10
•Ex25
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK PARA
AJUSTAR EL PH
Volumen: 100 ml.
b) SOLUCION STOCK DE HIDROXIDO DE POTASIO 1N (KOH)
Volumen: 100 ml.
Colocar 50 ml de
agua destilada en
un Beacker de
100 ml
Pesar 5,6 g. de
KOH y
disolverlo
Completar a
100 ml con
agua destilada
Conservarlo en
un frasco ámbar
a temperatura
ambiente
Colocarlo en
un Beacker de
100 ml
Añadirle 91,4
ml de agua
destilada
Conservación
en un frasco
ámbar a
temperatura
ambiente
Extraer
8,6 ml de H Cl
a) SOLUCION STOCK DE ACIDO CLORHIDRICO 1N (H Cl) REGULADOR DE CRECIMIENTO PESO/GR. CONCENTRACIÓN
BENCILAMINO PURINA
BAP
0,0225 g 1mM
KINETINA
KIN
0,0215 g 1mM
ACIDO INDOL ACÉTICO
AIA
0,02033g 1mM
2 -4, D 0,0221 g 1mM
ACIDO NAFTALEN ACETICO
AIA
0,2020 g 1mM
ACIDO GIBERELICO
AG3
0,03464 g 1mM
PREPARACIÓN DE SOLUCIONES STOCK DE
REGULADORES DE CRECIMIENTO
 Los requerimientos nutritivos para un crecimiento in
vitro óptimo varían con la especie, e incluso son
específicos de acuerdo a la parte de la planta que se
esté cultivando y a la respuesta que se desea obtener.
 Debido a estas necesidades específicas se han
desarrollado muchas formulaciones para los medios
de cultivo
MACRONUTRIENTES FORMULA
P.M.
g
Murashigue y Skoog
(MS) mg/l
Knudson C
mg/l
Vacin y Went
mg/l
Jones
mg/l
Nitrato de amonio NH4NO3 80,04 1 650 --- --- ---
Nitrato de calcio Ca(NO3)2.4H2O 236,15 ---- 1 000 --- 500
Nitrato de potasio KNO3 101,1 1 900 --- 525 ---
Sulfato de amonio (NH4) 2SO4 --- 500 500 1 000
Cloruro de potasio KCl 74,56 --- --- --- 250
Cloruro de calcio CaCl2.2H2O 147,0 440 --- --- ---
Sulfato de magnesio MgSO4 .7H2O 246,5 370 250 250 250
Fosfato de potasio KH2PO4 136,1 170 250 250 250
Sulfato ferroso FeSO4.7H2O 278,03 --- 25 --- ---
Fosfato tricálcico Ca3 (PO4) 2 --- --- 200 ---
Tártrato férrico Fe2 (C4H4O6) 3 --- --- 28 ---
MICRONUTRIENTES
Sulfato de manganeso MnSO4.4H2O 233,01 22,30 7,50 7,50 7,50
Acido bórico H3BO3 61,83 6,30 0,056 --- ---
Sulfato de cobre CuSO4 .H2O --- 0,040 --- ---
Acido molíbdico MoO3 --- 0,016 --- ---
Sulfato de zinc ZnSO4.7H2O 237,2 8,60 0,331 --- ---
Yoduro de potasio KI 166,01 0.83 --- --- ---
Molibdato de sodio NaNoO4.2H2O 241,95 0,25 --- ---
Sulfato de cobre CuSO4.5H2O 249,68 0,025 --- --- ---
Cloruro de cobalto CoCl2.6H2O 257,83 0,025 --- --- ---
SOLUCION DE HIERRO
Sal sódica Na – EDTA 372,35 37,3 --- --- 74,50
Sulfato ferroso Fe SO4.7H2O 278,02 27,80 --- --- 27.80
MEDIOS DE CULTIVO

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1000 ml de
MEDIO MS
Beacker 1000 :
400 H2Odestilada
estéril
+
100 - Solución A
+
50 - Solución
B, C, D
+
4 - Solución E
+
R.C. : fase de
propagación.
Ajustar el pH
* azúcar
*agar
(acuerdo al medio
a preparar).
PREPARACIÓN DE UN MEDIO DE CULTIVO A
PARTIR DE SOLUCIONES STOCK
Optimo .
5.2 y 5.8.
Después de añadir todos sus componentes, se procede a ajustar el
pH final al valor deseado, añadiendo OHNa 0.1 N o HCl 0.1N al
medio. Optimo . 5.2 y 5.8.
 Valores bajos, inferiores a 3.5 impiden la solidificación del agar
en los medios sólidos
 Si la evolución del pH del medio lo hace bajar por debajo de 3.5
se puede producir su licuación.
 El valor del pH puede afectar a la solubilidad de algunos
componentes del medio de cultivo
 El valor del pH puede afectar a la absorción de determinados
nutrientes por parte del explanto (p.e. la absorción de iones
NO3-aumenta con la acidez del medio)
 El valor del pH del medio puede afectar al pH del citoplasma y
como consecuencia a la actividad de muchos enzimas
pH
 De Fossard (1976) sugirió un experimentode amplio
espectro utilizando 4 grupos de los componentes más
frecuentementevitales en el medio nutritivo:
 Sacarosa: 1 - 2 - 4%
 Macro-sales (de acuerdo con Murashige y Skoog,1962):
Diluida 1/4 - 1/2 - 1/1
 Auxina (p.e., IBA): 0,01 - 0,5 - 5 mg l-1
 Citoquinina (p.e., BA): 0,01 - 0,5 - 5 mg l -1
 Las combinaciones de las tres concentraciones de cada
grupo producen un total de 34 = 81 medios diferentes, de
los que se elige el óptimo
¿Qué medio elegir? TAREA
1. FUNCIÓN DE LOS MACRONUTRIENTES EN PLANTAS
CULTIVADAS IN VITRO.
2.EFECTOS PRODUCIDOS POR LAS DEFICIENCIAS O
EXCESOS DE LOS MACRONUTRIENTES IN VITRO
3. FUNCIÓN DE LOS MICRONUTRIENTES EN PLANTAS
CULTIVADAS IN VITRO
4. EFECTOS PRODUCIDOS POR LAS DEFICIENCIAS O
EXCESOSDE LOS MICRONUTRIENTES
FUNDAMENTOS
Todas las células vivientes normales dentro del cuerpo de una planta poseen
la capacidad potencial para regenerar el organismo completo, es decir, para
expresar su totipotencia. Esta potencialidad ha sido explotada mediante el
cultivo de protoplastos, células, tejidos y órganos in vitro. En el material
cultivado ha sido posible estudiar la capacidad de formar órganos y embriones
adventicios para regenerar plántulas para la propagación clonal. La
organogénesis es el proceso por el que las células y tejidos son forzados a sufrir
cambios que conducen a la producción de un primordio de brote o raíz. En
contraste, la embriogénesis somática, conduce a la producción de una
estructura que forma un eje raíz/brote, con un sistema vascular independiente.
Las plantas, siendo organismos fotoautotróficos son capaces de utilizar la
energía luminosa para asimilar y convertir el CO2, el agua y nutrientes
inorgánicos en compuestos orgánicos necesarios para el crecimiento celular.
Una planta como organismo multicelular, es el resultado de las divisiones
mitóticas posteriores a la formación del cigoto.
Cada célula de la planta posee, por lo tanto, la misma información genética, es
decir son totipotentes.

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MATERIAL DE PARTIDA: PLANTA MADRE
Genotipo: Fácil regeneración en dicotiledóneas
(solanáceas, crucíferas) que en monocotiledóneas.
Edad : Partes juveniles mejor que las adultas
Estado del órgano o tejido: No leñosos
Estado fisiológico: Partes vegetativas(generativas).
Estado sanitario: Las más saludables y vigorosas
Año: Material proviene de campo
(inviernos severos ó veranos secos)
Condiciones de crecimiento: Diferente respuesta si
campo o invernadero.
Posición del explanto: Gradiente de regeneración en la
planta.
Tamaño del explanto: A mayor tamaño mayor
capacidad regenerativa.
 La porción vegetal que se
introduce in vitro se denomina
explanto. Ejemplo:
 El explanto es un meristema que
definimos como una porción de
la planta en activa división
celular.
 Esta porciones del vegetal que se
utilizan como material de partida
en programasde saneamiento se
encuentran carentes de virus.
Explanto
CALLOS
Tejidos no diferenciados ( a veces diferenciados), en
división activa
Frecuentemente se desarrollan a partir de heridas
En medio sólido, crecimiento lento, gran
heterogeneidad celular
Obtención de explanto y desinfección
En laboratorio
En invernadero
El procesode esterilización presenta, dos problemas:
 la capacidad de los agentes esterilizantes para dañar los
tejidos vegetales y
 la presenciade microorganismosen el interior de dichos
tejidos.
El hipoclorito de calcio en polvo en una concentración
de 35-100 g/l se puede usar. El material vegetal debe
permanecer sumergido entre 5-30 minutos y ser enjuagado
con agua estéril al finalizar.
Esterilización
Obtención de
segmentos

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PROCESO DE MICROPROPAGACIÓN
MULTIPLICACIÓN
ENRAIZAMIENTO
ESTABLECIMIENTO
ACLIMATACIÓN
FASES DE LA MICROPROPAGACIÓN
ACLIMATACIÓN
VIOLETA AFRICANA
( Saintpaulia ihonantha
.
Actualmente la micropropagación consiste en producir plantas a partir de
porciones muy pequeñas de ellas, de tejidos o células cultivadas en forma
aséptica, en un recipiente en que se pueden controlar estrictamente las
condiciones de ambiente y nutrición. La capacidad de ciertos tejidos
vegetales, como el callo y las suspensiones celulares, así como varios
órganos de plantas tales como tallos, flores, raíces y embriones de
crecimiento de manera más o menos indefinida, se han utilizado durante
varias décadas en los laboratorios científicos como unos instrumentos de
investigación por genetistas, botánicos y fitopatólogos. A estos métodos se
les ha llamado colectivamente cultivo de tejidos, una expresión que en
ocasiones se usa como sinónimo de micropropagación.
Los avances de la biotecnología moderna en el sector agrícola permiten
generar modificaciones importantes utilizando el cultivo de tejidos
vegetales.
Dependiendo del tiempo para el logro de resultados, los diferentes sistemas
de aplicación se pueden agrupar de la siguiente manera:
FUNDAMENTOS

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SISTEMASDEAPLICACIÓN
DECULTIVOSVEGETALES
II. SISTEMAS DE APLICACIÓN A
MEDIANO PLAZO
I. SISTEMAS DE APLICACIÓN
A CORTO PLAZO
III. SISTEMAS DE APLICACIÓN A
LARGO PLAZO
CAPITULO II
SISTEMAS DE APLICACIÓN DE CULTIVOS VEGETALESI. SISTEMAS DE APLICACION A CORTO PLAZO
A. Propagación clonal masiva
B. Estrategias de Propagación clonal masiva
1. Multiplicación de brotes
2. Organogénesis directa
3. Organogénesis indirecta
4. Embriogénesis somática
5. Órganos de perennidad
6. Microinjertos
7. Cultivo de embriones y esporas
C. Obtención de especies libres de patógenos
D. Conservación de germoplasmaarios
SISTEMASDEAPLICACIÓNDECULTIVOSVEGETALES
III. SISTEMAS DE APLICACIÓN A LARGO PLAZO
A. Hibridación somática
B. Ingeniería Genética
C. Producción de metabolitos
II. SISTEMAS DE APLICACIÓN A MEDIANO PLAZO
A. Mejoramiento Genético
B. Cultivo de anteras para producción de haploide
C. Rescate de embriones para recuperación de híbridos
D. Variación somaclonal
E. Mutagénesis
A. Propagación clonal masiva
En 1903 Herbert J. Webber, USA. Introdujo la palabra clon y lo aplicó a las
plantas cultivadas que se propagaban vegetativamente, deriva de una palabra
griega que significa ramita o vástago.
En 1912 el genetista George H Shull, recomendó que se ampliase el término para
incluir a los animales que aumentan su número o se multiplican por cualquier
método asexual y se aplique a todos los grupos de individuos genéticamente
idénticos que se originasen de la reproducción asexual de cualquier tipo.
La falta de homogeneidad absoluta en las poblaciones clonales era un factor que
causaba poca preocupación antes de la llegada de las técnicas de cultivo para
regenerar plantas superiores completas a partir de células somáticas.
En realidad durante mucho tiempo se ha reconocido que puede haber una
variación intraclonal debida a diferentes causas, entre las cuales están las
interacciones genotipo- ambiente y un tipo de "covariación no genética".
Los clones o las poblaciones agregadas que se producen por métodos
convencionales no se forman, por lo regular "horizontalmente", es decir, durante
una generación, sino que lo hacen verticalmente a través del tiempo, generación
tras generación, en cambio las técnicas del cultivo aséptico que incluyen
grandes números de propágulos muy pequeños o de células han cambiado
dramáticamente el potencial hacia lo horizontal.
SISTEMASDEAPLICACIÓNACORTOPLAZO
1. Multiplicación de brotes de yemas
terminales, axilares o laterales, siendo el punto
de inicio los meristemos, puntas de brotes,
yemas, nudos o brotes de yemas en raíces.
En los años 60, el desarrollo de procedimientos
para multiplicar y mantener plantas en cultivos
asépticos recibió un gran impulso con el trabajo en
Orquídea Cymbidium sp, para producir
protuberancias que semejan protocormos
normales capaces de crecer y desarrollarse en
plántulas.
ESTRATEGIASPARALAPROPAGACIÓNCLONAL-CORTOPLAZO
ESTRATEGIAS PARA LA PROPAGACION CLONAL
2. organogénesis directa.
En este caso la formación del brote adventicio o
de la raíz ocurre en el explante de un órgano, o
en alguna parte de la planta; como por ejemplo
en Violeta africana Saintpaulia sp. A partir de
explantes del peciolo o de la base foliar. Los
órganos o partes de plantas que contienen
rudimentos de yemas o que tienen un potencial
para la producción de meristemas adventicios.
ESTRATEGIASPARALAPROPAGACIÓNCLONAL-CORTOPLAZO

11. 29/09/2016
11
SISTEMAS A CORTO PLAZO
MICROPROPAGACIÓN
- HOJAS
GLOXINEA
( Sinningia speciosa)
3. La organogénesis indirecta.
Se basa en el trabajo de Folke Skoog y colegas en 1950, en un cultivar de
tabaco Nicotiana tabacum. Los tejidos fueron expuestos a niveles
expuestos a diferentes concentraciones de citoquininas y auxinas,
promotoras de división celular.
La Adenilcitoquinina (KIN), fue la primera químicamente identificada; por
primera vez los investigadores pudieron añadir al medio de cultivo
combinaciones químicas conocidas, las auxinas y citoquininas que podían
estimular la división celular. Además al manipular los niveles exógenos de
KIN y auxina, pudieron fomentar el desarrollo del brotes o de la raíz en los
cultivos de callos.
Si buscamos multiplicación estrictamente clonal, no se debe recurrir a la
organogénesis indirecta ya que se evidencia que exista en la formación de
callos a menudo la base para obtener variación genética e inestabilidad.
Por otra parte si se quiere inducir o utilizar la organogénesis indirecta por
la vía del callo como un medio para fomentar la variación somaclonal y
producir así un cambio deseado en el genotipo o el fenotipo, se encuentran
a veces restringidos por falta de conocimientos suficientes sobre la
estimulación de la morfogénesis a partir de callos presumiblemente no
diferenciados.
La formación del brote adventicio o de la raíz ocurre en este caso en el
callo; es obvio que el callo se deriva inicialmente de un órgano, tejido y
otra parte escindida de la planta.
ESTRATEGIASPARALAPROPAGACIÓNCLONAL-CORTOPLAZO4. La embriogénesis somática. A mediados de los 50
y finales de esa década fue posible obtener,
mantener y hacer crecer células aisladas de plantas
y a principios de los 60 un estudio adicional sobre el
cultivo de estas células en suspensión en medio
líquido mostró que en algunos casos tales células
podían formar embriones somáticos capaces de
desarrollarse en plantas y que en este sentido se
comportaban como embriones cigóticos. Los
embriones pueden formarse directamente en el
explante primario, o indirectamente de las células
cultivadas en suspensión o en un medio semisólido.
Los órganos de perennidad, formados en cultivos
asépticos. Ej tuberculillos en papa.
ESTRATEGIASPARALAPROPAGACIÓNCLONAL-CORTOPLAZO
SISTEMAS A CORTO PLAZO
SISTEMAS A CORTO PLAZO

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TUBERIZACION IN VITRO VARIEDADES NATIVAS TUBERIZACION IN VITRO
5. El microinjerto.
6. Cultivo de embriones y esporas.
En el caso de embriones podemos ver que
dependen en muchos casos de condiciones
exógenas para su germinación como inhibidores
u otros factores medio ambientales; el cultivo
aséptico se ha convertido en un procedimiento
ampliamente utilizado y de rutina para el
"rescate" de los embriones que normalmente no
crecen ni se convierten en plántulas
ESTRATEGIASPARALAPROPAGACIÓNCLONAL-CORTOPLAZO
B. Obtención de plantas libres de patógenos
Los vegetales superiores poseen en las extremidades de los
tallos un pequeño grupo de células jóvenes que permanecen
en estado embrionario, las cuales se dividen y generan
tejidos y órganos como tallos, hojas y flores. Este tejido se
denomina meristemo apical y tiene la forma de una cúpula
diminuta, de aproximadamente de 0.1 a 1.0 mm de diámetro,
esta estructura tiene la particularidad de perpetuarse a sí
misma.
Una de las ventajas en la utilización del cultivo de
meristemo es sin lugar a dudas, su aplicación en la
eliminación de virus, viroides y micoplasmas. En otras
especies vegetales leñosas como los cítricos, vid, manzana y
otros es necesario utilizar el sistema conocido como
microinjertación el cuál consiste en insertar sobre patrones
conocidos y seleccionados el tejido meristemático.
SISTEMADEAPLICACIÓNACORTOPLAZO
SISTEMAS A CORTO PLAZO
Cultivo de meristemos y
termoterapia
C. Conservación de germoplasma
Para muchos cultivos la semilla es la forma más
apropiada de almacenamiento, lo cual se realiza en
condiciones de bajas temperaturas y baja
humedad. Sin embargo los cultivos in vitro
permiten mantener por períodos prolongados y a
bajas temperaturas gran cantidad de material
vegetal, como plántulas, tejidos somáticos, órganos
y células. Este sistema permite conservar
colecciones grandes de germoplasma en espacios
pequeños, reduciendo al máximo los costos.
SISTEMADEAPLICACIÓNACORTOPLAZO

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.
A. Mejoramiento genético
La incidencia de la variabilidad genética en los cultivos de
tejidos vegetales depende de la orientación de los sistemas
in vitro, la utilización de los medios de cultivo y de
determinados géneros, especies y/o genotipos.
B. Cultivo de anteras para la producción de plantas
haploides
Un factor determinante para el cultivo del polen es
precisamente su estado de desarrollo para lo cual es
necesario realizar observaciones microscópicas. El propósito
del cultivo de anteras o androgénesis es el de producir
plantas haploides mediante la inducción de la
embriogénesis y su posterior regeneración. Las plantas
resultantes pueden emplearse en programas de
mejoramiento para la selección de características deseables,
así como también para desarrollar líneas homocigóticas para
la producción de híbridos interespecíficos.
SISTEMADEAPLICACIÓNAMEDIANOPLAZO
C. Rescate de embriones Recuperación de híbridos en cruces
interespecíficos o intergenéricos
Se ha estado utilizando el cultivo de embriones zigóticos con el propósito
de recuperar híbridos, los cuales abortan debido a la incompatibilidad,
resultante de cruces interespecíficos o intergenéricos. Los efectos
fisiológicos ocurridos en el ámbito de la semilla impiden o limitan el
desarrollo de los embriones, en estos casos, la extracción del embrión y su
cultivo en un medio nutritivo adecuado permite el desarrollo óptimo de
la plántula.
D. Variación somaclonal para producir cambios genéticos
importantes
La variación somaclonal es también conocida como variabilidad genética,
la cual se obtiene de los cultivos in vitro. Puede ser observada por
cambios en el número de cromosomas, fragmentación nuclear y cambios
epigenéticos.
E. Mutagénesis
Las mutaciones inducidas han constituido una valiosa herramienta para
los fitomejoradores. La posibilidad de ampliar la variabilidad genética de
las poblaciones vegetales facilita la selección con mayor eficiencia. Los
mutagénicos ofrecen la oportunidad de obtener cambios genéticos
discretos sin que se produzca una grave destrucción del genotipo
original.
SISTEMADEAPLICACIÓNAMEDIANOPLAZOA. Hibridación somática
Las células vegetales desprovistas de su pared por
acción enzimática son conocidas como protoplastos,
estas estructuras facilitan la fusión de especies
diferentes para producir los llamados híbridos
somáticos, cuya constitución génica difiere de las
células que los originaron.
Los protoplastos constituyen los receptores más
apropiados para la transferencia de genes,
macromoléculas y organelos celulares de
preferencia cloroplastos o mitocondrias, y por
consiguiente la posible incorporación a una células
de un nuevo control genético para producir nuevas
enzimas y otros componentes deseados.
SISTEMADEAPLICACIÓNLARGOPLAZO
SISTEMAS DE APLICACIÓN A LARGO PLAZO
HIBRIDACIÓN SOMÁTICA
B. Ingeniería Genética
La identificación y análisis del sistema patogénico producido por la
bacteria Agrobaterium tumefaciens en la formación de tumores en algunas
plantas, han contribuido a la realización de investigaciones orientadas a
la transformación genética de plantas.
Los tumores producidos por la bacteria Agrobacterium tumefaciens
proliferan con rapidez debido a que no obedecen a los mecanismos
normales de control del crecimiento celular. Esta bacteria presenta en el
interior de la célula un fragmento circular de ADN llamado plásmido
inductor de tumor (Plásmido Ti), el cuál es el responsable de la
inducción de tumores en las plantas, así como de la síntesis y
metabolismo de las opinas. Otro vector de transformación utilizado en el
genoma celular de vegetales es el plásmido inductor de raíces (Plásmido
Ri) en la bacteria Agrobacterium rhizogenes.
El intento de introducir genes o fragmentos de ADN que puedan
transmitir a otras células un fragmento de ADN extraño, ha sido
particularmente estudiado por algunos investigadores con el objeto de
producir nuevas especies vegetales cultivadas.
SISTEMADEAPLICACIÓNLARGOPLAZO
SISTEMAS A LARGO PLAZO

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SISTEMADEAPLICACIÓNLARGOPLAZO
C. Obtención de metabolitos secundarios útiles en la
medicina, alimentación e industria
Las plantas superiores acumulan sustancias muy variadas,
producto de su metabolismo secundario, las cuáles han
sido explotadas por el hombre desde hace muchos años.
El potencial en la producción de compuestos útiles de
algunas plantas permite asumir un futuro promisorio en el
incremento de compuestos de interés en la medicina,
alimentación e industria. Los cultivos celulares in vitro
ofrecen la posibilidad de obtener sustancias de aplicación
industrial como el caso de la shikonina obtenida de
Lithospermum erythrorhizon, pigmento rojo utilizado en
cosmetología que ha sido desarrollado y comercializado
por el Japón. V. Pétiard y sus colaboradores en Francia han
estado estudiando en Catharantus roseus a partir de
segmentos de hojas, la producción de alcaloides de efectos
antitumorales y antihipertensores.
SISTEMADEAPLICACIÓNLARGOPLAZO
MICROPROPAGACIÓN
NO
CONVENCIONAL
PROPAGACIÓN
RÁPIDA
TOTIPOTENCIA
CELULAR
PERMITE LA
ELIMINACIÓN DE
PATÓGENOS
PROPAGACIÓN
SEXUAL Y
ASEXUAL
RESCATE DE
ESPECIES EN
EXTINCIÓN
ESTABLECE
BANCOS DE
GERMOPLASMA