Este documento describe diferentes métodos de tinción para microorganismos. Explica la tinción simple con azul de metileno, la tinción negativa con tinta china para visualizar cápsulas, y la tinción de Gram para diferenciar bacterias Gram positivas de Gram negativas. Además, detalla técnicas para teñir esporas como la de Schaeffer-Fulton y la tinción de Ziehl-Neelsen para bacterias ácido-alcoholesistentes.

1. MINISTERIO DE SALUD Y EDUCACION
ESCUELA DE SALUD BOLIVIANO JAPONESA DE COOPERACIÓN ANDINA
INSTITUTO TECNOLOGICO DEL SUR
METODOS DE TICCIÓN
DOCENTE: LIC. RAMIRO
NOMBRES: MELISSA BHETZA PINTO MENDOZA
CARRERA LABORATORIO CLÍNICO

2.  Los microorganismos son demasiado pequeños para observarse a simple vista:
protozoos, algas, hongos, bacterias y virus. Estos microorganismos difieren en
características tales como forma de nutrición, estructura, tamaño, composición
entre otros aspectos; es por ello que se emplea el estudio microscópico el facilita
la observación.
 Una tinción es una técnica auxiliar utilizada en microscopía para mejorar el
contraste en la imagen vista al microscopio. Los colorantes y tinturas son
sustancias que usualmente se utilizan en biología y medicina para resaltar
estructuras en tejidos biológicos que van a ser observados con la ayuda de
diferentes tipos de microscopios. Los diferentes colorantes pueden ser utilizados
para aumentar la definición y examinar grandes cortes de tejido o poblaciones
celulares.
INTRODUCCIÓN

3.  Tinción simple: Consiste en la aplicación de un solo colorante a la muestra,
esta debe ser posterior a la fijación de la misma, permitiendo la visualización
de la morfología bacteriana. Uno de los colorantes más indicados es el azul de
metileno, que actúa rápida y suavemente sobre todas las células bacterianas y
no oscurece los detalles celulares. Además, es especialmente útil para detectar
la presencia de bacterias en muestras naturales puesto que la mayor parte del
material no celular no se tiñe.
 Tinción negativa: Es un tipo de tinción simple pero con ciertas diferencias, ya
que nos permite observar características estructurales de la bacteria además
de su morfología, se caracteriza por no necesitar fijación previa y nos permite
visualizar sobre un fondo oscuro la forma de la bacteria además de alguna otra
característica estructural, como es la presencia de cápsulas.
 Tinciones diferenciales: Se necesitará fijación previa generalmente por calor,
además se utilizarán dos colorantes, siendo el último el colorante de contraste.
Una de las características más importantes es que además de visualizar la
morfología nos permite observar la composición de la pared bacteriana, su
resistencia a la decoloración ácida, etc.; como sucede en la tinción de Gram y
en la tinción de Ziehl-Neelsen
TIPOS DE TICCIONES

4. Una tinción simple se lleva acabo cubriendo con un colorante un frotis seco y
fijado al calor. Esta tinción es usada para teñir una gran variedad de
microorganismos. El colorante más utilizado para esta tinción es el azul de
metileno de Loeffler
TICCIÓN SIMPLE
Existen varios colorantes básicos, los más empleados son:
 Azul de metileno.
 Violeta de cristal.
 Verde malaquita.
 Fucsina básica.
Todos estos colorantes funcionan bien en las bacterias porque tienen iones de
color (cromóforos) con carga positiva (catiónicos).
Los tiempos de tinción para la mayoría de estos colorantes son relativamente
cortos. Generalmente oscilan entre los 30 segundos hasta los 2 minutos,
dependiendo de la afinidad del tinte.
Es importante tener en cuenta que antes de teñir una muestra mediante tinción
simple, esta debe ser extendida y fijada a la lámina de vidrio (portaobjeto); a la
muestra extendida y fijada se le llama frotis.

5. MATERIAL Y EQUIPO:
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS:
 Aceite de inmersión
 Solución salina
 Azul de metileno de Loeffler
MATERIAL BIOLÓGICO :
 Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus.
TICCIÓN SIMPLE
PROCEDIMIENTO
1. Preparar un frotis como y dejar secar
perfectamente.
2. Cubrir el frotis con azul de metileno de
Loeffler por un minuto.
3. Lavar con agua corriente suavemente y
dejar secar.
4. Observar con el objetivo de inmersión

6. Un método sencillo de tinción para bacterias, que además es un claro caso de
cromofobia y que por lo tanto funciona aun cuando los métodos de tinción positiva
fallan, es la tinción negativa. Esto puede ser conseguido simplemente extendiendo
la muestra en un portaobjetos y aplicando directamente sobre ella una gota de
nigrosina o tinta china y cubriendo luego la muestra humedecida con un
cubreobjetos. Luego de esto, los microorganismos pueden ser observados
fácilmente por medio de microscopía en campo claro como inclusiones claras muy
bien contrastadas contra el medio oscuro que las rodea
TICCIÓN NEGATIVA
Los preparados con tinta china o nigrosina se usan para exámenes microscópicos
directos de cápsulas de muchos organismos, los finos gránulos de la tinta china
dan un fondo semiopaco contra el cual pueden verse claramente las cápsulas.
Este método colorea fondo, dejando la célula incolora
y transparente. Existe una variante de esta coloración hecha por Bonifaz, donde
se utiliza fucsina para dar coloración a las células dejando incoloras las cápsulas,
dando la imagen de un cielo estrellado. Esta tinción se utiliza para detectar el
hongo Cryptococcus neoformans, a las cápsulas de
Klebsiellas y algunas veces también para identificar espiroquetas las cuales no se
pueden teñir fácilmente con colorantes básicos.

7. PARA CAPSULAS
MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS
 Tinta china
 Agua destilada
 Azul de metileno
 Aceite de inmersión
MATERIAL BIOLÓGICO
 Cepa: Klebsiella pneumonia
MÉTODO DE GIN - TICCIÓN NEGATIVA

8. TÉCNICA
1.- En un portaobjetos mezclar una gota de agua y una gota de tinta china.
2.- Añadir una asada de la bacteria y hacer una suspensión con la mezcla.
3.- Extender la suspensión suavemente por el portaobjetos.
4.- Secar al aire el frotis. No fijar a la llama.
5.- Contrateñir con azul de metileno.
6.- Lavar con agua corriente y dejar secar. Observar con aceite de inmersión.
INTERPRETACIÓN
Las cápsulas se observan transparentes en un fondo negro y el cuerpo de la
bacteria se observa de color azul.
MÉTODO DE GIN - TICCIÓN NEGATIVA

9. PARA CAPSULAS
MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS
 Azul de metileno
 Sulfato de cobre al 20%
 Aceite de inmersión
MATERIAL BIOLÓGICO
 Cepa: Klebsiella pneumoniae
MÉTODO DE HISS - TICCIÓN NEGATIVA

10. PROCEDIMIENTO
1.- Realizar un frotis.
2.- Teñir con azul de metileno durante un minuto.
3.- Lavar con agua corriente.
4.- Lavar con la solución de sulfato de cobre al 20%.
5.- Dejar secar y observar con aceite de inmersión.
6.- Anotar observaciones.
INTERPRETACIÓN
Las cápsulas se observan de un ligero color café.
MÉTODO DE HISS - TICCIÓN NEGATIVA

11. PARA ESPORAS
MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen y lámpara de alcohol
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS
 Aceite de inmersión
 Verde de malaquita
 Safranina
 Desinfectante
MATERIAL BIOLÓGICO:
 Cepa: Bacillus subtilis o Bacillus Clausii.
MÉTODO DE SCHAEFFER-FULTON - TICCIÓN NEGATIVA

12. PROCEDIMIENTO
1.- Teñir con verde de malaquita.
2.- Calentar hasta emisión de vapores de 3 a 5 minutos.
3.- Lavar con agua corriente durante 30 segundos.
4.- Contrateñir con safranina durante 1 minuto.
5.- Lavar con agua corriente y dejar secar.
6.- Observar con aceite de inmersión.
INTERPRETACIÓN
Las esporas se observan como una estructura de color verde en el centro o en la
orilla de la bacteria.
MÉTODO DE SCHAEFFER-FULTON - TICCIÓN NEGATIVA

13. Existe otra técnica para teñir las esporas:
MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Lámpara de alcohol
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS
 Ácido acético al 5%
 Azul de metileno
 Aceite de inmersión
 Fucsina fenicada
 Desinfectante
MATERIAL BIOLÓGICO
 Cepa: Bacillus subtilis o Bacillus clausii
TICCIÓN NEGATIVA (ESPORAS)

14. PROCEDIMIENTO
1.- Hacer un frotis.
2.- Cubrir el frotis con la fucsina fenicada y calentar hasta emisión de vapores.
3.- Decolar con ácido acético al 5%, hasta que el frotis tome un ligero color rosa.
4.- Lavar con agua corriente.
5.- Teñir con azul de metileno de Loeffler durante tres minutos
6.- Lavar con agua corriente, dejar secar y observar con aceite de inmersión.
INTERPRETACIÓN
 Las esporas se observan de una coloración rosa.
MÉTODO DE SCHAEFFER-FULTON - TICCIÓN NEGATIVA

15. Esta tinción es una de las más comúnmente usadas en microbiología, el
mecanismo de reacción de los colorantes de Gram, actúan en la estructura y
composición de la pared celular.
TICCIÓN DE GRAM
Las bacterias Gramnegativas contienen un porcentaje más alto de lípidos que las
bacterias Grampositivas, la pared celular de las Gramnegativas son también más
delgadas que las Grampositivas por lo que no retienen el colorante inicial cuando
se les agrega el alcohol acetona.
Está tinción utiliza cuatro reactivos que son: Cristal Violeta, lugol o yodo de Gram,
etanol – acetona al 95% y safranina. El cristal violeta que es el colorante inicial
tiñe a todos los microorganismos, a que es un colorante básico, en segundo lugar
está el yodo que actúa como mordiente para aumentar la afinidad entre el
colorante inicial y la célula. El etanol actúa como decolorante sobre el
microorganismo, lavando el colorante inicial en caso de que no se afín con este.
La safranina es el colorante usado como contraste que teñirá a los
microorganismos que no se colorean con el cristal violeta

16. MATERIAL Y EQUIPO
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen
 Microscopio
 Puente de tinción
REACTIVOS
 Aceite de inmersión
 Desinfectante
 Solución salina
 Metano
 Cristal violeta
 Lugol de Gram
 Alcohol-acetona
 Safranina
MATERIAL BIOLOGICO
 Cepas: Escherichia coli y Staphylococcus aureus
TICCIÓN DE GRAM

17. PROCEDIMIENTO
1.- Se preparan frotis de las cepas proporcionadas de manera adecuada.
2.- Se recomiendan fijar las muestras biológicas con metanol por un minuto.
3.- Los frotis se tiñen con cristal violeta durante un minuto.
4.- Lavar con agua corriente.
5.- Teñir con lugol 30 segundos.
6.- Lavar con agua corriente.
7.- Decolorar con alcohol – acetona 30 segundos.
8.- Lavar con agua corriente.
9.- Se tiñe con safranina de 25 a 30 segundos.
10.- Lavar con agua corriente y dejar secar.
11.- Observar con objetivo 10X para identificar el campo, e inmediatamente pasar
a objetivo 100X,
colocando una gota muy pequeña de aceite de inmersión.
INTERPRETACION
 Microorganismos color violeta: Gram positivos
 Microorganismos color rosado: Gram negativos
TICCIÓN DE GRAM

18. La tinción de Ziehl-Neelsen es un tipo de tinción diferencial rápida y económica,
usada para la identificación de bacterias ácido-alcohol resistentes (BAAR) , como
M. tuberculosis o el filo Apicomplexa (coccidios intestinales) entre otros. Fue
descrita por primera vez por dos médicos alemanes: Franz Ziehl, un bacteriólogo,
y Friedrich Nielsen, un patólogo.
TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN
Los bacilos Acido – resistentes se denominan así por que están rodeados por una
envoltura cérea que es resistente a la tinción. Por eso es necesario calor para que
el colorante penetre en la cápsula, una vez teñidos los microorganismos resisten a
la decoloración.
Esta tinción consta de tres reactivos: Carbolfucsina, alcohol ácido al 3% y azul de
metileno.
Los carbolfucsina se utiliza para la tinción primaria ya que atraviesa el material
céreo de los bacilos ácido – resistentes. Se aplica calor con la llama de una
lámpara de alcohol o de un mechero para que
el colorante penetre en la cápsula. El alcohol ácido se utiliza para decolorar; las
bacterias ácido – resistentes no sufren decoloración mientras que otras bacterias
se destiñen. El azul de metileno sirve como colorante de contraste

19. MATERIAL EQUIPO
 Portaobjetos
 Asa bacteriológica
 Mechero Bunsen o lámpara de alcohol
 Microscopio
 Aceite de inmersión
 Puente de tinción
REACTIVOS
 Desinfectante
 Solución salina
 Fucsina fenicada
 Alcohol-ácido
 Azul de metileno
MATERIAL BIOLOGICO
 Muestra en esputo sospechosa de Mycobacterium tuberculosis.
TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN

20. PROCEDIMIENTO
1.- Se prepara un frotis de la muestra, dejándola secar.
2.- Se cubre perfectamente con fucsina.
3.- colocar sobre un puente de vidrio el portaobjetos y con una lámpara de
alcohol, calentar hasta que haya emisión de vapores, durante 5 minutos, sin
hervir, en caso de que el frotis llegase a secarse se agrega más fuscina y se sigue
el tiempo.
4.- Enjuagar con agua corriente.
5.- Decolorar con alcohol – ácido 30 segundos.
6.- Lavar con agua corriente.
7.- Teñir con Azul de metileno durante 30 segundos. Dejar secar el frotis.
8.- Observar con objetivo 10X identificar el campo, e inmediatamente pasar a
objetivo 100X, colocar una gota muy pequeña de aceite de inmersión, observar.
INTERPRETACIÓN
 Microorganismos color rosa son conocidos como BAAR (Bacilos Ácido Alcohol
Resistentes).
 Esta tinción es utilizada principalmente para identificar el agente causal de la
tuberculosis
TINCIÓN DE ZIEHL – NEELSEN

21.  La tinción de Wright es una técnica que se emplea generalmente para la
diferenciación de elementos celulares de la sangre y es clasifica cada como
una tinción policromática, dado que puede teñir compuestos ácidos básicos
presentes en una célula.
Fundamento
 Consiste en azul de metileno y sus productos de oxidación, así como eosina Y
o eosina B. La acción combinada de estos colorantes produce el efecto
Romanowsky que da una coloración púrpura a los núcleos de los leucocitos y a
los gránulos neutrofílicos y da color rosado a los eritrocitos. La tinción de
Wright cuyo colorante está compuesto de azul de metileno (que tiñe de color
azul las partes ácidas de las células) y eosina (que tiñe las partes alcalinas)
disueltos en metanol (que permite la fijación de las células), adicionando a la
preparación buffer de fosfatos (que rehidrata a las células después de la
exposición con metanol).
 La eosina Y, colorante ácido, se fija a los agrupamientos básicos de las
moléculas de hemoglobina y a las proteínas básicas.
TINCIÓN DE WRIGHT
LINFOCITO NEUTROFILO BASOFILO

22.  La tinción de Giemsa es un método habitual para el examen de frotis
sanguíneos, cortes histológicos y otro tipo de muestras biológicas. Este método
tiene utilidad sobre todo para poner de manifiesto las rickettsias localizadas
dentro de las células huéspedes. El colorante se aplica a un frotis de sangre y
se utiliza cuando se sospeche de protozoos en la sangre para observar
materias núcleos de las células.
Fundamento
 Estos poliorganismos adquieren una coloración diferencial y se ven dentro del
citoplasma de la célula hospedadora. La técnica de Giemsa está formada por
varios colorantes: los tintes neutros utilizados combinan el azul de metileno,
Azure A y Azure B como tintes básicos, y la eosina como tinte ácido, lo que da
una amplia gama de colores. El azul de metileno y el Azure son colorantes
metacromático, de ahí que muchas estructuras se tiñan de púrpura y no de
azul. El pH de la solución de coloración es crítico y se debe ajustar idealmente
según diversos fijadores. La gama del pH debe estar entre 6.4 y 6.9.
TICCIÓN DE GIEMSA

23. Preparación de la muestra
 Para muestras histológicas, los mejores resultados se obtienen en muestras
fijadas con formol, incluidas en parafina y cortadas entre 3 y 6 micras. Los
términos colorante metacromático y su propiedad denominada metacromasia se
refieren a un colorante que al entrar en contacto con la muestra a teñir cambia
su propio color original; los ejemplos clásicos de esta característica son el azul
de metileno y el azul de tolouidina. Su aspecto en el corte histológico da un
púrpura-rojizo. Es usado, además de los extendidos de sangre, en los cortes de
cartílago hialino debido a la gran carga de glucosaminoglucanos ácidos.
Procedimiento
 Se aplica Giemsa en la muestra y encima solución buffer (solución
amortiguadora)
 Por 30 minutos
 Secar
Resultados
 Citoplasma: morado
 Núcleos: azul
 Eritrocitos: rosa - naranja
 Gránulos de las células cebadas: púrpura
 Bacterias: azul
 Parásitos: azul
TICCIÓN DE GIEMSA
Trypanosoma cruzi (parásito causante de la
Enfermedad de Chagas) teñido con Giemsa

24. Existen muchos factores que pueden alterar los resultados en toda técnica de
tinción. A continuación, les nombraremos los más importantes :
 Pureza del colorante: A mayor grado de impurezas, mayor error, y menor
calidad en la tinción.
 Concentración del colorante: Concentración ideal entre 0,2 y 2%.
 pH del colorante: Hace que el pH se fije o no a las estructuras del
microorganismo, permitiendo distinguir unos gérmenes de otros, si es
demasiado rosa puede ser por un pH bajo, si es demasiado azul por un pH alto.
 Conservación del colorante: Se mantendrá siempre en lugares frescos, secos
y oscuros, con su envase correspondiente y su etiqueta.
 Técnica empleada: A la hora de realizar una tinción se tendrá máximo cuidado
en que los portaobjetos y sus cubres están siempre limpios y desengrasados ya
que pueden aparecer artefactos o/y precipitados en la extensión, no se
mezclaran los colorantes, etc.
 Cantidad de la muestra: Representativa y homogénea pero no muy extensa.
 Realizar correctamente el frotis: Si se pretende visualizar una muestra se
fijará previamente, generalmente con calor. Si no se hace este paso los
gérmenes no quedan adheridos al portaobjetos y a la hora de añadir colorantes
mordientes los microorganismos son arrastrados y no se podrán ver.
 Tiempos de tinción: Es importante que todos los colorantes usados se
mantengan en la preparación un tiempo preciso, variable según la tinción,
generalmente entre uno y diez minutos.
ERRORES EN RESULTADOS

25. Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico
oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en el
cuál se está sospechando y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son
herramientas elementales, vigentes y de uso universal que ayudan al diagnóstico
microbiológico.
CONCLUCIONES