Bioq Lab Manual

Manual de prácticas del Laboratorio de Bioquímica farmacéutica.UPIBI-IPN
Rodríguez Pascual P., Pérez Sánchez R., Morales Martínez Martha, Martínez Zúñiga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio
INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGÍA
DEPARTAMENTO DE BIOLOGÍA
ACADEMIA DE BIOQUÍMICA
MANUAL DE BIOQUÍMICA FARMACÉUTICA
El presente manual fue elaborado por:
Biol. Leonor Patricia Rodríguez Pascual
Q.B.P. Refugia Pérez Sánchez
QBP Martha Morales Martínez
M. en C. Rodrigo Martínez Zúñiga
M. en C. Sergio Oliva Maheda
Primera versión
ENERO 2008

PRÓLOGO
El presente manual de laboratorio es para la asignatura de Bioquímica Farmacéutica, tiene como
objetivo familiarizar al estudiante con las substancias, métodos y equipo utilizados en la asignatura
de Bioquímica Farmacéutica; darle experiencia personal en algunas técnicas y ponerlo en
contacto con el método científico y seguir estimulando su interés por esta rama de la ciencia, para
lograr este objetivo es necesario que el estudiante tenga presente:
a.- Qué debe leer sus experimentos antes de ejecutarlos
b.- Qué debe recurrir a sus libros de consulta, normas, instructivos de funcionamiento, etc., para
aclarar dudas y comprender el porque de las operaciones que se han de ejecutar
c.- Qué debe hacer cuidadosamente sus experimentos, procurando entender el porqué de los
hechos
d.- Qué debe observar minuciosa y críticamente cada uno de los cambios ocurridos
e.- Qué debe anotar sus observaciones y buscar la explicación científica.
Cada una de las prácticas contiene la metodología necesaria para el desarrollo experimental de la
práctica, así como los antecedentes teóricos necesarios para la comprensión de cada uno de los
experimentos y poder reforzar los aspectos teóricos del curso.
En el caso de algunos aspectos teóricos complejos, éstos pueden ser aclarados a través de la
lectura suplementaria de la bibliografía recomendada al final del presente manual o bien la
sugerida al inicio del curso.
El manual está integrado por prácticas representativas y secuenciales de las unidades del curso
teórico. Los criterios que se tomaron en cuenta para seleccionar el material incluido en este
manual fueron:
1) Que el experimento ilustrara un principio fundamental teórico.
2) Que fuera lo más simple posible permitiendo al alumno llevarlo a cabo en un tiempo de 3,0 h
3) Que fueran de utilidad para sus cursos posteriores.
Para que un alumno realice el experimento en el laboratorio es necesario tener ciertas
precauciones que se mencionan en el reglamento.
Esta primera edición del Manual no pretende ser definitiva, sino ser objeto de revisiones y mejoras
sistemáticas por parte de los miembros de la Academia de Bioquímica, cada una de las prácticas
fueron probadas por los responsables de su elaboración y diseño antes de ser puestas en
operación.
Este Manual no sustituye a la participación y guía de los profesores en el desarrollo experimental,
ni a la discusión de los resultados obtenidos.

INSTRUCCIONES GENERALES
I.- EVALUACIÓN
I.1.- El laboratorio se evalúa como sigue:
Trabajo* - laboratorio...............3,5 puntos
Discusión................................ 3,0 puntos
Reporte de la práctica........... 3,5 puntos
En el trabajo se evalúa
Antecedentes (lectura de la práctica)…………………..0.5 puntos
Limpieza en todos los aspectos…………………………0.5 puntos
Organización (para trabajar en equipo)………………..1.0 punto
Habilidad…………………………………………………..1.0 punto
Resultados obtenidos y registrados al momento……..0.5 puntos
El reporte se evalúa:
Objetivo y bibliografía................................. 0,5 puntos
Resultados y análisis de resultados............ 1,5 puntos
Discusión y glosario........................ 1,0 puntos
Conclusiones................................... 0,5 puntos
I.2.- Para aprobar el curso de laboratorio se requiere haber asistido al 80% de las sesiones
prácticas, aprobar el 80% de las prácticas efectuadas, entregar el 80% de los reportes y obtener
un promedio mínimo de seis.
I.3.- La calificación del trabajo práctico se obtendrá promediando las sesiones de las que conste la
práctica. Si el alumno no cumple en alguna de las tres etapas, se le calificará con cero en la parte
correspondiente.
I.4.- La calificación final del laboratorio será el promedio de las calificaciones de todas las prácticas
I.5.- Si un alumno no asiste a una sesión tendrá cero en trabajo práctico, si la justifica se mantiene
la calificación, pero no se cuenta la falta para el computo final de asistencias.
I.6.- Cada profesor elegirá un reporte, revisando que todos los alumnos miembros del equipo
hayan elaborado el reporte. Si no es así el alumno que no lo presente tendrá cero en el reporte.
I.7.- Los equipos que no laven el material correspondiente de la práctica y/o dejen sucias las
mesas tendrán cero en la práctica.
II.- ORGANIZACIÓN CON LOS ALUMNOS

II.1.- Para asistir al laboratorio el alumno deberá traer:
• Una bata limpia y con botones, de preferencia debe ser de algodón, manga larga y blanca.
• Instructivo de laboratorio
• Bitácora
• Una fotografía tamaño infantil
II.2.- Por equipo deberá traer:
Un rollo de Masking tape Un marcador indeleble
Un metro de franela Encendedor o cerillos
III.- DEL HORARIO Y COMPORTAMIENTO DE LOS ALUMNOS.
III.1.- Se impartirá una sesión por semana de 3.0 h, cada sesión principiará y terminará a la hora
indicada
III.2.- Se pasará lista cada día al empezar la práctica
III.3.- Se anotarán las faltas y asistencias con todo rigor y por ningún motivo se pondrán
retardos
III.4.- Cuando el alumno abandone el laboratorio antes de terminar la práctica y sin el
consentimiento del profesor, se considerará que no asistió a la práctica.
III.5.- Las faltas al laboratorio se calificarán con cero.
III.6.- La asistencia al laboratorio es obligatoria, ya que uno de los objetivos del trabajo práctico es
que el alumno adquiera habilidades y destrezas mediante estas experiencias. La lista de
asistencia se efectuará a la hora indicada para la práctica, con una tolerancia de 10 minutos. No
habrá retardos y se pondrá falta a quien no llegue a la hora establecida con la bata debidamente
abrochada. En caso de llegar tarde ya no se le permitirá la entrada a menos que sea discusión con
su correspondiente falta.
III.7.- El reporte se entregará una semana después de realizada la discusión
III.8.- El alumno utilizará el manual de laboratorio, obligatoriamente en cada sesión, apegándose a
la metodología a seguir, así como a las instrucciones del profesor.
III.9.- Utilizará como bitácora el manual de laboratorio en cada sesión para anotar todos los datos
obtenidos en el momento de la práctica.

III.10.- Se debe guardar el comportamiento adecuado para evitar accidentes, ya que el laboratorio
es un lugar de trabajo.
III.11.- Por razones de seguridad, queda estrictamente prohibido fumar, comer, ingerir
bebidas y mascar chicle dentro del laboratorio además deberá lavarse las manos al final de
cada práctica: Recordar que se maneja un tejido(sangre) así como diversas sustancias.
Todo material biológico residual deberá tratarse con el desinfectante que indique le
profesor (benzal o cloro) a fin de evitar riesgos a la salud.
III.12.- Durante el desarrollo de la práctica, queda prohibida la entrada a personas ajenas al grupo
que visiten a los alumnos.
III.13.- El material y equipo roto, deteriorado o extraviado, deberá ser repuesto por la persona o
personas responsables de él.
III.14.- El alumno revisará el material que reciba y reportará cualquier anomalía antes de iniciar el
trabajo práctico para evitar que se le responsabilice del material deteriorado que se le entregue.
III.15.- Después de terminada la práctica, el material deberá ser entregado limpio, a la persona
encargada del almacén del laboratorio y deberá limpiar la mesa al iniciar y terminar la práctica.
III.16.- El alumno evitará su permanencia en el laboratorio después de terminada la práctica.
III.17.- Todo material contaminado con sangre se depositará en el lugar asignado para su
esterilización.
III.18.- Esta prohibido el uso de celular durante la práctica, por lo que se le pide al alumno que lo
apague durante el desarrollo, y discusión de la misma.
NOMBRE DEL ALUMNO:__________________________________________
PROFESOR DE TEORÍA: __________________________________________
PROFESORES DE LABORATORIO: _________________________________
__________________________
__________________________
GRUPO: _______________________________________________________
CICLO ESCOLAR ________________________________________________

ÍNDICE
PRÓLOGO_________________________________________________________
ÍNDICE____________________________________________________________
Instrucciones generales ______________________________________________
PRÁCTICA No. 1 Naturaleza química de las enzimas y actividad biológica
PRÁCTICA No. 2 Transporte de electrones y su inhibición
PRÁCTICA No. 3 Determinación de glucosa y lactato en suspensión de eritrocitos
PRÁCTICA No. 4 Formación de liposomas. Determinación de lipoproteínas y triglicéridos en suero
humano.
PRÁCTICA No. 5 Determinación de transaminasas, urea y ácido úrico en suero humano.
PRÁCTICA No. 6 Determinación de colesterol en suero humano.
PRÁCTICA No. 7 Transferencia de material genético.
PRÁCTICA No. 8 Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (GCH)

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Práctica No 2
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA Y LACTATO EN SUSPENSIÓN DE ERITROCITOS.
Relación con Unidad Temática
II. Catabolismo de carbohidratos
I. OBJETIVOS
El alumno determinará el consumo de glucosa por parte de células sanguíneas.
El alumno evaluará la producción de un metabolito de desecho propio del metabolismo anaerobio
de la glucosa.
II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS.
La glucosa es la principal fuente de energía para los seres vivos. En el ser humano, su
concentración debe mantenerse entre 60 y 100 mg/dl, valores por abajo (hipoglucemia) y por
arriba (hiperglicemia) de estos provocan trastornos fisiológicos. La glucosa para ser aprovechada
por el organismo debe ser introducida al citoplasma celular donde se encuentran las enzimas
responsables de su degradación, el proceso se llama glicólisis, en el, ocurre una degradación
incompleta de la glucosa, por lo que se requieren de otros sistemas enzimáticos así como de
otros espacios celulares para su degradación total hasta CO2 y H2O. Durante el proceso de
degradación de la glucosa se genera energía en forma de ATP, la producción de ATP ocurre en
las diversas fases del proceso, por lo que si ocurre una degradación incompleta, la cantidad de
energía generada también será incompleta y desde luego se generarán productos intermediarios
de esa incompleta degradación.
La degradación total de la glucosa hasta CO2 y H2O, requiere de la presencia de oxígeno en las
reacciones posteriores a la glicólisis y desde luego los sistemas enzimáticos correspondientes,
mismos que están presentes en la mayoría de las células del organismo, sin embargo en algunas
células como las musculares, pueden reorientar su metabolismo cuando la cantidad de oxígeno
disponible no es suficiente, por lo que llevarán una degradación incompleta, otras “células” como
los eritrocitos circulantes, carecen de los sistemas enzimáticos para la fase oxidativa de la
degradación de la glucosa y también llevan una degradación a medias, en ambos casos el
producto de este metabolismo incompleto es el ácido láctico, o lactato porque realmente se
encuentra ionizado, por lo que su producción contribuye a la disminución del pH de la sangre, las
reacciones que llevan a la producción de ácido láctico se conocen como fermentación láctica.
En los organismos superiores, el lactato no es liberado del cuerpo como desecho dado que aún
tiene mucha energía utilizable, por lo que, el lactato producido en músculo o eritrocitos es
liberado a la sangre y será capturado en el hígado y reconvertido en glucosa, por un proceso
llamado gluconeogénesis para su posterior reutilización. En otros organismos, propiamente
bacterias, el lactato es liberado a su medio ambiente y comúnmente es aprovechado por otros
microorganismos para extraerle la energía que aún contiene, lo que es utilizado para la
generación de diversos productos de interés económico.
En esta práctica se determinará el consumo de glucosa por parte de las células sanguíneas a partir
de sangre fresca extraída para tal fin, y se harán también las determinaciones de lactato para
determinar la producción del mismo.

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III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
1. Espectrofotómetro
2. Kit para determinación de glucosa, por el método de glucosa oxidasa.
3. Kit para determinación de lactato por método colorimétrico
4. Dos celdas de vidrio para el espectrofotómetro.
5. 9 tubos de ensaye de 6x100
6. 2 pipetas de vidrio de 5ml.
7. 2 pipetas automáticas, una de 10 a 100 mcl y una de 100 a 100mcl.
8. Puntas estériles para pipeta automática de 100 y 1000mcl.
9. Un agitador orbital
10. Cuarto estufa a 37°C
11. Frasco de cultivo de 50ml.
12. Heparina en solución (ProparinMR
de Probiomed) de 1000 UI/ml
13. 4 tubos Eppendorf de 1.5ml
14. Microcentrífuga
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL
1. Extraer de un integrante del equipo 10 ml de sangre y depositarlo en condiciones de esterilidad,
en un recipiente (tubo de ensayo, frasco de cultivo de 50ml o placa de cultivo 5cm de diámetro)
estéril conteniendo 500µl de heparina.
2. Homogenizar la sangre con la heparina.
3. Tomar una muestra inicial de 0.5ml y depositarlo en un tubo Eppendorf, el frasco de cultivo
colocarlo en agitación a 50 rpm en el cuarto de incubación.
4. Centrifugar la muestra de sangre 30seg a velocidad máxima en microcentrífuga.
5. Separar el plasma en otro tubo limpio.
6. Preparar dos series de 3 tubos como se señala en los cuadros, uno para determinar glucosa y el
otro para determinar lactato.
7. Determinación de glucosa
Blanco Patrón Muestra
Reactivo p/ Glucosa(ml) 1.0 1.0 1.0
Patrón (µl) 100mg/dl - 10 -
Muestra (µl) - - 10
8. Mezclar e incubar 10 minutos a 37°C o 30 minutos a temperatura ambiente.
9. Leer la absorbancia (As) del patrón y la muestra frente al blanco de reactivos a 505nm.
Para calcular la concentración de glucosa aplicar la siguiente formula.
As muestra
As Patrón
X 100 = mg/dl de glucosa en la muestra
Factor de conversión: mg/dlglc X 0.0555 = mmol/lglc

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10. Determinación de lactato
Reactivo p/ Lactato (ml) 1.0 1.0 1.0
Patrón (µl) 100mg/dl - 10 -
Muestra (µl) - - 10
11. Mezclar e incubar 5 minutos a 37°C o 10 minutos a temperatura ambiente.
12. Leer la absorbancia (As) del patrón y la muestra frente al blanco de reactivos a 505nm.
Para calcular la concentración de lactato aplicar la siguiente formula.
V. RESULTADOS
Anote sus resultados de As en los cuadros siguientes.
Calcule las concentraciones de lactato y glucosa de acuerdo a las formulas dadas y anote los
resultados en la siguiente tabla.
Construya las gráficas de decaimiento de glucosa y de producción de ácido láctico en el mismo
eje cartesiano. No olvides anotar el pie de figura.
VI. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Tiempo As Glucosa As Lactato
0
X1
X2
X3
Tiempo
[Glucosa]
mmol/l
[Lactato]
mmol/l
0
X1
X2
X3
As muestra
As Patrón
X 10 = mg/dl de lactato en la muestra
As Patrón de glucosa
As Patrón de lactato
Factor de conversión: mg/dllac X 0.111 = mmol/llac

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Describe la glicólisis y explica porque es una vía de degradación incompleta apóyate haciendo un
esquema de la ruta.
Explica como se enlaza la glicólisis con la fermentación láctica, anota las reacciones. Indica
porque se dice que la glicólisis es una ruta anaerobia.
Di con tus palabras que información nos da la gráfica.
Incluye la respuesta a estas preguntas en tu discusión ¿Fue consumida realmente la glucosa?,
¿Qué relación estequiométrica se establece entre la glucosa consumida y el lactato generado?
¿Por qué los eritrocitos no llevan la degradación de glucosa hasta CO2 y H2O? ¿que les falta?, en
cuanto a la cantidad de energía generada ¿que consecuencias trae esto? ¿Cual es la función de los
eritrocitos? ¿Por qué los eritrocitos no requieren tanto ATP como las demás células del
organismo?
Describe que le ocurre a lactato que es liberado por los eritrocitos y anota las transformaciones
que le ocurren.
VII. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados obtenidos a su análisis y discusión anota las conclusiones que de esto
se desprende.
VIII. BIBLIOGRAFÍA
Bernard H, John. Todd-Sanford-Davidsohn: Diagnostico y Tratamiento Clínicos por el
Laboratorio. 8ª ed. Tomo I Barcelona (Esp): Salvat, 1988. 927p. ISBN: 84-345-2587-9
Devlin. T. M., Bioquímica con aplicaciones clínicas tomo I y II 3ª. Ed- Reverté S.A., España.
1997. 1298 págs.
Murray, R. K., Granner, D. K., Mayes, P. A. Rodwell, V. W. Bioquímica de Harper 15° edición.
El Manual Moderno. México. 2001. 1041 págs.

Rodríguez Pascual P., Pérez Sánchez R., Morales Martínez Martha, Martínez Zúñiga Rodrigo, Oliva Maheda Sergio 31
PRACTICA No. 3
Transporte de Electrones y su Inhibición
Unidad Temática: Catabolismo de Carbohidratos.
I. OBJETIVOS.
El alumno aislará mitocondrias a partir de riñones de rata.
El alumno determinará la hidrólisis de ATP en mitocondrias de riñones de rata.
El alumno utilizará inhibidores y aceptores artificiales de electrones que afectan el transporte de
electrones en mitocondrias.
El alumno evaluará el transporte de electrones en mitocondrias y determinará su importancia desde
el punto de vista farmacéutico.
II. FUNDAMENTOS.
El termino respiración es usado para hacer referencia al proceso en el cual la energía es generada a
través de moléculas nutrimentales, con O2 como el máximo aceptor de electrones, éste término es
también llamado respiración celular para distinguirlo del término respiración regular.
Existen tres estados de la oxidación metabólica de compuestos orgánicos:
1. Generación de un fragmento activado de dos carbonos (el grupo acetilo de la acetil-CoA) del
piruvato (citoplasma), ácidos grasos (mitocondria), o aminoácidos (citoplasma/mitocondrias).
2. Oxidación de los carbonos del fragmento de acetilo mediante el ciclo del ácido cítrico
(mitocondrias).
3. Transferencia de electrones desde la oxidación en el paso 2 a través del sistema de transporte de
electrones para producir ATP de la fosforilación oxidativa.
Transporte de electrones.
El transporte de electrones es un sistema en el que los electrones generados por la oxidación son
transferidos. La transferencia de los electrones mediante este sistema genera energía potencial que
es usada para sintetizar ATP en la fosforilación oxidativa.
El valor de E0´ para los acarreadores de electrones en la membrana de la mitocondria se incrementa
en el mismo orden en el que son usados en el transporte electrónico. Dichas reacciones ocurren en el
siguiente orden:
NADH y NADH Deshidrogenasa (Complejo I) – La molécula de NADH se genera mediante
numerosas deshidrogenasas en la célula. Éste se reoxida a NAD+ por el Complejo I de la
mitrocondria (también llamado NADH deshidrogenasa).
Complejo II (Succinato deshidrogenasa) – El complejo II no es la forma en la que los electrones
viajan desde el Complejo I. Este es un punto de entrada de los electrones desde FADH2 producido
por la enzima succinato deshidrogenasa en el ciclo del ácido cítrico. Estos complejos I y II donan sus
electrones al mismo aceptor coenzima Q.
Coenzima Q (CoQ) - CoQ es una benzoquinona ligada a un número de unidades de isopreno. El
tallo de isopreno da a la molécula un character apolar que permite a la CoQ dispersarse rápidamente
a través de la membrana mitocondrial interna. La CoQ tiene la capacidad de aceptar electrones en
pares y pasarlos uno a la vez mediante un intermediario semiquinona hacia el complejo III.
Complejo III – El Complejo III contiene diversas roteinas acarreadoras de electrones. Entre ellas se
encuentran citocromo b, complejos hierro y azufre y citocromo c1. El citocromo b es la primer de las
proteínas acarreadoras que contienen un grupo hemo que esta envuelta en el transporte de
electrones.

Citocromo c - Esta pequeña proteína es la única del sistema de transporte de electrones que no es
un complejo. Esta acepta los electrones del complejo III y los envía al complejo IV.
Complejo IV – El Complejo IV es también conocido como citocromo oxidasa, porque toma los
electrones del citocromo c. El complejo IV contiene citocromos a y a3. Los citocromos a y a3
evidentemente representan dos grupos hemo A Asociados a la misma cadena polipeptídica. Ellos se
encuentran en diferentes ambientes en el interior de la membrana aunque tienen diferentes
potenciales de membrana idénticos, sus potenciales de reducción son diferentes. Cada uno de los
hemos esta asociado a un ión cobre, localizado cerca al hierro hemo. Los electrones que pasan por
el complejo IV pueden ser bloquedos por el cianuro, azida de sodio y monóxido de carbono y el
acarreador artificial de electrones, ferrocianuro, puede aceptar electrones del citocromo a en el
complejo.
Un inhibidor del transporte de electrones crea un punto de cruce o lugar específico de inhibición.
Cuando una ruta es bloqueada totalmente, los acarreadores de electrones se encontrarán en un
estado reducido antes del punto de inhibición y oxidado después de este. Esto puede monitorearse
fácilmente diferencias de espectro y es de hecho, una de las formas en las cuales la acción de los
acarreadores de electrones en la cadena respiratoria fue establecida.
Los aceptores artificiales de electrones tienen un efecto opuesto a los inhibidores. Esto es,
reestablecen el flujo de electrones en un punto específico al presentarse un inhibidor. Por ejemplo si
las mitocondrias fueran tratadas con antimicina A (un inhibidor) y azul de metileno (un aceptor
artificial de electrones), el Complejo I sería oxidado respecto a CoQ debido a la liberación de
electrones del complejo I al azul de metileno. El CoQ permanecería reducido, así mismo la
transferencia de electrones hacia el siguiente acarreador, Complejo III, estaría bloqueada.
III. EQUIPOS Y REACTIVOS.
Parte I.
Materiales, Equipo y Reactivos.
Material:
1 Tijeras de disección.
1 Mortero con pistilo.
1 Tubo de centrifuga con camisa.
11 Tubos de ensayo de 16 X 150 mm.
5 Pipetas de 1 mL.
3 Pipetas de 5 mL.
1 Pipeta de Kahn.
1 Propipeta.
1 Vaso de precipitados de 100 mL.
2 Gradillas.
1 Celda espetrofotométrica.
1 Baño de hielo.
1 Incubadora a 30oC por sección.
1 Incubadora a 4oC por sección.
1 Centrifuga por sección.
1 Espectrofotómetro por sección.
2 Termómetro de 0o a 100oC.
Material Biológico.
1 Rata por equipo.
Reactivo.

10.0 mL de regulador de sacarosa 250 mM, EDTA 1 mM, Tris 10mM pH 7.3 frio.
0.5 mL albúmina 10 mg/mL
1.0 mL de glicerol.
1.0 mL de KCl 1M.
3.5 mL de regulador Tris 0.1M pH 7.3
0.5 mL de MgCl2 0.1 M
0.5 mL de ATP 60 µg/mL.
0.1 mL de azida de sodio 0.1 M
3.5 mL de preparado mitocondrial.
0.1 mL de Polixin ofteno.
0.1 mL de 2,4 Dinitrofenol 0.3 mg/ml.
Parte II
Material.
7 Tubos de ensaye de 16 X 150 mm
1 Gradilla
1 Celda espectrofotométrica.
1 Bureta de 20 mL
1 Soporte universal
1 Pinzas para bureta.
1 Vaso de precipitados de 100 mL.
7 Pipetas de 1 mL.
2 Pipetas de 2 mL.
1 Incubadora de 37oC por sección.
1 Espectrofotometro por sección.
1 Termómetro.
Reactivos.
16.2 mLde regulador de fosfatos 0.3 M, pH 7.4
0.7 mL de DPIP (diclorofenol indofenol)
5.5 mL de succinato de sodio 0.5 M
0.5 mL de malonato de sodio 0.5 M
0.5 mL de KCN 0.1 M
0.2 mL de citocromo c 0.6mM
1.0 mL de preparación mitocondrial.
IV. DESARROLLO EXPERIMENTAL.
PARTE I. FOSFORILACIÓN.
A. PREPARACIÓN DE LA FRACCIÓN CON MITOCONDRIAS.
4.1 Obtener los riñones de una rata y separar la corteza de ambos.
4.2 Macerar las 3 cortezas en un mortero, utilizando 10 mL. de regulador de sacarosa 250 mM, EDTA 1
mM, pH 7.3 fría. Mantener todo en hielo.
4.3 Centrifugar durante 10 min. Cuidar de equilibrar bien los tubos.
4.4 Obtener el sobrenadante y pasarlo a un tubo de ensaye. Mantenerlo a temperatura ambiente.
4.5 Esta preparación se empleará en el siguiente experimento y después de utilizar 0.5 mL de albúmina
10 mg/mL, 1 mL de glicerol y conservar en congelación (-4oC).

B. ACTIVIDAD DE ATPasa.
4.6 Preparar una serie de tubos como se indica en la siguiente tabla.
Tubo 1
(Testig
o)
2
(Completo)
3
(Azida
de
Sodio)
4
(Mg+2
)
5*
(-20o
C)
6
2,4
DNF
7
Gramicidi
na
KCl 1M 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2
Regulador de
Tris 0.1 M pH 7.3
(mL)
1.1 0.6 0.5 0.7 0.6 0.5 0.5
Mg Cl2 0.1 M
(mL)
0.1 0.1 0.1 _____ 0.1 0.1 0.1
ATP 60 mg/mL
(mL)
0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Azida de sodio
(mL)
______ ________ 0.1 _____ _____ _____ ______
2, 4 DNF (mL)
______
_
________ _____ ____ _____ 0.1 _______
Gramicidina
(mL)
______ _______ _____ _____ _____ ____ 0.1
Preparación de
mitocondrias
(mL)
Ver
punto
4.9
0.5 0.5 0.5
0.5* Ver
nota
0.5 0.5
*Nota: Para este tubo primero se incuban las mitocondrias a -20o
C en hielo seco, durante 15 min y
después se adicionan la tubo.
4.7 Incubar a 30o
C durante 15 min.
4.8 Después de transcurrido el tiempo de incubación, adicionar a todos los tubos 1.0 mL de TCA al 30
%.
4.9 Al tubo 1, adicionar 0.5 mL de la preparación de mitocondrias (después del TCA).
4.10 Centrifugar a 3500 rpm durante 10 minutos.
4.11 Tomar 0.6 mL de los sobrenadantes y tratarlos como al tubo 4 de la curva tipo pero en lugar de
solución tipo de fósforo se adiciona ésta muestra problema y luego el resto de los reactivos como
marca la tabla.
Atención: Se debe tener cuidado de No adicionar la solución tipo de fósforo, pues en su lugar
estamos adicionando los sobrenadantes.
4.12 Determinar la densidad óptica a 660 nm de cada tubo.
C. CURVA TIPO DE FOSFORO.
Tubo 1 2 3 4 5 6 7
Slución tipo de fósforo 1mM
(mL)
0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 ____
H2SO4 7.5 N (mL) 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Molibdato de amonio 6.6
% (mL)
0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Agua destilada (mL) 3.5 3.4 3.2 3.0 2.8 2.6 3.6
Agitar
FeSO4 al 10% (ml) 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4
4.14. Agitar y leer en el espectrofotómetro a 660 nm. Utilice como blanco el tubo 7.
PARTE II. TRANSPORTE Y ACEPTORES ARTIFICIALES DE ELECTRONES.
A. ACTIVIDAD DE SUCCINICO DESHIDROGENASA Y DE CITOCROMOS.
4.15 Preparar una serie de 5 tubos y adicione los reactivos que se muestran en la siguiente tabla y en
orden estricto.
¡CUIDADO!
El KCN ES VENENOSO, UTILICE BURETA PARA ADICIONARLO A LOS TUBOS.
Sustancia
1
Testigo
(Sin
sustrato)
2
Completo
3
+Malonato
4
+Malonato
5
+CN-
6
+CIT
Regulador de
fosfatos 0.3M pH 7.3
(mL)
3.3 2.3 2.1 2.6 1.8 2.1
DPIP 1µM (mL) 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1
Malonato 0.5 M (mL) ____ ____ 0.2 0.2 ____ ___
KCN 0.1 M (mL) ____ ____ ____ ____ 0.5 ___
Cit C 0.6 mM (mL) ____ ____ ____ ____ ___ 0.2
Succinato 0.5 M (mL) ____ 1 1 0.5 1 1
Incubar los tubos a 37o
C durante 5 minutos
4.16 Tomar el tubo 1 (Testigo) y adicionarle 0.1 mL de la fracción de mitocondrias e inmediatamente
determine la densidad óptica a 660 nm.
4.17 Leer nuevamente la densidad óptica en el mismo espectrofotómetro a los 3 minutos.
4.18 Repetir este procedimiento con cada uno de los otros tubos adicionando en todos los casos 0.1
mL de la fracción de mitocondrias.

V. RESULTADOS, ANÁLISIS DE RESULTADOS.
5.1 Escriba los datos generados de la curva tipo de fósforo en la tabla 5.1
Tubo Concentración de fósforo (µmoles) As 600 nm
1
2
3
4
5
6
7
5.2 Construya la curva tipo de fósforo en papel milimétrico, colocando en las ordenadas la densidad
óptica a 660 nm y en las abscisas la concentración de fósforo en µmoles.
5.3 Determine la pendiente de la recta y utilícela como coeficiente para el cálculo de la concentración de
fósforo en el experimento de ATPasa. ¿Diga que parámetro permite determinar si la curva tipo es válida?
5.4 Escribir los resultados del experimento de ATPasa en la tabla siguiente.
Tubo Condición As 660 nm
Concentración de
Fósforo (µmoles)
1
2
3
4
5
6
7
5.5. Explique lo ocurrió en el tubo 2.
5.6 ¿Cuál es el efecto de eliminar el Mg+2
del tubo de reacción?
5.7 ¿Qué ocurre en el tubo con mitocondrias preenfriadas a –20o
C?
5.8 ¿Qué ocurre en el tubo con azida de sodio?
5.9 ¿Qué ocurre en el tubo con gramicidina?
5.10 ¿Qué ocurre en el tubo con 2,4 DNF?
5.11 ¿Cómo afecta la gramicidina el transporte de electrones?

5.12 ¿Cómo afecta el 2,4 DNF el transporte de electrones? ¿A qué nivel de la cadena respiratoria actúa?
¿Cuál es su uso terapéutico?
5.13 ¿Cuál es el objetivo de adicionar el TCA?
5.14 Escriba los resultados obtenidos en el experimento 4.3 en la siguiente tabla.
Tubo Condición As 660 nm
1
2
3
4
5
6
5.15 ¿ Por qué el tubo 1 disminuye el color, a pesar de que no se adicionó el succinato?
5.16 ¿Qué tipo de sustancia es el malonato y a que nivel actúa en cadena respiratoria? Explique ya que
nivel actúa en cadena respiratoria? Explique como demostró este resultado.
5.17 ¿A qué nivel actúa el CN-
como inhibidor de la cadena respiratoria? Explicar como demostró lo
anterior.
5.18 Escriba la reacción de reducción del DPIP, con fórmulas.
5.19 Explique que tipo de sustancia es la gramicidina, y cuál es su uso terapéutico.
VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Analice y discuta en base a los resultados obtenidos y a la bibliografía consultada.
VII. GLOSARIO DE TÉRMINOS TÉCNICOS.
7.1 POTENCIAL REDOX.
7.2 REDUCCIÓN.
7.3 OXIDACIÓN.
7.4 TRANSPORTE DE ELECTRONES.
7.5 FOSFORILACIÓN OXIDATIVA.
7.6 INHIBIDOR DEL TRANSPORTE DE ELECTRONES.
7.6 DESACOPLANTE.

VIII. CONCLUSIONES.
Con los resultados obtenidos, el análisis, la discusión, los objetivos de la práctica y a la bibliografía
consultada dar las conclusiones de este reporte.
IX. BIBLIOGRAFÍA
Registre la bibliografía consultada para la elaboración de éste reporte.
X. BIBLIOGRAFÍA RECOMENDADA
10.1 Lenhinger, A., “Principios de Bioquímica”, 3ª. Ed. Omega. España 2001.
10.2 Mathews, V. H. , “Bioquímica”, 3ª. Ed. Prentice-hall. España 3003.
10.3 Bohinski, R. C., “Bioquímica” 2ª. Ed. Pearson education. México 2000.
10.4 Murray, R. K., “Bioquímica Ilustrada Harper”, 17ª. Ed. El manual moderno. México. 2007.
10.5 Clark, J.M., J.M. “ Experimental Biochemestry”, W. H. Freeman, San Francisco, 1964.

PRÁCTICA 4
FORMACIÓN DE LIPOSOMAS. DETERMINACIÓN DE LIPOPROTEÍNAS Y TRIGLICÉRIDOS EN SUERO
HUMANO.
UNIDAD III. Catabolismo de lípidos
Tema: 3.1. Movilización y transporte de lípidos (TG y Colesterol)
Tema: 3.1.1 Estructura y función de partículas VLDL, LDL, IDL y HDL
1.- OBJETIVOS
Objetivo general.
El alumno formará experimentalmente liposomas y determinará lipoproteínas y triglicéridos en suero humano.
Objetivos particulares.
El alumno formará liposomas a partir de fosfolípidos.
El alumno comprobará la capacidad de los liposomas de encapsular sustancias.
El alumno determinará triglicéridos y la lipoproteína HDL- colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIÓN
Los lípidos son compuestos orgánicos, muy heterogéneos insolubles en agua, pero solubles en solventes
orgánicos. Los lípidos tienen diferentes funciones en el organismo, entre las cuales están las siguientes:
1.- Estructural. Forman las membranas celulares (fosfolípidos y esfingolípidos).
2.- Reserva energética. Triglicéridos (TG o TAG).
3.- Transporte. Lipoproteínas.
4.- Compuestos funcionales. Vitaminas (vitamina D), sales biliares y hormonas como: progesterona, testosterona,
estrógenos y corticoides.
5.- Aislante térmico y protector. Tejido adiposo
Los lípidos de la dieta y aquellos que se sintetizan en las células son necesarios para los organismos superiores,
donde se utilizan para construir membranas, moléculas combustibles o para biosíntesis. Los lípidos más
importantes para el transporte son los triglicéridos y el colesterol (colesterol libre y ésteres del colesterol). Los
lípidos se transportan en la sangre como complejos lipoproteícos, los cuales se componen de proteínas específicas
y de combinaciones de triglicéridos, colesterol y ésteres de colesterol, denominadas lipoproteínas o
apolipoproteínas. Los lípidos y las proteínas están asociados como complejos hidrosolubles no covalentes.
Las principales lipoproteínas se clasifican en:
Quilomicrones: son las lipoproteínas menos densas y se componen de 98 a 99% de lípidos, principalmente de
TAG. Se pueden considerar como gotas de grasa cubiertas con una capa de proteínas y lípidos polares. Estos se
ensamblan en el intestino con los lípidos de la dieta y se absorben al torrente sanguíneo para ser transportados a
los tejidos periféricos. Ahí, una lipoproteína lipasa libera los ácidos grasos de los TAG.
Lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL): Son agregados moleculares que se forman en el hígado con los
TAG que ahí se sintetizan, su función es llevarlos hacia el tejido adiposo y otros tejidos periféricos para ser
almacenados o para utilizarse como fuente de energía. Los ácidos grasos se liberan por acción de la lipasa.
Lipoproteínas de baja densidad (LDL): Estas partículas son las principales transportadoras de colesterol en la
sangre, movilizan a los ésteres de colesterol del hígado donde se sintetizan, hacia los tejidos periféricos. Los
lípidos predominantes son los ésteres de colesterol que contiene un ácido graso poli insaturado (ácido linoleico).
Lipoproteínas de alta densidad (HDL): Éstas son las que tienen mayor contenido de proteínas de todas las
lipoproteínas (55% de proteína, 45% de lípidos) por lo que son más densas. Los principales lípidos que
transportan son el colesterol y ésteres de colesterol, y a diferencia de las LDL, movilizan al colesterol en dirección
contraria, es decir, desde el tejido periférico hacia el hígado. Durante su recorrido por el torrente sanguíneo

atrapan el exceso de colesterol y lo llevan al hígado. A las HDL, se les conoce como el colesterol “bueno” porque
disminuyen los niveles plasmáticos de éste.
En la siguiente tabla se resumen las propiedades físicas y composición de las principales lipoproteínas:
Composición (% peso)
Lipoproteína Densidad
(g/ml)
Diámetro
(Å)
Proteínas Colesterol Fosfolípidos Triglicéridos
TAG
Quilomicrones <0.95 800-5000 2 4 9 85
VLDL 0.95-1.0 300-800 10 20 20 50
LDL 1.0-1.063 180-280 25 45 20 10
HDL 1.063-1.2 50-120 55 17 24 4
Los individuos con altos niveles séricos de colesterol de LDL con respecto a las HDL tienen una mayor
incidencia a sufrir ataques cardiacos. Los niveles altos de HDL se relacionan en forma inversa, es decir a mayor
concentración de HDL es menor el riesgo de sufrir enfermedades cardiacas.
En general se promueve en la población reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen
factores que no podemos modificar como el genético, el de género: las mujeres tienden a acumular menos
colesterol y sus niveles de HDL son más altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades cardiovasculares
que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hábito de fumar, el consumo de alcohol, una
dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrés, que en su conjunto aumentan los niveles de
colesterol y TAG.
Triglicéridos: son un grupo de lípidos formados por tres ácidos grasos y un glicerol. Son las principales
moléculas energéticas e ideales como reserva de energía a largo plazo, porque proporcionan más del doble de
energía por unidad de masa que los carbohidratos. Los triglicéridos, como son no polares, se almacenan en forma
anhidra en el tejido adiposo. Para utilizar la energía de los ácidos grasos, primero deben ser liberados de los TAG,
y después ser transportados de los tejidos periféricos a las mitocondrias para su degradación metabólica. El
catabolismo se realiza por β-oxidación, un proceso de cuatro etapas que genera acetil CoA, que entra
posteriormente al ciclo de Krebs. Si la cantidad de moléculas disponibles como combustible rebasa las
necesidades fisiológicas, se inicia la síntesis de ácidos grasos, lo cuales se asocian con glicerol y se almacenan en
el tejido adiposo.
Los niveles de triglicéridos se elevan por una ingesta alta en grasas saturadas o carbohidratos, también por exceso
de peso, consumo de alcohol, la edad (aumentan con la edad), algunos medicamentos como los anticonceptivos,
esteroides, diuréticos causan aumento en los niveles de TAG, enfermedades como la diabetes, hipotiroidismo,
enfermedades renales y hepáticas se asocian también con niveles altos, además del factor hereditario (trastornos
genéticos).
Un nivel elevado de triglicéridos se asocia como factor de riesgo de enfermedad cardiaca junto con el colesterol,
además de ser riesgoso al asociarse con diabetes y pancreatitis.
Membranas celulares. La diversidad de lípidos de membrana es extensa, sin embargo tienen en común una
característica muy importante, los lípidos de membrana son moléculas anfipáticas. Contienen una parte
hidrofífica y otra hidrofóbica. La formación de membranas es una consecuencia de la naturaleza, sus cabezas
polares facilitan el contacto con el agua, mientras que sus colas hidrocarbonadas interaccionan entre si, en lugar
de hacerlo con el agua. Una forma de ordenarse en medio acuoso es formando micelas, estructuras globulares en
la que los grupos de la
cabeza polar están rodeados de agua y las colas hidrocarbonadas están secuestradas en el interior e interaccionan
una con otra, otro orden es la bicapa lipídica o liposomas, compuesta por dos capas de lípidos, las colas
hidrocarbonadas de cada capa individual interaccionan entre ellas, formando un interior hidrofóbico que actúa
como barrera de permeabilidad. Los grupos polares interaccionan con el medio acuoso. La estructura más

favorable para la mayoría de los fosfolípidos y glicolípidos en medios acuosos es la bicapa lipídica en vez de la
micela.
Fosfolípido Micela Bicapa lipídica
Liposoma
La formación de bicapas lipídicas a partir de fosfolípidos es un proceso rápido y espontáneo de auto ensamblaje,
siendo las interacciones hidrofóbicas las principales fuerzas que determinan su formación, además de las fuerzas
de Van der Waals que favorecen el empaquetamiento compacto de las colas hidrocarbonadas.
La tendencia de los fosfolípidos a formar membranas, se ha utilizado para crear una importante herramienta
experimental y clínica, los liposomas, que son compartimentos acuosos rodeados por una bicapa lipídica, con un
arreglo similar al de las membranas celulares, pueden emplearse para el estudio de la permeabilidad de la
membrana o para liberar fármacos en las células.
Los liposomas pueden prepararse suspendiendo un lípido como la fosfatidilcolina, en un medio acuoso.
Posteriormente, la mezcla se agita por medio de ondas sónicas de alta frecuencia, con lo que se consigue una
dispersión de vesículas cerradas de tamaño bastante uniforme, las vesículas formadas según el procedimiento
indicado tiene una forma esférica, con un diámetro de unos 50 nm
(500 Å). Se pueden formar vesículas mayores de 1 µm de diámetro, mediante la evaporación lenta del disolvente
orgánico de una suspensión de fosfolípidos en una mezcla de disolventes. Los liposomas pueden estar formados
por una bicapa lipídica, liposoma unilamelar (LUV) o varias capas concéntricas, liposomas multilamelar( MLV)
cuyas capas están separadas por espacios acuosos. La estructura vesicular de los liposomas y su capacidad de
incorporar sustancias hidrofílicas o hidrofóbicas, permite aplicarlos en diversos campos de la ciencia y tecnología.

Se están realizando experimentos para desarrollar el uso de los liposomas, por ejemplo se pueden inyectar en
pacientes liposomas que contengan DNA para tratamiento por terapia génica, o fármacos, ya que ha demostrado
su potencial como sistema de liberación de ellos y capacidad para que lleguen a un órgano blanco específico.
Estos liposomas se fusionan con la membrana plasmática y pueden introducir sustancias en células impermeables
a ellas, el estudio de transporte a través de membrana, por ejemplo, la permeabilidad a los iones.
Otros sistemas coloidales como los niosomas, transfersomas y nanoesferas, también se han utilizado, pero los
liposomas son las formas que presentan mayor posibilidad para contener, transportar y ceder principios activos.
Además de la capacidad de transportar y ceder principios activos, no son tóxicos, no son inmunogénicos, no son
irritantes, son biodegradables y pueden incorporar una gran variedad de fármacos de naturaleza hidrofílica o
hidrofóbica.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO
3.1 Triglicéridos y HDL-colesterol
EQUIPO y MATERIAL
Baño a 25 o 30o
C
1 gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
Espectrofotómetro para luz UV
2 celdas espectrofotométricas
1 porta celdas
1 centrífuga
REACTIVOS
Kit para Triglicéridos
Kit para HDL-colesterol (lipoproteína de alta densidad)
3.2 Liposomas
EQUIPO Y MATERIAL
3 tubos de ensaye de 16 x 150
3 pipetas de 2 mL
2 pipetas de 5 mL
1 gradilla metálica
3 portaobjetos
3 cubreobjetos
1 vortex
1 microscopio
Baño de agua a 37o
C
Baño de incubación a 45o
C
2 termómetros de 0 a 100o
C
REACTIVOS
2,0 mL de dipalmitoil-fosfatidilcolina (DPPC o lecitina de soya) al 10 % en cloroformo
4,0 mL de almidón al 1%
3,0 mL de amilasa 10 mg/ mL
2,0 mL de lugol

2,0 mL de dodecil sulfato de sodio al 1%
4. DESARROLLO EXPERIMENTAL
Primera parte.
A. TRIGLICÉRIDOS.
FUNDAMENTO. Los triglicéridos incubados con la enzima lipoprotein lipasa (LPL), liberan glicerol y ácidos
grasos libres. El glicerol es fosforilado por la acción de la enzima glicerol quinasa (GK) y ATP para producir
glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (ADP). El G3P es entonces convertido a dihidroxiacetona fosfato
(DAP) y peróxido de hidrogeno (H2
O2
) por la glicerol 3-oxidasa GPO.
Al final, el peróxido de hidrogeno (H2
O2
) reacciona con 4-aminofenazona (4-AF) y p-clorofenol, reacción
catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja, cuya intensidad es proporcional a la concentración
de triglicéridos presentes en la muestra:
Reacción
Lipoproteína lipasa
Triglicéridos + H2
O → Glicerol + Ácidos grasos libres
Glicerol quinasa
Glicerol + ATP → G3P+ ADP
GPO
G3P + O2
→ H2
O2
+ DAP
Peroxidasa
H2
O2
+ 4-AF + p-Clorofenol → Quinona (Complejo de color rojo)
Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el colesterol, son transportados a las
células del organismo por las lipoproteínas en la sangre.
Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicéridos.
Su aumento es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas disfunciones hepáticas (cirrosis,
hepatitis, obstrucción biliar) o diabetes mellitus, pueden estar asociadas con su elevación.
MUESTRA
Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el coágulo durante 5’ a 35
o
C y centrifugar durante 7’ a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100 utilizando una pipeta
pasteur.Se puede utilizar suero o plasma heparinizado o con EDTA. . La muestra es estable 5 días a 2-8ºC.
REACTIVOS
Nota: Dependiendo del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
R 1
Regulador
GOOD pH 7,5
p-Clorofenol
50 mmol/L
2 mmol/L
R 2
Enzimas
Lipoprotein lipasa (LPL) Glicerol quinasa (GK)
Glicerol-3-oxidasa (GPO) Peroxidasa (POD)
4 – Aminofenazona (4-AF)
ATP
150000 U/L
500 U/L
2500 U/L
440 U/L

0,1 mmol/L
0,1 mmol/L
Patrón de Triglicéridos 200 mg/dL
PREPARACIÓN DE REACTIVOS.
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en un frasco de R 1 Regulador. Tapar
y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad del reactivo de trabajo: 6 semanas en refrigeración (2-8ºC) o una semana a 15-25ºC.
Estabilidad: todos los componentes del kit son estables, hasta la fecha de caducidad indicada en la etiqueta,
cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se evita su contaminación. No usar
reactivos fuera de la fecha indicada.
PROCEDIMIENTO
1. Condiciones del ensayo:
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 505 (490-550) nm
Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC / 15-25ºC
2. Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3. Pipetear en una celda:
Reactivos Blanco Patrón Muestra
RT (mL) 1,0 1.0 1.0
Patrón (µL) -- 10 --
Muestra (µL) -- -- 10
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC o 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Leer la absorbencia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable durante
30 minutos.
CÁLCULOS
A (Muestra) (x 200 Conc. Patrón) / A (Patrón) = mg/dL de triglicéridos en la muestra
Factor de conversión: mg/dL x 0,0113 = mmol/L.
5.1 RESULTADOS
Equipo Triglicéridos (mg/dl) Equipo Triglicéridos (mg/dl)

CONTROL DE CALIDAD. Es conveniente analizar junto con las muestras sueros control valorados. Sí los
valores hallados se encuentran fuera del intervalo de tolerancia, se recomienda revisar el instrumento, los
reactivos y el calibrador.
VALORES DE REFERENCIA
Hombres: 40 – 160 mg/dL
Mujeres: 35 – 165 mg/dL
Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
B) HDL-COLESTEROL (Lipoproteínas de alta densidad)
FUNDAMENTO. Esta técnica permite la determinación directa del HDL-colesterol sin necesidad de pre-
tratamiento o centrifugado de la muestra.
El método se basa en las propiedades de un detergente que solubiliza sólo la fracción HDL, el cual se libera
reaccionando con la enzima colesterol esterasa, la colesterol oxidad y los cromógenos.
Las lipoproteínas LDL, VLDL y los quilomicrones son inhibidas debido a la adsorción del detergente en sus
superficies haciéndolas resistentes a la enzima. La intensidad de color formado es proporcional a la concentración
de HDL presente en la muestra.
MUESTRA. Obtener 3 mL de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el coágulo
durante 5’ a 35 o
C y centrifugar durante 7’ a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de 13 x 100
utilizando una pipeta Pasteur, se puede utilizar plasma pero no con citrato. El HDL-colesterol es estable por 7
días a temperatura ambiente, en este método. No utilizar muestras hemolizadas.
REACTIVOS
R 1
GOOD pH 7,0
Colesterol oxidasa < 1000 U/L
Peroxidasa < 1300 U/L
DSBmT < 1 mM
R 2
GOOD p H 7,0
Colesterol esterasa < 1500 U/L
4-aminoantipirina < 1 mM
Detergente < 2 %
Ascórbico oxidasa < 3000 U/L
HDL-colesterol/ LDL-c CAL Calibrador. Suero humano liofilizado
PREPARACIÓN DE REACTIVOS. Los reactivos R1 y R2 están listos para usarse. El calibrador se reconstituye
con 1 mL de agua destilada, tapar el vial y mezclar suavemente hasta disolver el contenido.
PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . . 600-700 nm
Cubeta o celda:. . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC

Reactivos Blanco Calibrador Muestra
R1 (µL) 300 300 300
Calibrador (µL) -- 3 --
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC o 10 minutos a temperatura ambiente.
5. Leer la absorbencia (A1) del calibrador y la muestra, frente al Blanco de reactivo.
6.- Añadir:
Blanco Calibrador Muestra
R 2 µL 100 100 100
7.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37o
C
8.- Leer la absorbencia (A2) frente a blanco de reactivo.
9.- Calcular: ∆A = A2 - A1
CÁLCULOS
(∆A) Muestra x Conc. del calibrador = mg/dl de HDL colesterol en la muestra
(∆A) Calibrador
Factor de conversión: mg/dL x 0,0259 = mmol/L.
5. 2 RESULTADOS
Equipo HDL-colesterol (mg/dl) Equipo HDL-colesterol (mg/dl)
Las lipoproteínas de baja densidad (LDL) y de muy baja densidad (VLDL) se pueden determinar de
acuerdo con la ecuación de Friedewald:
• VLDL-C= triglicéridos/5
• LDL-C= colesterol total - (HDL – C + VLDL – C)
Hombres Mujeres
Riesgo menor > 50 mg/dL > 50 mg/dL
Riesgo normal 35-50 mg/dL 45-60 mg/dL
Riesgo elevado < 35 mg/dL < 45 mg/dL

Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia.
Segunda sesión.
C) LIPOSOMAS
Etiquetar 4 tubos de 16 x 150 y adicionarles las sustancias como se indican en el siguiente cuadro y en estricto
orden.
Tubo 1 2 3 4
Lecitina (m L) 1 1 ----- ----
Almidón (mL) 1 1 1 1
AGITAR CON VORTEX DURANTE 5 MINUTOS (evitar la formación de espuma)
Pasar a el contenido de los tubos a los vasos de pp de 25 ml y
Calentar a baño maría a 45o
C hasta obtener un gel viscoso
Tomar una gota y observar al microscopio
α – amilasa (mL) 1 1 1 ----
Incubar a 37o
C durante 20 minutos
Agua destilada (mL) 2 2 2 2
Centrifugar a 4000 rpm durante 5 minutos y desechar el sobrenadante
SDS (mL) ----- 1 ------ 1
Prueba de Lugol
( gota)
1 1 1 1
Observación del
color de cada tubo
5.3 RESULTADOS
Hacer esquemas de las observaciones al microscopio de cada tubo
Anota con signo + si la prueba de lugol es positiva, en los tubos probados, en la tabla siguiente.
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4

6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Con los resultados obtenidos de cada equipo analiza y discute los valores obtenidos en el grupo, la metodología
utilizada, la importancia de las enzimas en las determinaciones. Incluye las preguntas del cuestionario para que
realices tu discusión.
Parte 1
1.- Explica el fundamento del método de cada una de las determinaciones.
2.- En las determinaciones de TAG y HDL-colesterol, menciona cuales fueron las fuentes de error que pudieron
alterar los valores obtenidos.
3.- ¿Qué ventajas y desventajas hay entre un método enzimático y uno colorimétrico?
4.- ¿Cuál es la importancia de las determinaciones de HDL-colesterol y triglicéridos?, explica las implicaciones
clínicas.
5.- ¿Por qué se considera a las LDL y VLDL el colesterol “malo” y a las HDL el colesterol “bueno”?
6.- En base a los resultados obtenidos comenta si son valores normales o no y explica porque lo consideras así.
7.- Investiga mínimo 2 sustancias que se utilizan para catabolizar a los TAG del organismo y disminuir su
concentración sanguínea. Explica como actúan a nivel molecular.
Parte 2
8.- Explica los resultados obtenidos en cada tubo
9.-¿Para que se adiciona el SDS y la α-amilasa?
10.- De acuerdo a sus datos, ¿es posible considerar a los liposomas como modelo de membrana? Explica
11.- Menciona cómo es posible encapsular en los liposomas sustancias hidrofílicas e hidrofóbicas.
12.- Indica como podría un fármaco encapsulado alcanzar a las células de un órgano específico
CUESTIONARIO
1.- Diseña un método para formar liposomas y demostrar que pueden encapsular sustancias.
7.- CONCLUSIONES. Con el análisis y discusión de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos de la
práctica y la investigación bibliográfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA.
Cita la bibliografía consultada para hacer tu reporte.
Bibliografia
Davidsohn I., Henry J. B.Todd-Sanford. Diagnóstico clínico por el laboratorio.6ª. Edición. Salvat editores.
Barcelona. 1979. 1484 págs.
Devlin. T. M., Bioquímica con aplicaciones clínicas tomo I y II 3ª. Ed- Reverté S.A., España. 1997. 1298 págs.
Boyer R. Conceptos en Bioquímica.1ra. Edición. International Thomson Editores. México. 1999. 694 pág

PRACTICA No. 5
DETERMINACIÓN DE TRANSAMINASAS, UREA Y ÁCIDO ÚRICO EN SUERO HUMANO.
UNIDAD IV: Metabolismo de compuestos nitrogenados.
TEMA
4.1 Degradación de proteínas y aminoácidos
4.2 Degradación de nucleótidos.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
El alumno analizará el metabolismo de compuestos nitrogenados y su inhibición, para entender el papel
de los fármacos.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno obtendrá muestras de sangre humana para la determinación de transaminasas, urea, y
ácido úrico en una muestra de suero.
1.2.2 El alumno determinará cuantitativamente la cantidad de transaminasas, urea y ácido úrico mediante
el empleo de pruebas de diagnóstico clínico y los valores obtenidos los comparará con los de
referencia
2. INTRODUCCIÓN
El metabolismo nitrogenado incluye a las proteínas y los aminoácidos, así como otros compuestos
derivados de los aminoácidos como las bases purínicas y pirimidínicas, grupos hemo, moléculas
relacionadas como la hemoglobina, poliaminas, creatina, diversos neurotransmisores y hormonas.
Sin embargo el ácido úrico es el principal producto de la degradación de las purinas, la mayor parte de la
formación de ácido úrico se lleva a cabo en el hígado Los valores normales de ácido úrico varían
ampliamente por diversos factores tales como edad, orígenes raciales, sexo, sociales y geográficos;
además el método analítico utilizado. Igualmente numerosas enfermedades y alteraciones fisiológicas
modifican la concentración de ácido úrico en la sangre, siendo el aumento más significativo lo que se
denomina hiperuricemia.
El ácido úrico y sus sales son el resultado final del metabolismo de las purinas (partes de DNA y RNA).
La mayor parte del ácido úrico se excreta por el riñón, y algo por el sistema intestinal. Cuando aumenta la
destrucción de los tejidos (como en diversos tipos de cáncer) el ácido úrico aparece elevado en sangre, la
consecuencia de la elevación es la gota.
En este padecimiento existe una sobre producción de ácido úrico, y la poca solubilidad del urato sódico
hace que se depositen cristales de éste en las articulaciones y el riñón. Es un trastorno del metabolismo
de las purinas (adenina y guanina) y no de las proteínas, como a veces se considera.
Las sales sódicas de ácido úrico tienen una muy escasa solubilidad en medio acuoso, dicha solubilidad
disminuye al disminuir la temperatura y el pH de manera que por encima de concentraciones plasmáticas
de 7 mg / dl de ácido úrico pueden precipitarse en forma de cristales.
Por su similitud estructural con sustratos y productos el alopurinol es un inhibidor competitivo de la
xantina oxidasa, reduciendo la producción de ácido úrico, de ahí su utilidad en el tratamiento de la gota
donde favorece la acumulación de la hipoxantina y xantina, que se van eliminando por la orina
Existe una enfermedad hereditaria denominada xanturia que es la falta de xantina oxidasa que impide la
formación de ácido úrico, por lo que los productos catabólicos consisten fundamentalmente en xantina,
que se depositan en forma de cálculos en el tracto urinario.
La urea es el resultado final del metabolismo del nitrógeno de las proteínas. Se forma en el hígado a
partir de la destrucción de las proteínas. Durante la digestión de las proteínas son separadas en
aminoácidos, éstos contienen nitrógeno que se libera como ión amonio, y el resto de la molécula se utiliza
para generar energía en las células y tejidos. El amonio se une a pequeñas moléculas para producir urea,

la cual aparece en la sangre y es eliminada por la orina. Si el riñón no funciona bien la urea se acumula
en la sangre y se eleva su concentración.
La aspartato aminotransferasa (AST) es una enzima intracelular que se encuentra en niveles altos en el
músculo del corazón, las células del hígado, las células del músculo esquelético y en menor cantidad en
otros tejidos.
Aunque un nivel elevado de AST en suero no es específico de enfermedad hepática se emplea
principalmente para su diagnóstico y seguimiento, junto con otras enzimas como la ALT y ALP. También
se utiliza en el control post-infarto, en pacientes con desordenes del músculo esquelético, y en otras
afecciones.
La AST cataliza la transferencia reversible de un grupo amino del aspartato al α-cetoglutarato con
formación de glutamato y oxalacetato. El oxalacetato producido es reducido a malato en presencia de
malato deshidrogenada (MDH) y NADH.
La alanina aminotranferasa (ALT) cataliza la transferencia de un grupo amino de la alanina al α-
cetoglutarato con formación de glutamato y piruvato. El piruvato producido es reducido a lactato en
presencia de lactato deshidrogenasda (LDH) y NADH.
En la determinación de estas dos enzimas la velocidad de disminución de la concentración de NADH en
el medio determinada espectrofotometricamente es proporcional a la c concentración catalítica de la AST
y ALT en la muestra.
3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
3.1. Material por equipo
9 tubos de ensaye 13 X 100 mm
1 gradilla
1 pipetas Pasteur
1 bulbo para pipeta Pasteur
1 jeringa con aguja estéril de 5 mL
Torundas impregnadas con alcohol
1 ligadura
Recipiente para objetos punzocortantes
Pipeta automática
Puntas para pipeta automática
1 pizeta con agua destilada
Frasco para muestras de orina
3.2. REACTIVOS
Kit de reactivos para la detección cuantitativa de aspartato aminotransferasa AST (GOT) o un juego de
reactivos para la detección cuantitativa de alanina aminotransferasa GTP (ALT)
Para la determinación de aspartato aminotransferasa GOT (AST)
R 1
Tampón
TRIS pH 7,8
L-Aspartato
80 mmol/L
200 mmol/L
R 2
Substrato
NADH
Lactato deshidrogenasa (LDH)
Malato deshidrogenasa (MDH)
α-Cetoglutarato
0,18 mmol/L
800 U/L
600 U/L
12 mmol/L
Kit de reactivos para la detección cuantitativa de nitrógeno en urea.
R 1 o-Ftalaldehido 4,8 mmol/L

R 2 Solución borato 87 mmol/L
UREA CAL Patrón primario acuoso de Urea 50 mg/dL
Kit de reactivos para la detección cuantitativa de ácido úrico.
3.3. Equipo
Centrífuga clínica
Espectrofotómetro
3.4 Muestra biológica
Muestra de suero o plasma heparinizado
Muestra de orina
Urea en orina: Diluir la muestra al 1/50 en agua destilada. Mezclar. Multiplicar el resultado obtenido por
50 (factor de dilución). Evitar el crecimiento bacteriano, manteniendo el pH < 4.
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera aséptica 5 ml de sangre siguiendo las instrucciones del profesor en un tubo de
ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- En un frasco de toma de muestra de orina limpio y seco depositar aproximadamente 50 ml de orina,
de preferencia la primera de la mañana.
c.- Determinación de transaminasas
1.- Encender el aparato y seleccionar la longitud de onda de:340 nm
2.- Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
3.- Disolver una tableta de R2 (sustrato) en R1 (regulador)
4.- En la celda espectrofotométrica pipetear lo que se indica en el siguiente cuadro.
RT (mL) 1,0
Muestra (µL) 100
5.- Mezclar e incubar por 1 minuto
6.- Leer la absorbancia (As) inicial de la muestra, poner en marcha el cronómetro y leer la absorbancia
cada minuto durante 3 minutos.
7.- Calcular el promedio del incremento de absorbancia por minuto (∆A/min).
R 1
Tampón
Fosfatos pH 7,4
2-4 Diclorofenol Sulfonato (DCPS)
50 mmol/L
4 mmol/L
R 2
Enzimas
Uricasa
Peroxidasa (POD)
Ascorbato oxidasa
4 - Aminofenazona (4-AF)
60 U/L
660 U/L
200 U/L
1 mmol/L
ácido úrico cal. Patrón primario acuoso de Ácido úrico 6 mg/dL

Datos
Asinicial: ___ As60s____ As 120s:______ As180s:_____
∆A= As60s – Asinicial : ___________
∆A= A120s – As60s : ____________
∆A= As180s – As120s : ___________
Obtener el promedio: __________ y aplicar la siguiente formula.
CÁLCULOS:
∆A/min x 1750 = U/L de AST
Unidades: La unidad internacional (UI) es la cantidad de enzima que convierte 1 µmol de substrato por
minuto, en condiciones estándar. La concentración se expresa en unidades por litro (U/L).
Valores de referencia orientativos.
Aspartato aminotransferasa
Hombres Hasta 19 U/L 26 U/L 38 U/L
Mujeres Hasta 16 U/L 22 U/L 31 U/L
d.- Determinación cuantitativa de urea en suero (marca SPINREACT)
1.- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda de 510 nm
2.- Cinética: Preparar una serie de tres tubos como se muestra en el siguiente cuadro
R 1 (ml) 1,0 1,0 1,0
Patrón (µl) -- 50 --
Muestra (µl) -- -- 50
3.- Mezclar e incubar por un minuto a 35 °C y añadir 1 ml del reactivo (R2) a cada tubo.
4.- Inmediatamente colocar el contenido del tubo a una celda espectrofotometrica y leer la absorbancia a
los 60 y 120 s.
5.- Calcular el incremento de Absorbancias ∆As= As2
– As1
.
Datos:
As1 60 s: _______________ As2 120 s: ______________
CÁLCULOS
(∆As) muestra
---------------------X 50 (conc. del patrón)= mg/dl de urea en la muestra.
(∆As) patrón
Urea
Suero: de 15 a 45 mg/dL (2.49-7.49 mmol/L)
Orina: de 20 a 35 g/24 horas
e.- Determinación cuantitativa de ácido úrico (marca SPINREACT)
1.- Preparar el reactivo de trabajo, disolviendo el contenido de R2 (enzimas) en el frasco de R1
(regulador), el reactivo así preparado es estable por un mes de 2 a 8 °C o 10 días a temperatura
ambiente.
2.- Encender el espectrofotómetro y seleccionar la longitud de onda de 520 nm

3.- Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada.
4.- Colocar y etiquetar una serie de tres tubos y adicionar lo que indica la siguiente tabla
RT (ml 1,0 1,0 1,0
Patrón (µl) -- 25 --
Muestra (µl) -- -- 25
5.- Mezclar e incubar 5 minutos a 37 °C o 10 minutos a temperatura ambiente
6.- Leer la absorbancia (A) del patrón y la muestra, frente al blanco de reactivos. (La reacción es estable
por 30 min)
CÁLCULOS:
Recordar que hay que ajustar con agua destilada a cero y luego leer el blanco de reactivos y al valor
obtenido de la muestra, restarle el valor del blanco de reactivos.
As de la muestra ______ As del patrón: _______ Concentración del patrón:
_______
Suero o plasma
(As) muestra
---------------------X 6 (conc. del patrón)= mg/dl de ácido úrico en la muestra.
(As) patrón
(As) muestra
---------------------X 6 X vol (dl) orina / 24 h = mg/24 h de ácido úrico en la muestra.
(As) patrón
Ácido úrico
Suero o plasma
Mujeres: 2,5 – 6,8 mg/dl
Hombres: 3,6 – 7,7 mg /dl
Orina: 250 – 750 mg/24 h
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Las siguientes preguntas se deben emplear para fortalecer el reporte.
¿Cuál es la sensibilidad del método utilizado para cada prueba?, ¿Cómo determinamos la sensibilidad
analítica? ¿Existen para las determinaciones algunas sustancias que pueden interferir con los valores
orientativos de referencia? ¿Por qué en el caso de la urea utilizamos una cinética para la determinación
de este parámetro?, ¿Por qué decimos que son valores orientativos de referencia?, dado que estos
compuestos nos indican la degradación de proteínas y ácidos nucleicos, Qué interpretación le damos a
un aumento o una d disminución de los valores?, ¿Cómo te percatarias que los reactivos ya no son
funcionales?
CONCLUSIONES
Anota las conclusiones obtenidas en esta práctica
BIBLIOGRAFÍA
Devlin, T. M. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 5ta. Edición. Ed. Reverté. España. 2000.
1298pags.
Lozano, J.A. Bioquímica y biología molecular para ciencias del a salud. 2da. Edición. Ed.McGraw-Hill.|
España.2001. 522 p

PRÁCTICA 6
DETERMINACIÓN DE COLESTEROL EN SUERO HUMANO
UNIDAD V. Anabolismo celular
Tema: 5.4. Metabolismo de colesterol.
1.- OBJETIVOS
1.1 Objetivo general.
El alumno analizará el anabolismo de lípidos mediante la determinación de colesterol.
1.2 Objetivo específico.
El alumno realizará la determinación experimental de colesterol en suero humano.
2. INTRODUCCIÓN.
El colesterol es un lípido esteroide presente en las células de los tejidos animales, hidrofóbico, poco
soluble en medio acuoso, se puede encontrar libre o esterificado con ácidos grasos, se une a diversas
proteínas formando las lipoproteínas plasmáticas para ser transportado. La determinación de la
concentración plasmática de colesterol tiene gran interés clínico, pues está demostrada la relación entre los
niveles altos de colesterol y la incidencia de aterosclerosis y cardiopatía isquémica.
Sabemos que el colesterol es necesario para el adecuado crecimiento y desarrollo celular, pero en exceso
es potencialmente dañino. Su transporte por las lipoproteínas y captura en las células está regulado, pero
demasiado colesterol en la sangre lleva a que se acumule, en especial en las arterias a las que puede
obstruir (ateroesclerosis).
Los mamíferos pueden obtener el colesterol por dos vías, la exógena y la endógena. La vía exógena es por
la ingesta de alimentos de origen animal, como el hígado, lácteos, carnes rojas y yema de huevo. La vía
endógena es la biosíntesis de colesterol en el organismo, que se realiza en el retículo endoplásmico liso y
cuyo precursor es la acetil-coenzima A. Diariamente el hígado produce alrededor de 800 a 1000 mg de
colesterol, aunado a los cientos de miligramos que ingerimos en la dieta, daría una elevada concentración
de este, pero la ingesta de colesterol disminuye la síntesis en el organismo.
El colesterol desempeña varias funciones bioquímicas importantes, es un componente esencial de las
membranas celulares en animales, donde regula su fluidez y es un precursor de muchas biomoléculas
importantes, incluidas las hormonas esteroideas, las sales biliares y la vitamina D. Los problemas de salud
no se deben a un efecto directo de la molécula, sino a una deficiencia fisiológica en su transporte, debido a
su baja solubilidad y tiene que ser transportado por proteínas plasmáticas formando lipoproteínas, como
las LDL, VLDL y HDL.

El proceso de captación inicia con la unión de las LDL que contienen colesterol con lugares de unión
específicos en las células, conocidos como receptores proteicos de la membrana plasmática. Las LDL se
invaginan en la membrana plasmática y se fusionan como parte de ella para formar una vesícula
endocítica. Dentro de la célula, la vesícula se fusiona con los lisosomas, y las enzimas lisosomales
catalizan la hidrólisis de los ésteres de ácido graso dejando al colesterol libre para la construcción de
membranas. Una de las causas de hipercolesterolemia (niveles altos de colesterol sanguíneo) es un
defecto genético, donde las personas carecen de receptores de LDL funcionales y desarrollan el síndrome
conocido como hipercolesterolemia familiar. Esta enfermedad ocasiona que los niveles de colesterol
lleguen hasta 700 mg/100 ml, los niveles normales están entre 150-200 mg/100 ml). El colesterol se
deposita como placas en las arterias y provoca aterosclerosis (endurecimiento de las arterias), muchos de
las personas que padecen esta enfermedad mueren de ataques cardiacos durante su infancia.
En general se promueve en la población reducir el consumo de colesterol y grasas en la dieta, pero existen
factores que no podemos modificar como el genético y el de género: las mujeres tienden a acumular
menos colesterol y sus niveles de HDL son más altos y tienen menor incidencia a sufrir enfermedades
cardiovasculares que los hombres. Otros factores que si podemos modificar son el hábito de fumar, el
consumo de alcohol, una dieta abundante en grasa, la falta de ejercicio, y un continuo estrés, que en su
conjunto aumentan los niveles de colesterol y TAG.
3. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS POR EQUIPO
Baño a 25 o 30o
C
1 gradilla
5 tubos de 13 x 100
2 pipetas de 2 ml
2 pipetas de 1 ml
Una jeringa de 10 ml y/o aguja, adaptador y tubo vacutainer sin anticoagulante.
EQUIPO
Espectrofotómetro para luz UV
1 porta celdas
1 centrífuga
REACTIVOS
Kit para Colesterol
MUESTRA: Obtener 3 ml de sangre en un tubo vacutainer sin anticoagulante, dejar que se retraiga el
coágulo durante 5’ a 35 o
C y centrifugar durante 7’ a 4000 rpm. Separar el suero en un tubo de ensaye de
13 x 100 utilizando una pipeta pasteur.Se puede utilizar suero o plasma. La muestra es estable 7 días a 2-
8ºC y varios meses si se mantiene la muestra congelada (-20ºC).
A. COLESTEROL. Los primeros métodos para la determinación del colesterol se basaban en la formación
de compuestos coloridos mediante reacciones químicas del colesterol. No obstante, debido a los líquidos
corrosivos que utilizan, estos métodos actualmente no se suelen emplear para los análisis de rutina, a la
fecha se han desarrollado métodos enzimáticos, igualmente específicos, de fácil manejo y de gran
sensibilidad.

Fundamento: En estos métodos enzimáticos, la primera reacción consiste en la hidrólisis de los ésteres de
colesterol por acción de esterasas bacterianas inespecíficas con respecto al ácido graso esterificado; a
continuación se produce la oxidación del colesterol (el formado en la reacción anterior y el preexistente, o
colesterol libre en plasma) por una colesterol oxidasa, produciéndose H2O 2, el cual con la participación
de peroxidasa da lugar a la formación de un compuesto colorido. El esquema de las reacciones acopladas
es el siguiente:
CHE
Ésteres colesterol + H2
O Colesterol + Ácidos grasos → CHOD
POD2
O
Colesterol + O2
→ 4-Colestenona + H2
O2
2 H2
O2
+ Fenol + 4-Aminofenazona Quinonimina + 4H+
→ Compuesto colorido
CHE: Colesterol esterasa
CHOD: Colesterol oxidasa
POD2O: Peroxidasa
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra
ensayada
El colesterol es una sustancia presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente
todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La
determinación del colesterol es uno de las herramientas más importantes para el diagnóstico y
clasificación de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de
riesgo cardiovascular.
El diagnostico clínico debe realizarse teniendo en cuenta todos los datos clínicos y de laboratorio.
Dependiendo del Kit que se tenga en la práctica, las concentraciones, cantidades y condiciones de las
reacciones pueden variar.
REACTIVOS
R 1
Regulador
PIPES pH 6,9
Fenol
90 mmol/L
26 mmol/L
R 2
Enzimas
Colesterol esterasa (CHE)
Colesterol oxidasa (CHOD)
Peroxidasa (POD)
4 - Aminofenazona (4-AF)
300 U/L
300 U/L
1250 U/L
0,4 mmol/L
Patrón de Colesterol 200 mg/dL
PREPARACIÓN DE REACTIVOS:
Reactivo de trabajo (RT): Disolver el contenido de un vial de R 2 Enzimas en 1 frasco de R 1 Regulador,
tapar y mezclar suavemente hasta disolver su contenido.
Estabilidad (RT): 4 meses en nevera (2-8ºC) o 40 días 15-25ºC. Mantener protegido de la luz
Conservación y estabilidad. Todos los componentes del kit son estables hasta la fecha de caducidad
indicada en la etiqueta, cuando se mantienen los frascos bien cerrados a 2-8ºC, protegidos de la luz y se
evita su contaminación.
Patrón de colesterol. Una vez abierto, es estable 1 mes si se mantienen bien cerrados a 2-8ºC, protegidos
de la luz y se evita su contaminación.

PROCEDIMIENTO
Longitud de onda: . . . . . . . . . . . . . . . 505 nm (500-550)
Cubeta o celda. . . . . . . . . . . . . . . .. .1 cm paso de luz
Temperatura. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37ºC /15-25ºC
Reactivo de trabajo (mL) 1,0 1,0 1,0
Patrón de colesterol (µL) -- 10 --
4. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC ó 10 min. a temperatura ambiente.
5. Leer la absorbancia (A) del Patrón y la muestra, frente al Blanco de reactivo. El color es estable
durante 60 minutos.
CÁLCULOS
A (Muestra) (x 200 (Conc. Patrón) / Patrón) A = mg/dL de colesterol en la muestra
Factor de conversión: mg/dL x 0,0258= mmol/L.
5.-RESULTADOS
Equipo Colesterol (mg/dl) Equipo Colesterol (mg/dl)
Evaluación del riesgo:
Menos de 200 mg/dL Normal
200-239 mg/dL Moderado
240 o más Alto

Estos valores son orientativos. Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de
referencia.
6.- ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS.
Analiza y discute los resultados obtenidos, así como la metodología utilizada. Discute la importancia del
uso de las enzimas en el diagnóstico clínico. Contesta las siguientes preguntas e inclúyelas en la discusión.
1.- ¿Cual es la importancia clínica de las determinaciones de colesterol?
2.- Explica 3 enfermedades ocasionadas por la alteración de los niveles de colesterol y que otros
parámetros hay que tomar en cuenta.
3.- ¿Por qué los valores de colesterol pueden variar de una localidad a otra?
4.- ¿Por qué la ingesta de colesterol, disminuye la síntesis de colesterol en el hígado?
5.- Investiga 2 fármacos que se utilicen para disminuir la concentración de colesterol en la sangre
6.- ¿Qué enfermedad genética ocasiona la hipercolesterolemia, y que proteína se ve afectada?
7.- CONCLUSIONES. Con el análisis y discusión de los resultados obtenidos, y en base a los objetivos
de la práctica y la investigación bibliográfica, haz tus conclusiones.
8.- BIBLIOGRAFIA.
Cita la bibliografía consultada para hacer tu reporte.
Bibliografia
Davidsohn I., Henry J. B.Todd-Sanford. Diagnóstico clínico por el laboratorio.6ª. Edición. Salvat editores.
Barcelona. 1979. 1484 págs.
Devlin. T. M., Bioquímica con aplicaciones clínicas tomo I y II 3ª. Ed- Reverté S.A., España. 1997. 1298
págs.
Boyer R. Conceptos en Bioquímica.1ra. Edición. International Thomson Editores. México. 1999. 694 pág

Practica No 7
TRANSFERENCIA Y EXPRESIÓN DE MATERIAL GENÉTICO
Relación con Unidad Temática
VI. Aspectos Genéticos del Metabolismo
I. OBJETIVOS
El alumno trasferirá material genético a un microorganismo.
El alumno verificara que el material genético contiene la información específica.
II. FUNDAMENTOS TEÓRICOS.
El DNA (ácido desoxirribonucleíco) es el almacén de la información genética de los seres
vivos, en el se encuentran codificadas todas la características que definirán a un ser vivo
como miembro de una determinada especie, así como un organismo con características
propias individuales.
La expresión de material requiere primero de su amplificación por el mecanismo de
transcripción, donde se generan moléculas de RNA que llevan la información genética
hacia el sistema donde ésta será decodificada mediante el proceso de traducción, en el, la
información es traslocada a una proteína específica, las diversas proteínas generadas por la
transcripción y traducción de diversos genes darán origen a los complejos
macromoleculares enzimáticos o estructurales que generarán en última instancia las
características propias de cada individuo.
Si bien el “pool” genético es propio de cada especie e individuo, en la naturaleza existen
diversos mecanismos que permiten el intercambio de material genético entre organismos de
modo tal que las características de un individuo así como de su descendencia pueden
modificarse y ser expresadas como propias. Desde hace varios años los investigadores han
logrado manipular los diversos mecanismos de transferencia de material genético para
lograr un fin determinado, intentando incluso la manipulación genética en el ser humano
empelando para ello las técnicas modernas de biología molecular.
La transducción, la conjugación y la transformación son las vías, mediante las cuales se
puede introducir material genético exógeno a una célula. La transformación genética se
presenta cuando, el DNA desnudo es incorporado a la célula, después de esto, el DNA
puede o no ser integrado al propio material genético. El material genético puede ser un
plásmido que ha sufrido o no la manipulación por el hombre, por lo que podría contener
genes de resistencia o de importancia industrial o farmacológica.
La síntesis de proteínas puede ser constitutiva o inducida, esto es, la síntesis de proteínas es
regulable, la regulación ocurre a nivel de transcripción, lo que significa que muchas
proteínas solo serán generadas cuando la célula lo requiera, cuando se presente un estímulo
que desencadene su producción, estímulo que generalmente es una señal del medio
ambiente.

En esta práctica se empleará el plásmido pGLO, el cual, contiene el gen para la proteína
verde fluorescente, aislada de la medusa Aequorea victoria, (un eucariota), unida al
promotor PBAD de arabinosa, el gen ara C, y el gen para resistencia a ampicilina el cual
actúa como gen reportero. Éste plásmido se introducirá a una célula bacteriana para dotarla
de la capacidad de producir la proteína verde fluorescente (GFP) y se inducirá su expresión
con el catabolito arabinosa.
III. MATERIAL, EQUIPO Y REACTIVOS
Plásmido pGLO.
Solución de transformación con cloruro de calcio estéril.
Caldo Luria
Medio Luria con Ampicilina (50µg/ml)
Medio Luria con Ampicilina y Arabinosa (1mg/ml)
Tubos de microensayo de 1.5 ml estériles.
Pipetas automáticas de una 1000µl y otra de 10µl
Puntas estériles
Asa bacteriológica
Pipetas estériles de 1ml.
Varilla acodada
Baño de hielo
Baño Maria a 42°C
Lámpara de luz UV
Incubadora a 37°C
IV. DESARROLO EXPERIMENTAL
Todo el trabajo se realizará en condiciones de esterilidad, cerca de un mechero encendido.
1. Marcar dos tubos de microensayo estériles como +pGLO y –pGLO (Testigo)
2. Transferir a cada tubo 250µl de solución de transformación.
3. Colocar los tubos en hielo.
4. Con asa bacteriológica tomar una colonia de bacterias y sumergirla en la solución de
transformación en uno de los tubos, agitando para formar una suspensión bacteriana.
5. Repetir el procedimiento con el otro tubo.
6. Tomar el tubo con la solución de pGLO y examinarlo bajo luz UV. Anotar las
observaciones.
7. Tomar 1µl de ésta solución de plásmido y adicionarlo al tubo con la suspensión
bacteriana. Adicionar también 1µl al tubo testigo.
8. Incubar los tubos en hielo durante 10minutos.
9. Transferir ambos tubos a un baño maría a 42°C durante exactamente 50 segundos.
10. Inmediatamente después regresarlos al hielo. Para mejores resultados se deben realizar
los cambios de hielo a 42°C y de regreso a hielo, lo más rápido posible.
11. Incubar en hielo durante 2 minutos.
12. Sacar del hielo los tubos y adicionar a cada uno 250µl de caldo luria en condiciones
estériles. Mezclar perfectamente.
13. Incubar los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos.

14. Tomar 0,1ml de cada tubo y colocarlos en las diferentes cajas de petri según el siguiente
esquema: (Usar una pipeta estéril para cada tubo)
Tubo con pGLO Tubo sin pGLO
LB + Amp LB + Amp + Ara LB + Amp LB
15. En condiciones estériles, realizar extensión con varilla
16. Etiquetar las cajas e incubar a 37°C, durante 24 horas.
17. Observar las colonias a luz normal y bajo luz UV. Contar el número de colonias en cada
caja y bajo los dos tipos de luz.
V. RESULTADOS
Anote lo que se pide.
¿Que se observa en el tubo con pGLO al iluminarlo con luz UV?
_____________________________________________________________________
Morfología colonial
Anote la frecuencia de transformación
________________________________________________.
VI. ANALISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Incorpora cada uno de los siguientes puntos en tus análisis y discusión de resultados.
Haz un esquema del DNA y explica como es que la información genética se encuentra
almacenada ahí.
Haz un esquema de un plásmido, señala sus partes importantes, explica que es y cual es su
función, explica también que es un gen reportero y que propiedad confiere el gen. Amp a
los organismos que lo poseen.
Di cual es el papel de la arabinosa en éste sistema.
Di que es la proteína verde fluorescente y que características tiene.
Con pGLO Sin pGLO
Medio LB + Amp. LB+Amp+Ara LB + Amp LB
No de colonias
Color
Forma
Aspecto
Fluorescencia
Tamaño

Que características tiene el medio LB.
Explica que información se desprende de la tabla, explica porque hay diferente número de
colonias en cada cuadro, explica el porque de cada resultado.
En cuanto a la morfología colonial ¿es igual en los diferentes medios o diferente? di porque.
Di que pasa al iluminar con luz UV las placas y porque sucede eso, que fenómeno ocurrió
en la columna dos que no ocurrió en la columna uno.
Puedes afirmar, que ocurrió incorporación de material genético a las bacterias, explica tu
respuesta.
Puedes afirmar con estos experimentos que la información genética se encuentra en el DNA,
explica tu respuesta.
Que te dice el resultado de la frecuencia de transformación, ¿para que nos sirve éste dato?
En tu campo para que podrías ocupar este conocimiento, sobre la transformación
particularmente en bacterias.
VII. CONCLUSIONES
De acuerdo a los resultados, a su análisis y discusión anota las conclusiones que de esto se
desprende.
VIII. BIBLIOGRAFÍA
Devlin. T. M., Bioquímica con aplicaciones clínicas tomo I y II 3ª. Ed- Reverté S.A.,
España. 1997. 1298 págs.
Stryer L. J. Berg, J. Tymoczko Bioquímica. 5° edición. Ed. Reverté, España, 2003. 974
págs.
Sambrook, J. y col 1989. Molecular cloning. Cold Spring Harbor laboratory. CSH. New
York.

PRACTICA No. 8
DETERMINACIÓN DE HORMONA GONADOTROPINA CORIÓNICA HUMANA (HGC)
UNIDAD VII: Integración y Regulación del Metabolismo.
TEMA
7.3 Principales Hormonas en humanos.
1. OBJETIVOS
1.1 Objetivo General
Explicará la regulación del metabolismo y el papel de las hormonas en el mismo.
1.2 Objetivos Específicos
1.2.1 El alumno realizará la determinación cualitativa de la hormona gonadotropina corionica humana en
una muestra biológica.
1.2.3 El alumno interpretará el resultado como una forma de diagnostico.
2. INTRODUCCIÓN
A partir del momento en que el óvulo es fecundado por un espermatozoide, comienzan a producirse en el
cuerpo de la mujer, una serie de cambios bioquímicos destinados a adaptarse a la nueva situación, y que
continuarán durante los nueve meses siguientes. Esto es lo que conocemos como un embarazo.
Existen muchas señales asociadas al embarazo, la más común es la falta menstrual, pero como no todas
las mujeres tienen periodos regulares es importante observar otras señales como: náuseas, acidez,
fatiga, y micciones frecuentes, aunque para confirmar el embarazo, es necesario detectar la presencia de
una hormona llamada gonadotropina coriónica humana (HGC), que es producida por la placenta y se
encuentra presente en la sangre y en la orina de la mujer embarazada, siendo detectable de 7 a 10 días
tras la concepción.
La hormona gonadotropina coriónica humana (HCG) es una hormona glicoproteica que se produce en
condiciones normales en la placenta y aparece en el plasma y en la orina durante el embarazo. La HCG,
junto a la hormona folículo estimulante (FSH), la hormona luteinizante (LH) y la hormona estimulante del
tiroides (TSH), está constituida por una cadena alfa, estructuralmente similar entre ellas, y una cadena
beta específica que determina su actividad biológica. Esta hormona estimula la producción de hormonas
esteroides por el cuerpo lúteo, lo que propicia el ambiente uterino adecuado para el desarrollo del
embrión. El principal uso de la determinación de la HCG es el diagnóstico temprano del embarazo; sin
embargo, es posible observar niveles elevados en pacientes con carcinomas urogenitales, embarazos
ectópicos y ováricos.
La HGC constituida por dos subunidades, la subunidad α la cual es idéntica a las subunidades β de
hormonas hipofisiarias como la (LH), (FSH), y (TSH). La subunidad β es la que proporciona su función
biológica específica y la que detecta específicamente a la hora de hacer la prueba, por lo tanto cuando se
determina la HCG lo que realmente se mide es la subunidad β de la HGC.
La determinación de HCG se realizaba tradicionalmente por ensayo inmunoisotópico (RIA) con el uso de
anticuerpos policlonales, método altamente sensible pero que presenta un marcado efecto de reacciones
cruzadas en relación con las demás hormonas glicoproteicas, lo cual hace poco precisos los resultados.
De ahí que recurrir a la tecnología de producción de hibridomas es una ventaja en este sentido, ya que
permite disponer de poblaciones homogéneas de anticuerpos que por su especificidad y suministro
ilimitado permiten desarrollar metodologías alternativas.
En el mercado existen muchos reactivos comerciales entre los que podemos encontrar los
inmunoensayos por cromatografía de flujo lateral. El método emplea una combinación única de
conjugado anticuerpo monoclonal-colorante y anticuerpos policlonales en fase sólida para identificar
selectivamente HCG presente en la muestra, con un elevado grado de sensibilidad. En menos de 5
minutos, pueden detectarse niveles de HCG tan bajos como 10 mIU/ml.

Cuando se aplica una cantidad suficiente de muestra en la porción absorbente, ésta migra por capilaridad
a través de la tira. El conjugado anticuerpo-colorante se une a la HCG formando un complejo anticuerpo-
antígeno. Este complejo se une al anticuerpo anti-HCG de la zona de reacción positiva produciendo una
banda coloreada rosa cuando la concentración de HCG es mayor de 10 mIU/ml. En ausencia de HCG, no
se observa banda alguna en la zona de reacción positiva. La mezcla de reacción continua la migración a
través de la tira hasta la zona control. El conjugado libre aún, se une a los reactivos de la zona control
formando una banda coloreada rosa, demostrando el correcto funcionamiento de la prueba.
3. MATERIAL, REACTIVOS Y EQUIPO
3.1. Material por equipo
2 tubos de ensaye 13 X 100 mm
1 gradilla
1 pipetas Pasteur
1 bulbo para pipeta Pasteur
1 jeringa con aguja estéril de 5 mL
Torundas impregnadas con alcohol
1 ligadura
Recipiente para objetos punzocortantes
3.2. Reactivos
1 kit comercial para la detección de HGC
3.3. Equipo
Centrífuga clínica
3.4 Muestra biológica
Muestra de suero
Muestra de orina
TOMA DE MUESTRA
a.- Suero
1.- Tomar de manera aséptica 5 ml de sangre, con el procedimeitno que indique el profesor en un tubo de
ensaye limpio y seco, el cual debe estar etiquetado.
2.- Centrifugar durante 5 minutos a 3000 rpm
3.- Separar el suero por medio de una pipeta Pasteur
b.- Orina
1.- Etiquetar un frasco, el cual debe estar limpio y seco
2.- Solicitar a la persona a la cual se le hará la determinación la muestra de orina, de preferencia la
primera orina de la mañana.
3.- Si el análisis no se realiza inmediatamente la muestra se puede refrigerar de 2 a 8 °C, hasta por 24
horas.
DESARROLLO EXPERIMENTAL
1.- Una vez colocada la muestra en el tubo correspondiente ya sea de suero u orina.
2.- Introducir verticalmente la tira HCG en la muestra durante 5 segundos para las muestra de orina o 10
segundos para las muestras de suero.

3.- Leer en ambos casos el resultado a los 3-5 minutos y comparar con el resultado que viene en el
inserto de la prueba.
Precaución: No sobrepasar la marca roja y no interpretar el resultado después de transcurrir 10 minutos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
1.- La prueba solo sirve como diagnostico in vitro como un estudio preliminar cualitativo.
2.- No realizar la prueba en embarazos muy temprano, pues a bajas concentraciones el resultado puede
ser negativo.
RESULTADOS
Negativo: Si sólo aparece una banda coloreada transversal en la zona blanca superior (banda control)
Positivo: Además de la banda transversal roja (control) aparece una segunda banda transversal roja en
la zona blanca central de la tira
No válido: Si no aparece ninguna banda coloreada visible se recomienda repetir la prueba con una
nueva placa u obtener una muestra fresca.
ANÁLISIS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
Las siguientes preguntas se deben emplear para fortalecer el reporte.
¿Cuál es la sensibilidad de este método?, Dado que existe una fracción similar en varias hormonas ¿Cuál
es la importancia de elegir una fracción específica en la determinación de esta prueba?, ¿Con que
hormonas puede ocasionar reacciones cruzadas y cuando se llevaría a cabo? ¿Existen algunas
sustancias que interfieran en el método?, ¿Esta hormona solo es secretada en las mujeres?, ¿Cuál es la
función de la HGC?
CONCLUSIONES
Anota las conclusiones obtenidas en esta práctica
BIBLIOGRAFÍA
Devlin, T. M. Bioquímica con aplicaciones clínicas. Tomo I y II. 5ta. Edición. Ed. Reverté. España. 2000.
1298 pags.
Lozano, J.A. Bioquímica y biología molecular para ciencias del a salud. 2da. Edición. Ed.McGraw-Hill.|
España.2001. 522 pags.

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