Dna - Estructura y conformación

Blgo. Carlos A. Fernández M.
FernandezC4@gmail.com
Setiembre, 2007

Estructura del DNA

• Polinucleótido producido por la polimerización de
desoxirribonucleótidos
Grupo Fosfato + β – D - desoxirribofuranosa + Base nitrogenada
Desoxirribonucleósido
Desoxirribonucleótido

• Bases Nitrogenadas: Bases Púricas
Adenina Guanina

• Bases Nitrogenadas: Bases Pirimídicas
Timina Citosina

• Azúcar (Pentosa)
β – D - desoxirribofuranosa

• Grupo fosfato
O
O
O OP

•Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)
Base Nucleósido
(Base+Pentosa)
Nucleótido
(Nucleósido+Fosfato)
Abreviatura
Guanina Desoxiguanosina Desoxiguanosina monofosfato dGMP
Adenina Desoxiadenina Desoxiadenina monofosfato dAMP
Citosina Desoxicitidina Desoxicitidina monofosfato dCMP
Timina Desoxitimidina Desoxitimidina monofosfato dTMP

•Nomenclatura de nucleósidos y nucleótidos (presentes en el DNA)
Por consenso general el Nucleótido adquiere el nombre
de la base nitrogenada que le dio origen

•Modelo de la Doble Hélice de Watson y Crick
Watson y yo hemos
encontrado el
secreto de la vida

•El modelo de la doble hélice de Watson y Crick
 Los polímeros de
DNA están
constituidos por dos
cadenas de
nucleótidos unidos
en forma lineal por
enlaces fosfodiester
los cuales corren en
direcciones
opuestas
(antiparalelas).

 Cada nucleótido se encuentra en un plano perpendicular al de la cadena
polinucleotídica.

 La composición de bases de DNA sigue las reglas de Chargaff (Cantidad
de Purinas = Cantidad de Pirimidinas).
A G C T
Homo sapiens 0.29 0.18 0.18 0.31
Bos taurus 0.26 0.24 0.23 0.27
Sacharomyces cerevisiae 0.30 0.18 0.15 0.29
Mycobacterium sp 0.12 0.28 0.26 0.11
•Composición de las bases nucleotídicas en el DNA de algunas especies

•Reglas de Chargaff
1. La relación purinas/pirimidinas es igual a 1
Es decir, A+G = C+T
2. En todos los DNA estudiados, la proporción molar de A es igual a la
de T, y la de G igual a la de C.
Es decir, A = T y G = C

 Las fotografías del análisis de
difracción de rayos X de la sal
de DNA con alto contenido de
agua indican que la molécula
tiene una estructura helicoidal
doble (las cadenas giran
alrededor de una línea central
imaginaria)

 Las dos cadenas se encuentran apareadas por uniones de
hidrógeno establecidas entre los pares de bases

Propiedades de los enlaces tipo puente de hidrógeno
 Son económicos (energéticamente hablando).
 Son lo suficientemente fuertes para mantener la estructura de la doble
hélice pero lo suficientemente débiles para romperse determinados
momentos (replicación).
 Confieren un estado dinámico de la estructura (horquillas)
 Son altamente direccionales, discriminan entre las distintas pares de
bases.

Los puentes de hidrógeno son
altamente direccionales.

Guanina Citosina
Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno

Adenina Timina
Configuración tridimensional de los enlaces puente de hidrógeno

•Fuerzas que determinan la conformación polinucleotídica
 Los polinucleótidos tienden a formar hélices, lo que les
permite conciliar las fuerzas de interacción
moleculares, distribuyéndolas a intervalos regulares.
 Las Interacciones hidrófobas entre los anillos de las bases
y fuerzas de Van Der Walls (Resultado de la diferencia
entre interacciones dipolo y las fuerzas de dispersión de
London) producen una conformación apilada (Staking).

Las repulsiones entre los grupos fosfato cargados
negativamente producen cierta rigidez en la estructura las
cuales, en condiciones fisiológicas, se ven estabilizadas
por la cantidad de cationes (Mg2+) presentes en la
solución.

 Puede formar enlaces que conectan dos moléculas.
 Dichos enlaces (llamados enlaces fosfodiéster) son sumamente estables
aunque pueden ser rotos facilmente mediante hidrólisis enzimática
(Principio de conservación).
 La carga negativa (debido a un Oxígeno ionizado) protege frente a
ataques nucleofílicos.
 La ionización negativa total mantiene a los nucleótidos y al mismo DNA
dentro de las membranas biológicas.
¿Por qué fosfatos?

 La formación de puentes de hidrógeno cooperativos
altamente direccionales asegura una estabilidad relativa
además de un estado dinámico.

•Variaciones conformacionales del DNA
 Se producen por cambios en los grupos pentosa-fosfato
de la cadena polinucleotídica.
 Variación entre la conformación anti y syn del ángulo de
enlace entre las bases nitrogenadas y la pentosa.
 Inclinación, giro o giro en hélice de los bares de bases de
los nucleótidos.

Variación en la inclinación y giro de las bases nitrogenadas

DNA tipo A
•Doble hélice plectonémica y
dextrógira
•Planos de bases oblicuos
respecto al eje de la doble
hélica
•Propio de RNAs en doble
hélice, o de híbridos DNA-RNA
•Más ancha y corta que DNA-B

DNA tipo Z
•Doble hélice plectonémica y
levógira
•Zonas de secuencia alternante -
GCGC-
•Conformación de G es syn- en
lugar de anti-
•Más estrecha y larga que DNA-B

A B Z
Grosor 2.6 2.4 1.8
Giro Dextro Dextro Levo
Bases/vuelta 11 10.4 12
P.de rosca 2.5 3.4 4.5
Inclinación del plano 19º 1º 9º
de las bases
Cuadro Resumen de las Características de los
distintos tipos conformacionales

•Desnaturalización del DNA
 Se llama así al proceso de transición entre la forma de
doble hélice apilada y el ovillo estadístico.

 Se puede lograr provocando cambios en la
temperatura, pH o agregando sustancias
desnaturalizantes.
Tº
Rotura de los enlaces
puente de hidrógeno
pH
Cambio en la
ionización de los
componentes
Agentes DN
Bloqueo de los
enlaces puente de
hidrógeno

Efecto hipercrómico de la
Desnaturalización del DNA

•Renaturalización del DNA
 Se produce mediante la llamada autoasociación por
complementariedad.
 Es dependiente de la concentración.
 Se favorece por la presencia de secuencias repetitivas
frecuentes.
 Inversamente proporcional a la complejidad del genoma.

•Hibridación del DNA
 Se basa en la capacidad de autoasociación por
complementariedad.
 Es necesaria una relación elevada de
complementariedad.
 Es dependiente de la concentración.

 Útil para los siguientes propósitos:
1. Determinación de si una cierta secuencia de DNA se
presenta más de una vez en un determinado genoma.
2. Demostración de la existencia de relación genética o
evolutiva entre organismos presentes.
3. Determinación del número de genes transcritos en un
mRNA particular.
4. Determinación de la localización de una secuencia de DNA
(Sonda).

Hibridación del DNA

1. Se desnaturaliza el DNA a hibridar
2. Se inmovilizan las monohebras resultantes mediante fijación a un
polímero adecuado.
3. Dichas monohebras se montan en una columna cromatográfica.
4. Se hace pasar monohebras de DNA marcado radioactivamente (Timina
tritiada).
Procedimiento
*La velocidad de reasociación es proporcional a la que la radioactividad queda retenida
en la columna cromatográfica.

Factores que afectan la estabilidad del híbrido
a) Número de pares GC v/s pares AT
A mayor número de puentes de hidrógeno,
mayor estabilidad
• 3 puentes de H entre G y C
• 2 puentes de H entre A y T

b) Grado de complementariedad
Menor complementariedad de bases
Menos enlaces de H formados
Menor estabilidad

c) Largo de las hebras
– Mayor largo de las hebras (cDNAs) >200pb
 más enlaces de H
 mayor estabilidad del híbrido.
– Menor largo de las hebras (oligos) <50pb
 Mayor especificidad
 Menor probalidad de hibridación cruzada

d) Concentración de sal en la solución
•Cationes monovalentes (Na+) o divalentes (Mg++)
•Las cargas negativas de los grupos fosfato se repelen
unas a otras.
•Los iones positivos en solución reducen la repulsión
electrostática entre las hebras.

e) Temperatura
•Mayor Tº aumenta la energía cinética de las hebras y
desestabiliza la estructura de los ácidos nucleicos.
las hebras se separan.

•Uso de Sondas de DNA
 Las sondas de ácido nucleico son poderosas
 herramientas aportadas por la biotecnología que se
emplean
 tanto en la investigación básica como en el campo
diagnóstico.
 La posibilidad de utilizarlas con el fin de detectar diversos
 agentes patógenos, sea en el ser humano, en plantas o
animales, ya ha tenido importantes repercusiones
económicas.

Sondas de DNA

Se pueden clasificar las sondas en :
• "calientes" cuando se utiliza productos radiactivos
• "frías” cuando no se utilizan productos radioactivos

Autorradiografía
* Isotopos Radioactivos tanto de emisión alfa como beta:
tritio, fósforo-32, azufre-35 o iodo-125
ADN
Isotopo radioactivo
Sondas “calientes”

Sondas “frías”
1. Enzimas (peroxidasa o fosfatasa que llevan a cabo
una reacción detectable )
2. Marcadores de afinidad (biotina o digoxigenina, que
se van a unir posteriormente a otra molécula)
3. Moléculas Quimioluminiscentes Y Fluorescentes
(que producen luz y puede excitar una película
fotográfica).

Sondas “frías”

Souther Blot

•Southren blot

FISH

•Citogenética moderna: FISH

Tipos de Estructuras
del DNA

•Tipos de estructuras del DNA
 Los rasgos estructurales varían según el origen y función
del DNA.
 Los DNA difieren en:
• Tamaño
• Conformación
• Topología

•Diferencias en Tamaño
•El tamaño de un DNA puede ser expresado en:
Número de pares de bases
Peso molecular
Longitud de las hebras
Masa real del DNA

Virus
Miles de pares de bases
Bacterias
Millones de pares de bases
Animales
Miles de Millones de pares
de bases

•El tamaño del DNA tiende a aumentar con la complejidad
de la función celular.
•El tamaño del DNA no siempre refleja mayor complejidad
celular.
El aumento de secuencias repetitivas aumenta el tamaño
pero no la complejidad del genoma.

•Formas de determinar el Tamaño de un DNA
•Centrifugación en equilibrio
•Microscopía electrónica
•Electroforesis en gel

Gradiente
dedensidad
•Centrifugación en equilibrio
•La anchura de las bandas en equilibrio es proporcional a
la masa molecular
DNA
Centrifugación
Formación de bandas
en el lugar de
equilibrio entre la
densidad del DNA y el
medio externo

•Microscopía electrónica
•Se mide el largo de la hebra
•El tamaño se obtiene usando patrones conocidos de
masa por unidad.
+ + =
DNA visible al
microscopio
Cubierta de proteína Película de metal

Conformaciones
del DNA

Continuará…

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