El documento describe un protocolo para la extracción y purificación de ADN de tejidos vegetales. Explica que el método implica la lisis celular mediante agentes mecánicos y químicos como el CTAB al 2%, el cual rompe la membrana celular y nuclear. Luego, el ADN se purifica usando cloroformo y se precipita con isopropanol frío para su purificación. El protocolo completo implica etapas como la maceración del tejido, extracción con CTAB, adición de cloroformo y centrifugación, transferencia

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INTRODUCCION
Los ácidos desoxiribonucleico (ADN) y ribonucleico (ARN) son polímeros de nucleótidos
formados por un azúcar de cinco carbones (desoxiribosa en el ADN y ribosa en el ARN), una
base nitrogenada (que puede ser adenina, timina, citosina, guanina o uracilo) y una molécula
de fosfato.
La expresión de los genes es la base del metabolismo celular, y por ésta se entiende que el
ADN se transcribe en ARN, que a su vez se traduce en proteínas. Esta secuencia ADNARN-proteínas constituye el dogma central de la biología molecular.
Los estudios contemporáneos de ecología molecular se han esforzado en entender las
funciones metabólicas de los diferentes componentes biológicos presentes en el ambiente y
en conocer la diversidad biológica mediante el uso y aplicación de técnicas moleculares
basadas en la amplificación de diversas regiones del ADN y ARN. La detección de la
expresión de los genes o la presencia de mARN específicos nos permitirá acercarnos a
temas como el impacto de los diferentes componentes físicos y biológicos del ambiente en la
expresión del ADN (ya que la simple presencia de ADN no nos indica la actividad de los
genes), así como a la regulación metabólica de las enzimas que son esenciales en el papel
ecológico que juegan los organismos dentro de su ecosistema (ciclos biogeoquímicos,
bioremediación, reciclaje de nutrientes), entre otros.
En la extracción de los ácidos nucleicos, existen diferentes métodos que permiten su
obtención partiendo de diferentes fuentes por ejemplo; plantas plásmidios, gtas de sangre,
cabellos, células bacterianas, o eucariotas, etc. El método de extracción para la purificación
de ADN depende de la aplicación del anterior.
En esta práctica utilizaremos como muestra diferentes tejidos vegetales. El procedimiento se
fundamenta en lisis celular por medios mecánicos y químicos, liberación del acido nucleíco
con CTAB al 2% el cual rompe la membrana celular y nuclear purificando posteriormente el
ADN con cloro formo luego el ADN es precipitado con Isopropanol frio para su purificación.

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MARCO TEORICO
EXTRACCION DE ACIDOS NUCLEICOS
La extracción y purificación de ácidos nucleicos constituye la primara etapa de la mayoría de
los estudios de biología molecular y de todas las técnicas de recombinación de ADN. En
este caso, los métodos de extracción permiten obtener ácidos nucleicos los ácidos nucleicos
purificados a partir de diversas fuentes para después realizar análisis específicos de
modificaciones genéticas mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Dada la gran variedad de métodos de extracción y purificación de ácidos nucleicos
existentes, la elección de la técnica más adecuada suele efectuarse conforme a los criterios
siguientes:
ácido nucleico diana;
organismo fuente;
material inicial (tejido, hoja, semilla, material transformado, etc.);
resultados deseados (rendimiento, pureza, tiempo que requiere la purificación);
uso posterior (PCR, clonación, etiquetado, transferencia, RT-PCR, síntesis de ADNc, etc)
Métodos de extracción
Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular,
inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restosde células. El
procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser
suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero
suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana.
.
Métodos de purificación
Los métodos empleados para purificar los ácidos nucleicos de extractos celulares suelen ser
combinaciones de dos o más técnicas de las siguientes:
extracción/precipitación;
cromatografía;
centrifugación;
separación por afinidad.
Extracción/precipitación

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A menudo se efectúa una extracción con disolventes para eliminar los contaminantes de los
ácidos nucleicos. Por ejemplo, suele emplearse unacombinación de fenol y cloroformo con
objeto de eliminar las proteínas. Para concentrar los ácidos nucleicos suele realizarse una
precipitación con isopropanol o etanol. Si la cantidad de ácido nucleico diana es escasa,
puede añadirse a la mezcla un portador inerte (como el glucógeno) para favorecer la
precipitación. También puede realizarse una precipitación selectiva con concentraciones
salinas elevadas (precipitación salina) o una precipitación de proteínas mediante cambio de
pH.
Cromatografía
Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación sobre gel,
intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La permeación sobre gel
aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel para tamizar moléculas. Se
emplea una matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas más
pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan eluidas en el volumen vacío.
Así pues, las moléculas quedan eluidas por orden de tamaño decreciente. La cromatográfica
de intercambio iónico es otra técnica, que se basa en la interacción electrostática de la
molécula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos
(polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden e luirse de las columnas de
intercambio iónico con simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los
ácidos nucleicosse fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas
sales (por ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se fijan. A
continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y se
obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores.
Centrifugación
La centrifugación selectiva constituye un método de purificación eficaz. Así, por ejemplo, la
ultracentrifugación en gradientes autogenerados de CsCl con fuerzas g elevadas se lleva
empleando mucho tiempo para purificar plásmidos. La centrifugación suele asociarse a otros
métodos, como la cromatografía de columna centrifugada, en cuyo caso se combina la
permeación sobre gel y la centrifugación para separar el ADN o ARN de contaminantes más
pequeños (sales, nucleótidos, etc.), intercambiar tampones o seleccionar según el tamaño.
Algunos procedimientos combinan la adsorción selectiva en matriz
Separación por afinidad
En los últimos años, cada vez son más los métodos de purificación que combinan la
inmovilización por afinidad de ácidos nucleicos y la separación magnética.
Por ejemplo, los ARNm poli A + pueden unirse a partículas magnéticas revestidas
deestreptavidina mediante oligo dT marcados con biotina, y el complejo de partículas puede
eliminarse de la solución (y de los contaminantes libres) con un imán. Esta técnica en fase
sólida simplifica la purificación de los ácidos nucleicos, pues permite sustituir las etapas de

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centrifugación, extracción orgánica y separación de fases por una operación de separación
magnética, única y rápida.
.
Método de extracción y purificación con CTAB
El protocolo del método del bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB) fue elaborado por
Murray y Thompson en 1980 (Murray y Thompson, 1980) y publicado posteriormente, en
1987, por Wagner y sus colaboradores (Wagner et al., 1987). El método es adecuado para
extraer y purificar ADN de vegetales y alimentos derivados de vegetales y está
especialmente indicado para eliminar los polisacáridosy los compuestos polifenólicos, que,
de otro modo, alterarían la pureza del ADN y, por tanto, su calidad. Este procedimiento se ha
aplicado con frecuencia en genética molecular de los vegetales y ha sido probado en
ensayos de validación para detectar OGM. Se han elaborado algunas variantes adicionales
para adaptar el método a una amplia gama de matrices de alimentos transformados o sin
transformar.
Principios del método del CTAB: lisis, extracción y precipitación
Las células vegetales pueden lisarse con el detergente iónico bromuro de cetiltrimetilamonio
(CTAB), que forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos en medio hiposalino. De
ese modo, los polisacáridos, los compuestos fenólicos y los demás contaminantes
permanecen en el sobrenadante y pueden eliminarse por lavado. El complejo de ADN se
solubiliza aumentando la concentración salina y se precipita con etanol o isopropanol.

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PROCEDIMIENTOS
1) Pesar 600 mg de tejido foliar, adicionar el tejido foliar a un microtubo de 1.5 ml y
triturar el tejido foliar con un micropistilo.
2) Macerar con 1 ml de CTAB 2% e incubar a 64 °C en un plato caliente durante 40
minutos.

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3) Agregar 500 µl de cloroformo: octanol (24:1), mezclar suavemente (hasta que se
observe un color blanco).
4) Colocar el microtubo en una microcentrifuga y centrifugar por 15 minutos a 10,000
RPM.

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5) Extraer la fase acuosa (400-500 µl) y transferirla a un microtubo nuevo.
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6) Agregar 600 – 800 µl etanol absoluto o isopropanol y frio (punto de congelacion)
mezclándose suavemente hasta observar la precipitación del acido nucleico.
7) Centrifugar 14,000 RPM durante 10 minutos. Descartar el sobrenadente con el
cuidado de no descartar el pellet formado.

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8) Agregar 450 µl de alcohol 70% para lavar el pellet, descartar el etanol y dejar secar el
pellet a temeratur 60°C en un plato caliente.
9) Agregar de 60 a120 µl de agua destilada dependiendo del tamaño del pellet y
resuspender. Finalmente Almacenar a -20 °C

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DATOS
Investigue los siguientes términos:
EDTA
ácido etilen diamino tetra acético es una sustancia utilizada como agente quelante que
puede
crear
complejos
con
un metal que
tenga
una
estructura
de
coordinación octaédrica. Coordina metales pesados de forma reversible por cuatro
posiciones acetato y dos amino, lo que lo convierte en un ligando hexadentado, y el más
importante de los ligandos quelatos.
CTAB
El Bromuro
de
hexadecil
trimeti
lamonio o Bromuro
de
cetil
trimetil
amonio (C16H33)N(CH3)3Br) es una sal de amoniocuaternario, uno de cuyos grupos
alquilo es de gran longitud, con actividad detergente. Se le conoce también por las
siglas CTAB, del inglés Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide.
Es

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un surfactante catiónico. Sus usos incluyen la utilización como solución tamponante
para
la
extracción
de ADN.
Y
es
uno
de
los
compuestos
del antiséptico tópico Cetrimide. El catióncetiltrimetilamonio es un agente antiséptico
efectivo contrabacterias y hongos.
CLON
un clon (griego ‘retoño’) es un conjunto de individuos genéticamente idénticos que
descienden de un mismo individuo por mecanismos de reproducción asexual.
ENZIMA
Las enzimas son moléculas de naturaleza proteica y estructural quecatalizan reacciones
químicas, siempre que sean termodinámicamente posibles: una enzima hace que una
reacción química que es energéticamente posible pero que transcurre a una velocidad muy
baja, sea cinéticamente favorable, es decir, transcurra a mayor velocidad que sin la
presencia de la enzima. En estas reacciones, las enzimas actúan sobre
unas moléculas denominadas sustratos, las cuales se convierten en moléculas diferentes
denominadas productos. Casi todos los procesos en las células necesitan enzimas para que
ocurran a unas tasas significativas. A las reacciones mediadas por enzimas se las
denomina reacciones enzimáticas.
GEN
Un gen es una secuencia ordenada de nucleótidos en la molécula de ADN (o ARN, en el
caso de algunos virus) que contiene la información necesaria para la síntesis de una
macromolécula con función celular específica, habitualmente proteínas pero también ARNm,
ARNr y ARNt.
PLASMIDO
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómico circular o lineal que se replican y
transcriben independientes del ADN cromosómico. Están presentes normalmente
en bacterias, y en algunas ocasiones en organismos eucariotas como las levaduras. Su
tamaño varía desde 1 a 250kb. El número de plásmidos puede variar, dependiendo de su
tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos por célula.

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VECTOR
Un vector génico es un agente que transfiere información genética, por algún medio, de un
organismo a otro. Son utilizados enbiotecnología un Vector de clonación para portar el ADN
recombinante desde una célula donadora hasta la célula receptora en los que se inserta el
gen que se quiere transferir. A continuación se infecta la célula hospedadora con ese vector
recombinante, obteniéndose la célula transgénica.
Investigue y resuma un protocolo de extracción de ADN de tipo
casero para tejidos animales y tejidos vegetales.
PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN PARA TEJIDOS VEGETALES
EXtracción de ADN de robles colombianos Dellaporta , el cual ha dado buenos resultados en
los trabajos con plantas adelantados en el laboratorio de Biología Molecular dela Universidad
Nacional sede Palmira . Uno de los problemas al trabajar con plantas es la composición de
la pared celular, la cual dificulta el acceso al interior para la extracción de todo su contenido,
incluyendo el ADN. Dicha pared se debe romper por acción mecánica, pulverizando el tejido
con hielo seco o con nitrógeno líquido. En seguida, se deben destruir las membranas
celulares de manera que el ADN, acompañado de otros compuestos (proteínas, enzimas,
carbohidratos), quede disponible. La mezcla de tejido así obtenida se agrega a una solución
buffer o tampón de extracción, en presencia de agentes quelantes, de soluciones de baja o
alta fuerza iónica (para que sea soluble el ADN) y de altas concentraciones de NaCl. Los
agentes quelantes (como el EDTA) se emplean para proteger el ADN de la acción de
enzimas nucleasas; ellos capturan los iones magnesio y no permiten que actúen como
cofactores de las nucleasas. Las altas concentraciones (5 M) de NaCl seemplean para
prevenir la contaminación de la muestra con polisacáridos que afectan la pureza del ADN,
pudiendo inhibir la actividad de algunas enzimas como polimerasas, ligasas y
endonucleasas de restricción; la base para la separación de los polisacáridos de los ácidos
nucleicos, es su solubilidad diferencial en presencia de las altas concentraciones de NaCl los
polisacáridos precipitan bajo la acción de fuerzas centrifugas. A la mezcla anterior se agrega
un detergente aniónico como el SDS (sodio dedecil sulfato), que solubiliza proteínas, tejidos
y membranas, evitando que una cantidad significativa de ADN quede atrapada en los
desechos o restos celulares. Para prevenir que el ADN extraído presente coloración gris o
parda, la cual se debe a la actividad de polifenoloxidadas presentes en algunos tejidos, se
incluye en el buffer de extracción P.V.P (polivinil pirrolidona)(6). Para separar las proteínas,
se lleva la mezcla de tejido con el tampón a incubación a 65ºC con lo cual se desnaturalizan
las proteínas. Para retirar las proteínas denaturadas y la mayoría de los polisacáridos, se

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agrega una sal como el acetato de potasio frío. Por centrifugación se separan tejidos,
membranas, polisacáridos y proteínas de los ácidos nucleicos, los cuales quedan en el
sobrenadante. Finalmente hay que separar el ADN de la fase acuosa, para lo cual se debe
precipitar el mismo, usando un alcohol como el isopropanol, el cual es selectivo en la
precipitación del ADN en presencia de ARN. Después de precipitado el ADN se disuelve en
una solución tampón (TE de pH 8.0) o en agua bidestilada. El ARN se remueve adicionando
enzima RNAasa a la solución.
PROTOCOLO DE EXTRACCION DE ADN PARA TEJIDOS ANIMALES
Protocolo de extracción de ADN de
de ADN de
miniprep: Una miniprep es una extracción
naturaleza plasmídica de
un cultivo
bacteriano
El método más común para ello es romper las células de dicho cultivo mediante un choque
alcalino de modo que sólo permee selectivamente su ADN plasmídico. Para ello, se toma un
volumen de 2-5 mL de un cultivo crecido en medio líquido y se centrifuga, aislando así las
células de aquél. Después, se resuspende dicho pellet y se expone dicha suspensión a una
disolución que contiene NaOH y dodecilsulfato de sodio (SDS), la cual solubiliza en parte
lamembrana externa de las bacterias Gram negativas, lo que produce la liberación del
contenido celular de éstas: ADN genómico y plasmídico desnaturalizados, ARN, proteínas...
Tras esto, se añade a la mezcla acetato potásico, acídico, lo cual neutraliza todo
el debriscelular y provoca la rápida renaturalización del ADN plasmídico, que queda en
suspensión, mientras que el genómico y el resto de componentes celulares se reticulan y
precipitan ayudados por la alta concentración de sales, especialmente del recién
generado dodecil sulfato de potasio. Finalmente, se centrifuga nuevamente la mezcla para
aislar elsobrenadante, rico en el ADN plasmídico y en ARN, el cual deberá ser eliminado
mediante una ribonucleasa.La miniprep es la técnica inicial de purificación y concentración
de ADN plasmídico para cualquiera de sus posibles fines, entre los que destaca la clonación
Existen muchos protocolos de la extracción del ADN, ¿De que
depende la selección de un protocolo en particular?
La aplicación de las diferentes técnicas empleadas en biología molecular para el análisis del
genoma, depende en gran medida de la habilidad para extraer el ADN. Para lo cual se
utilizan diversos métodos de extracción, dependiendo del tipo de tejido a emplear.
¿Qué aplicaciones tiene la extracción de ADN?

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Para aislar el ADN hay que hacer que precite en alcohol. El ADN es soluble en agua pero
cuando se encuentra en alcohol se desarrolla y precipita en la interfase entre el alcohol y el
agua.ademas de pemitirnos ver el ADN,el alcohol separa del ADN e otros componentes
celulares, los cuales son dejaos en la solucion acuosa. esto es la continuacion si hoy no
dormimos.
¿Cómo se almacena el ADN e células procariotas y eucariotas?
CÉLULA PROCARIOTA:
-Su núcleo es primitivo, pues carece de membrana nuclear. La información genética se
almacena en moléculas de ADN que tienen forma circular (no en doble hélice como en las
eucariotas). Dichas moléculas se ubican, en algunas bacterias, en la llamada zona nuclear.En lugar de tener organelos, como cloroplastos y mitocondrias, encargados de las funciones
energéticas, presentan los llamados cuerpos membranosos, que se forman de
invaginaciones de la membrana plasmática; y cumplen funciones de respiración y
fotosíntesis.-La transmisión del material genético no se cumple por mitosis, sino mediante
división directa. No se forma entonces el aparato miótico.-La pared celular tiene estructura y
composición química particulares. En ellas predominan un glucopíptedo llamado mureína.-El
volumen de las células procariotas es menor pues oscila entre 1 y 2 micrómetros. Las
células eucariotas presentan tamaño mayor: de 10 a 100 micrómetros.-La división celular en
procariotas es por fisión binaria gemación, no hay mitosis. En eucariotas sí hay diversas
formas asociadas con mitosis.-Sistema sexual, cuando está presente en procariotas, hay
transferencia unidireccional de genes desde el dador al receptor. En las eucariotas hay
fusión nuclear completa de genomas gaméticos equivalentes, asociados con la meiosis.Organelos de movimiento: en procariotas son flagelos simples; en eucariotas cilias o flagelos
complejos, cuando están presentes.
CELULAS EUCARIOTAS:
Tienen su núcleo definido, en éste, la célula guarda su información genética. Una célula
eucariota tiene citoplasma y organelos celulares. Realizan un metabolismo aerobio (Con
ayuda de oxigeno).- Algunos eucariontes realizan la fotosíntesis, gracias a la presencia en
su citoplasma de orgánulos llamados plastos, los cuales derivan por endosimbiosis de
bacterias del grupo denominado cianobacterias (algas azules).- Se puede distinguir tres
partes fundamentales: membrana celular, citoplasma y núcleo- El material genético está
incluido en un núcleo verdadero el cual se encuentra rodeado por una envoltura
membranosa compleja: la envoltura nuclear - Su citoplasma contiene una variedad de
organelo membranosos y no membranosos especializados para realizar distintas funcionesLas células eucariotas constituyen todos los organismos eucariotas que incluyen :
hongos, protozoarios plantas y animales.

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DISCUSIÓN
Para extraer ADN de un tejido vegetal nuestro primer paso será pesar aproximadamente
600 mg del tejido foliar y depositarlo en un microtubo seguidamente trituramos el tejido con
la ayuda de un micropistilo. Macerar el tejido con 1 ml de CTAB para la liberación de acidos
nucleicos mediante la ruptura de la membrana celular y nuclear, e incubamos a 64 °C
durante 40 minutos. Agregamos 500 µl de cloroformo que este purifica el ADN liberandolo de
restos proteínas y otros contaminantes presente y lo mezclamos suavemente hasta obtener
un color blanco, colocamos el microtubo con el tejido foliar en la microcentrifuga por 15
minutos a 10,000 rpm, al retirarlo de microcentrifuga observaremos una fase acuosa y otra
mas densa, extraemos la fase acuosa y la transferimos a un tubo nuevo, le agregamos de
600 a 800 µl de alcohol absoluto o isopropanol frio para precepitar el ADN y purificarlo, lo
mezclamos suavemente hasta observar la precipitación del acido nucleico. Nuevamente
colocamos el microtubo por 10 minutos en la microcentrifuga a 14,000 rpm, al retirarlo de la
microcentrifuga descartamos el sobrenadente con el cuidado de no descartar el pellet
formado, agregamos 400 µl de etanol al 70% para lavar el pellet, descartamos el etanol y
dejamos secar el pellet a una temperatura de 60 °C, agregamos de 60 a 120 µl de agua
destilada y resuspender. Finalmente almacenamos a -20°C.
CONCLUSIONES
1. Al final de la practica describimos el fundamento de la técnica de
extracción de acido nucleico.
2. Identificamos un método de extracción de ácidos nucleicos
eucariotas.
3. Conocimos la función de cada uno de los reactivos utilizados.

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