2. Conceptos
Algunos de los productos biotecnológicos son
extracelulares y no requieren ser extraídos de la
célula
Si el producto es intracelular, una vez realizada la
separación gruesa de las células, una operación
necesaria para la liberación del producto es el
rompimiento de la misma
3. Cuerpos de Inclusión
Algunas proteínas eucarióticas recombinantes
producidas por microorganismos no son
secretadas por la célula recombinante y
constituyen productos intracelulares, los cuales
pueden estar en forma activa o desnaturalizada.
Las proteínas intracelulares desnaturalizadas con
frecuencia forman cuerpos de inclusión
insolubles.
4. Fundamentos
Estructura de la pared celular
Sistemas celulares de secreción
Métodos de rompimiento celular
Métodos de permeabilización celular
8. Sistemas Celulares de Secreción
Se llama secreción al movimiento de un
soluto a través de la membrana celular
al exterior de la célula. También se
considera como secreción cuando,
como en el caso de algunas proteínas,
estás quedan atrapadas en el espacio
periplásmico o entre la membrana y la
pared celular.
9. Métodos de Rompimiento Celular
Método Técnica Principio Ejemplos
Químico Choque
Osmótico
Ruptura
Osmótica de
membrana
Ruptura de
Globulos
Rojos
Disolución
Lípidica
Desestabilizació
n de la pared
celular por
solventes
orgánicos
Rompimiento
de Levaduras
por tolueno
Digestión
enzimática
Digestión de la
pared celular
Tratamiento
Alcalino
Solubilización
de membranas
por
saponificación
10. Métodos de Rompimiento Celular
Método Técnica Principio Ejemplos
Mecánico
s
Molido en
molinos de
perlas
Las células
son
prensadas
entre perlas
de vidrio
Tratamiento
de
suspensione
s celulares a
gran escala
Homogeneizaci
ón
Las células
se rompen
por fuerzas
de corte al
pasar por un
orificio
pequeño
Tratamiento
de
suspensione
s celulares a
gran escala
12. Choque Osmótico
Las células son primero equilibradas en un
medio de alta presión osmótica (e.g. 1M
sacarosa), luego son rápidamente diluida.
El agua entra rápidamente a la célula,
incrementando la presión osmótica causando
lisis.
Técnica restringida a células debilitadas.
Choque osmótico suave permite liberar
proteínas en E. coli sin afectar la viabilidad
celular.
Puede ser utilizada para liberar proteínas
13. Digestión Enzimática
Lisis utilizando Fagos; la adición del bacteriofago
T4 causa lisis, sin embargo no es muy
recomendable a escala industrial ya que los
fagos residuales pueden llevar a una lisis
prematura en lotes subsecuentes.
Lisozimas.
Alto costo de las enzimas.
Inmovilización celular.
17. Disolución Lipídica
(extracción por solventes)
Los solventes no polares permeabilizan
las células permitiendo la liberación de
proteinas.
Los solventes actúan disolviendo
componentes hidrofóbicos en la pared,
como lo son los fosfolipidos en bacterias
gram-negativas.
Uso limitado debido a que pueden
inhibir las actividades biológicas.
22. Velocidad del agitador
La velocidad periférica normalizada de los anillos
se utiliza para comparar molinos diferentes.
Para impulsores montados excéntricamente:
con
Donde:
Dm = Diámetro promedio de los anillos excéntricos
(mm). Para el caso de impulsores concéntricos se
utiliza directamente el diámetro del impulsor
e = Diámetro de la flecha del agitador (mm)
d = Diámetro de los anillos del agitador (mm)
n = Velocidad angular del agitador (rpm)
23.
24. Operación Intermitente Molino
Perlas
El rompimiento celular intermitente en molinos de
perlas agitados a altas velocidades sigue una
cinética de primer orden.
La ecuación para la operación intermitente es:
Donde:
Rm = concentración máxima de proteína obtenible
(M/L3)
R = concentración de proteína liberada en el tiempo
(M/L3)
t = tiempo de operación (tiempo de residencia de las
células en el molino
k = Constante de velocidad específica de primer orden,
depende de tipo de célula, tipo y velocidad del agitador,
25. Liberación de proteína a partir de S. cerevisae en
un molino de perlas utilizando diferentes
agitadores
26. Cinética de rompimiento intermitente
En el rompimiento intermitente para la obtención
de una enzima de S. cerevisae, se utilizó un
molino de perlas de alta velocidad de 4 litros
obteniéndose los siguientes datos:
tiempo (s) R x 102 (Kg/Kg)
0 0
15 1.025
30 2.150
45 2.525
60 3.425
Máx 10
27. tiempo (s) A x 102 (mol/min-
Kg)
0 0
15 0.625
30 1.150
45 1.675
60 2.150
Máx 6.700
28. Tarea
Tiempo
de
Residenci
a (min)
Ln (Rm/Rm-R)
3 0.037
5 0.090
10 0.160
15 0.225
20 0.300
25 0.365
30 0.437
Tiempo
de
Residenci
a (min)
Ln (Rm/Rm-R)
3 0.060
5 0.150
10 0.225
15 0.325
20 0.425
25 0.525
30 0.650
La desintegración celular intermitente con dos tipos
de agitación utilizados en un molino de perlas
producen los siguientes datos:Agitador 1 Agitador 2
Estimar la cociente cinética (k) para cada tipo de agitador
Calcule el tiempo para el cual se obtiene el 80% de rompimiento con cada
tipo de agitador
29. Métodos directos de medición de
rompimiento celular
Rompimiento promedio (L)
Donde:
C0 = Conteo de células intactas al inicio
C = Conteo de células intactas
31. Bibliografía
Tejeda-Mansir, A., Montesinos-Cisneros, R.M. y
Guzmán, R. 1995. Bioseparaciones. UniSon,
México
Panda A.K., Bioprocessing of Therapeutics
Proteins from the Inclusion Bodies of Escherichia
Coli, Adv Biochem Engin/Biotechnol (2003) 85:
43–93
Notas del editor
La formación de cuerpos de inclusión es principalmente atribuida a la sobreexpresión de proteínas recombinantes en una célula que carece de los accesorios para su plegamiento en la forma nativa.
Los cuerpo de inclusión son partículas densas de proteínas agregadas encontradas en los espacios plásmicos y periplásmicos de las celulas como E. coli
Entre las estrategias para la recuperación de proteína bioactiva involucra el aislamiento y purificación de los cuerpos de inclusión, solubilización de los agregados de proteína, purificación y replegamiento de la proteína solubilizada.
Solubilización: con altas concentraciones (6-8 M) de agentes como la urea, guanidina hidrocloruro, sales tiocianato o detergentes como SDS
Agentes reductores como el DTT
Cambios de pH
Renaturalización: dialisis después de remover los agentes que sirvieron para la solubilización, agentes oxidantes
La recuperación óptima de productos intracelulares requiere del conocimiento de la estructura de las capas externas que protegen a las células: la membrana y la pared celular. Requiere además del conocimiento de los sistemas que permiten a ciertas células secretar los productos de interés en forma activa evitando con esto la necesidad de romper la célula para recuperar el producto.
Las paredes celulares de las bacterias gram-positivas y gram negativas tienen una característica común: un esqueleto de peptidoglucano o mureína.
En las células gram-positivas la capa de peptidoglucano es mucho más gruesa que en las células gram-negativas. En éstas la capa de peptidoglucano se encuentra localizada en el espacio periplásmico enlazandose covalentemente a las lipoproteínas de la capa exterior de la pared celular.
La estructura del peptidoglicano de la pared celular bacteriana es resistente a la acción de enzimas que hidrolizan péptidos, las cuales no atacan a los D-aminoácidos como los que se encuentran en la estructura de la pared.
La unidad básica que se repite en la estructura del peptidoglucano es la del disacárido constituido por N-acetil-D-glucosamina y el ácido N-acetilmuránico.
En las células gram positivas la enzima lisozima se utiliza para el rompimiento celular ya que su mecanismo de acción es el rompimiento de los enlaces glucosídicos del esqueleto polisacárido del peptidoglucano, que en este tipo de células se encuentran la parte externa. Una vez roto el esqueleto de esta manera, la célula se expande con la consecuente ruptura de la membrana y liberación del contenido celular.
La diferencia en el grosor de la capa de peptidoglucano y su ubicación, permite que las células Gram-positivas sean más sensibles a la acción de la lisozima que las gram negativas. Las paredes celulares de las bacterias gram negativas que presentan dificultad al rompimiento por la lisozima, pueden romperse en molinos de perlas de vidrio.
Cuando una membrana semipermeable separa dos soluciones de diferente concentración de soluto, se produce un movimiento neto de agua a través de la membrana hacia el compartimiento que contiene el soluto más concentrado. La presión osmótica es la fuerza que debe aplicarse para contrarrestar la fuerza de flujo osmótico producido.
La presión osmótica es una de las propiedades coligativas de las soluciones; depende del número de partículas de soluto por unidad de volumen pero es independiente de la naturaleza molecular del soluto y de la forma de sus partículas.
Los detergentes son moléculas anfipáticas que tienen una región hidrofílica, la cual es frecuentemente iónica, y una región hidrófoba, usualmente un hidrocarbono. Como tal, son capaces de interactuar tanto con el agua como los lípidos.
Los surfactantes se unen a la membrana lípidica hasta que la saturación es alcanzada en alguna proporción surfactante-lípido. La adición continua de surfactantes lleva a la formación de mezclas de micelas que contienen lípidos de la membrana. Esto continúa hasta que todo el lípido esta contenido dentro de las mezclas micelares.
La adición de surfactante más allá de este punto lleva a la formación de micelas de surfactante
La operación de rompimiento celular a nivel industrial actualmente se realiza en tres tipos de equipos
Los molinos de perlas de alta velocidad constan fundamentalmente de un cilindro en posición horizontal (o vertical) llamado cámara de molienda, un agitador que consiste de una flecha giratoria sobre la que se monta un sistema de discos, barras o anillos que provoca el movimiento del contenido del molino, y una gran cantidad de pequeñas perlas de vidrio que son los elementos activos de molienda.
El material celular se introduce por uno de los extremos de la cámara de molienda. El agitador produce el movimiento necesario de la masa celular y las perlas de vidrio. Los discos presentan perforaciones cubiertas con membranas que permiten el paso del material celular pero no así el de las perlas.
Los discos presentan perforaciones cubiertas con membranas que permiten el paso del material celular pero no así el de las perlas. Los discos o impulsores pueden montarse sobre la flecha ya sea en forma concéntrica o excéntrica
El resultado muestra claramente que la desintegración celular sigue una cinética de primer orden independiente del tipo de agitador. Observándose también diferentes valores de k para cada tipo de agitador.
Las gráficas de ln(Rm/(Rm-R)) vs t producirán rectas de pendiente k y ordenada al origen cero