Curso básico de citometria de flujo 2016 _IACS

1
CURSO BÁSICO DE
CITOMETRÍA DE FLUJO.
Javier Godino.
César Vallejo.
Desirée Perebom
Zaragoza 25-28 de abril de 2016
Servicio de separación celular y
citometría
FUNDAMENTOS.
citometría
• Que es la citometría de flujo.
• Componentes de un citómetro de flujo.
• Dispersión de la luz.
• Fluorescencia. Fluorocromos, Compensación de
fluorescencias.
• Ventajas e inconvenientes de la citometría de flujo
citometría

2
La citometría de flujo es una técnica que permite
medir simultáneamente múltiples características
ópticas (dispersión de luz y fluorescencia) de cada
una de las células o partículas presentes en una
suspensión.
¿Qué es la citometría de flujo?
citometría
• Suspensión de células individuales.
- Buffer + EDTA o DNAsa.
- Células en frío.
- Lisados tisulares: Disgregación enzimática + filtrado
• Comprobar que el método de disgregación o recolección
del cultivo no afecta a los parámetros que queremos
medir.
citometría
Parámetros medibles
• Directos.
- Tamaño y complejidad celular
• Indirectos. Se añaden a la suspensión celular reactivos con
propiedades ópticas determinadas: FLUOROCROMOS.
- Unión a componentes nucleares: ADN.
- Parámetros metabólicos: pH, concentración de Ca2+
- Unión a proteínas de membrana o intracelulares a través
de anticuerpos conjugados a fluorocromos
citometría

3
¿Que es un citómetro?
•Sistema que hace pasar células de una en una haciendo
incidir sobre ellas un láser.
• Mide dispersión frontal (FSC), dispersión lateral (SSC) y
emisión de fluorescencia.
Boquilla de
inyección
Señal fluorescenteSeñal fluorescente
DispersiónDispersión
Láser incidenteLáser incidente
focalizadofocalizado
DispersiónDispersión
citometría
Partes de un citómetro de flujo
• Sistema de Fluidos
– Crea un flujo constante de fluido envolvente
– Transporta la muestra al punto de interrogación
– Alinea las partículas de modo que pasen de una en una por
el punto de interrogación
• Óptica
– Focaliza el láser de excitación
– recoge y mide la luz emitida
• Electrónica
– Convierte la señal óptica en un pulso electrónico
– Envía la señal al procesador para ser analizado
• Software
– Muestra gráficamente los datos
– Controla la configuración del sistema
citometría
Sistema de fluidos del
FACSAria
Plenum
Cámara
Basura
Fluido
envolvente
Carro de fluidos
Presión
Tubo de
muestra
citometría

4
Enfoque hidrodinámico
Fluido envolvente
Muestra
Baja velocidad
de inyección
Envolvente
Muestra
Alta velocidad
de inyección
citometría
El flujo laminar permite mantener las células en el centro
del flujo y evita la formación de turbulencias.
citometría
Flujo laminarFlujo laminar
Flujo turbulentoFlujo turbulento
citometría

5
10 psi
10.2 psi
10 psi
10.4 psi
10 psi
10.8 psi
• La diferencia entre las presiones de la muestra y la del
líquido envolvente determina el diámetro del “capilar
virtual”
citometría
Intensidaddeluz
Velocidad de muestra bajaVelocidad de muestra baja
((difdif. presión bajo). presión bajo)
Velocidad de muestra altaVelocidad de muestra alta
((difdif. presión alto). presión alto)
Haz láser
Muestra
Líquido de arrastre
Máxima iluminaciónMáxima iluminación
CV bajosCV bajos
Iluminación variableIluminación variable
CV altosCV altos10
0
10
1
10
2
10
3
10
4
CD4 FITC
0
100
200
300
400
#Cells
Haz del láser
citometría
Citómetro sin enfoque
hidrodinámico
• Citómetro Guava de Merck-Millipore.
• Capilar de 100µ de diámetro
citometría

6
Óptica de excitación
• Excitación mediante
fuentes de luz coherentes.
Láseres
• Un sistema de prismas
dirige la luz hacia la
cámara de flujo.
• Enfoca el láser sobre el
flujo de células
citometría
Óptica de emisión
• Una vez que el láser incide la célula responde emitiendo luz
a varias longitudes de onda, en función de que fluorocromos
hayamos usado → Tenemos que separar la fluorescencia
asociada a cada característica celular: FILTROS
citometría
Óptica de emisión: Filtros
400nm400nm 500nm500nm 600nm600nm 700nm700nm
TransmittanceTransmittance
citometría

7
citometría
citometría
Óptica de emisión:
EspejosServicio de separación celular y
citometría

8
Óptica de emisión
PMT 4
PMT
3
Dicroicos
Filtros
Bandpass
Filters
Laser
Cámara de flujo
PMT 2
FSC
SS
C
PMT 1
citometría
Óptica de emisión
PMT 1
PMT 4
PMT
3
Dicroicos
Filtros
Bandpass
Filters
Laser
Cámara de flujo
PMT 2
FSC
SS
C
citometría
Óptica de emisiónServicio de separación celular y
citometría

9
SSC
PE
PE-Cy7
FITC
PerCP-Cy5.5
PE-Txred
Óptica de emisiónServicio de separación celular y
citometría
Detectores
• Convierten la señal luminosa en corriente eléctrica. La
intensidad de esta señal es proporcional a la luz que llega.
• En citometría se usan de 2 tipos ambos basados en el
efecto fotoeléctrico:
- Fotodiodos de silicio: Los fotones que inciden en una
placa de silicio liberan electrones.
• Menos eficientes se usan para medir la dispersión
frontal (FSC)
- Tubos fotomultiplicadores: Mas eficientes: Se usan para
medir fluorescencias y dispersión lateral (SSC)
citometría
Tubo fotomultiplicador
citometría

10
ELECTRONICA
Creación de un pulso de voltaje
Tiempo
LaserLaser
Voltaje
1
LaserLaser
Tiempo
Voltaje
2
Tiempo
LaserLaser
Voltaje
3
citometría
Área, altura, anchura
Time (µs)
Voltage
Pulse area(A)
PulseHeight(H)
Pulse Width (W)
400
citometría
(Volts)
0
10
(Volts)
RelativeBrightness
ChannelNumber
6.21 volts
1.23 volts
3.54 volts
10
1
.1
.01
.001
10
100
1000
10,000
1
256
196
64
0
128
(1mV)
citometría

11
(Volts)
0
10
(Volts)
RelativeBrightness
ChannelNumber
6.21 volts
1.23 volts
3.54 volts
10
1
.1
.01
.001
10
100
1000
10,000
1
256
196
64
0
128
(1mV)
UMBRAL
Umbral de adquisición
(Treshold)
• Eliminamos las señales muy bajas que en general
corresponden a restos celulares que no nos interesan
citometría
Láser (488 nm) Forward scatter
tamaño (488 nm)
Side scatter
Complejidad (488 nm)
Dispersión frontal (FSC)
se mide en la dirección de la luz
incidente (2-5 grados) a la misma
λ
Relacionado con el tamaño/
superficie celular (relación lineal
sólo para partículas esféricas)
Dispersión lateral (SSC)
Medido perpendicularmente a
la dirección de la luz incidente a
la misma λ
Relacionado con la complejidad
celular (granularidad)
Medición del tamaño y la
complejidad celular
citometría
Representación de la
información:
Histogramas
LaserLaser
Tamaño- FSC
Tiempo
Voltaje
citometría

12
LaserLaser
Tiempo
Voltaje
Tamaño- FSC
Representación de
la información:
Histogramas
citometría
LaserLaser
Tiempo
Voltaje
Tamaño- FSC
información:
Histogramas
citometría
FSC
Tamaño- FSC
información:
Histogramas
citometría

13
LaserLaser
Tamaño/Complejidad
Tiempo
Voltaje
Tamaño
TiempoVoltaje
Complejidad
información: Diagrama
de puntos
citometría
Tamaño y complejidad:
Células sanguíneas
Granulocitos
Debris Linfocitos
Monocitos
citometría
Fluorescencia
El fluorocromo absorbe la energía de la luz incidente y
se excita
Disipa la energía absorbida de forma prácticamente
instantánea:
Vibración y generación de calor
emisión de un fotón de mayor longitud de onda
(menos energético)
hλ
S0
S2
S1
Absorción Emisión
citometría

14
Moléculas orgánicas pequeñas.
Isotiocianato de fluoresceina
(FITC)
Proteínas.
Ficoeritrina (PE)
FluorocromosServicio de separación celular y
citometría
Quantum dots
• Nanoesferas de material semiconductor: Cd
+ Se o Te.
• Rodeadas de ZnS y un polímero orgánico.
• Funcionalizadas para poder unirse a
anticuerpos.
citometría
Quantum dots
• Funcionan como fluorocromos. Al
recibir un fotón emiten otro de mayor
longitud de onda.
• La λ a la que emiten es proporcional
al tamaño del núcleo del material
semiconductor.
citometría

15
Quantum dots
• Ventajas:
- Pico de absorción ancho: Con un
láser excitamos muchos QD.
- Pico de emisión estrecho: Mejor
compensación.
- Más estables.
• Inconvenientes:
- Poca disponibilidad.
- Toxicidad: Liberan metales
pesados.
- ¿Conjugación con anticuerpos?,
¿marcaje intracelular?
citometría
Brilliant violet
• Polímeros orgánicos
conductores
• Ultra brillantes. Entre PE y
APC.
• Un solo láser (405) excita
todos los BV
Cytometry Part A 81A: 456466, 2012 PK
Chattopadhyay
citometría
Fluoresceina (FITC)
400 nm 600 nm 700 nm500 nm
Excitation
Emission
Intensidadrelativa
citometría

16
Ficoeritrina (PE)
400 nm 600 nm 700 nm
Excitation
Emission
500 nm
Intensidadrelativa
citometría
Fluoresceina (FITC) Ficoeritrina (PE)
400 nm 600 nm 700 nm500 nm
Excitation
Emission
Fluorocromos
Intensidadrelativa
citometría
citometría

17
λλλλ=488 nm
Excitación
λλλλ=520 nm
Emisión
Inmunofenotipado
λλλλ=580 nm
citometría
• La fluorescencia emitida por cada fluorocromo o
colorante debido a la excitación por el láser es emitida en
todas direcciones.
• Situamos el detector a 90º para minimizar interferencias.
• La especificidad de la detección está controlada por la
selección de longitudes de onda por parte de espejos y
filtros ópticos.
citometría
Láser Detector FSC
Detector de FLs
(PMT3, PMT4 etc.)
citometría

18
EthidiumEthidium
PEPE
ciscis--Parinaric acidParinaric acid
Texas RedTexas Red
PEPE--TR Conj.TR Conj.
PIPI
FITCFITC
600 nm300 nm 500 nm 700 nm400 nm
457350 532 610 632488407
Los citómetros de flujo pueden llevar incorporados diversos
láseres de forma simultanea.
citometría
488488
Compensación de
Señales
Fluorescentes
505505--520520 570570--590590
IntensidadRelativaIntensidadRelativa
Longitud de ondaLongitud de onda
FITC
PE
citometría
Células marcadas
sólo con FITC
Compensación
de Señales
Fluorescentes
citometría

19
Muestra compensada
F CompensadaPE = F Medida PE - % FFITC
Compensación
de Señales
Fluorescentes
citometría
PE
FITC
SIN COMPENSAR COMPENSADA
Universidad de
Purdue
Compensación de
Señales FluorescentesServicio de separación celular y
citometría
Compensación de
Señales Fluorescentes
Universidad de
Purdue
El valor de la compensación
depende de la intensidad de
la señal
PE
FITC
PE
PE
FITC
citometría

20
• COMP BEADS: Mezcla de bolas de látex de 2 tipos:
- Recubiertas de anticuerpos anti cadena κ.
- “Desnudas”
• Al añadir cualquier anticuerpo con cadenas ligeras κ se
unirá a las partículas recubiertas y no a las desnudas.
• Preparamos tantos tubos como fluorocromos vamos a
usar y encada uno añadimos un anticuerpo con un
fluorocromo diferente
Compensación de
citometría
Compensación de
Señales Fluorescentes.
Comp Beads
• La compensación es correcta cuando la media de la
fluorescencia para PE es igual para las 2 poblaciones
citometría
Compensación de
citometría

21
• Fluorocromos en tándem
• El desplazamiento de λ entre absorción y emisión es
pequeño: Limita los fluorocromos utilizables
simultáneamente → FLUOROCROMOS EN TANDEM
APC Cy7Láser
Emisión
citometría
• Cuidado con los flurocromos en Tándem. El “fluorocromo
lejano” se puede excitar directamente al pasar por un láser
adecuado y el quenching del donor nunca es el 100%
PE Cy7
Láser azul
770 nm
Láser azulLáser azul
Láser rojo
PE Cy7 770 nm
citometría
• Aumenta el número de
fluorocromos utilizables,
pero se rompen con
facilidad. Guardar siempre
en oscuridad y nevera,
nunca diluir, testar cada
nuevo vial, compensar
siempre con el reactivo que
estamos usando
Fluorocromos
en tándem
0 horas0 horas
2 horas2 horas
22,5 horas22,5 horas
citometría

22
S.C Bendall et al.
citometría
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Qué fluorocromo uso?
• No todos los fluorocromos son igual de “buenos”
produciendo fluorescencia.
• Rendimiento cuántico: Cuantos fotones necesita recibir un
fluorocromo para emitir uno → Determina el llamado “indice
de marcado”
citometría
D = Diferencia entre la mediana de los picos
W = 2 x SD (Desviación estandar)
Indice de marcado = D / W
CD127 PE
300 400 500 600 700
0
5
10
15
20
25
30
35
40
25 mW green laser (532 nm)
100 mW blue laser (488 nm)
25 mW blue laser (488 nm)
PMT voltage
Stainindex
citometría

23
Indice de marcado
citometría
• Hay que elegir la combinación de fluorocromos “mas
brillante” posible
• los fluorocromos más brillantes deben reservarse para los
marcajes más débiles
• debe minimizarse la compensación .
citometría
Podemos clasificar los antígenos a estudiar en 3
categorías.
•Antígenos primarios: Bien caracterizados, muy
abundantes en las células, expresión on-off: CD3,CD4:
Usar fluorocromos más débiles y con más problemas de
compensación. Pacific Blue, APC-Cy7, PE-Cy7, QD 800,
Alexa 700
citometría

24
• Antigenos secundarios: Bien caracterizados, muy
abundantes en las células, pero la expresión es un
continuo. CD27, CD45RA/RO Usar fluorocromos
“medios” y a ser posible con poco problemas de
compensación. FITC, PerCP-Cy 5.5, Alexa 405,
Alexa 680, BV 510, BV 650, BV 711
• Antígenos terciarios: Poca Expresión en las células o
expresión desconocida. CD25, CCRs: Fluorocromos
mas brillantes. PE, APC, QD655, BV421, BV 605
citometría
citometría
AUTOFLUORESCENCIA
Espectro de absorción y
emisión de NAD(P)H
• Tambien FAD, AA aromáticos, Vit
A….
• Sobre todo azul-verde (FITC).
• Granulocitos, monocitos, linfocitos
activados
citometría

25
S.C Bendall et al.
Hay vida más allá de la
fluorescencia: CYTOFServicio de separación celular y
citometría
fluorescencia: CYTOFServicio de separación celular y
citometría
fluorescencia: CYTOF
• En teoría + de 100 marcajes simultáneos (contaminación y
oxidación bajan el número) sin necesidad de compensación
• Índice de Marcado peor que los fluorocromos más
brillantes pero muy parecido entre ellos.
• Vmax 1000 cels/seg. Además sólo aprovecha el 30% de
la muestra.
• No FSC/SSC, ni niveles de calcio, división celular………
citometría

26
¿ Que podemos medir
por citometría de
flujo?
Metabolitos
citometría
Características de la
citometría de flujo
-El análisis es multiparamétrico y simultáneo. - El análisis
se realiza sobre partículas individuales dentro de una
población compleja.
- El análisis se realiza a velocidades de entre 500 y 4000
partículas/segundo lo que resulta en una elevada fiabilidad
estadística (permite analizar poblaciones representadas en
baja frecuencia).
- Se pueden analizar partículas de tamaños 0,5-100 µm
(bacterias, levaduras, células eucarióticas).
citometría
•El análisis no permite determinar la localización de la
fluorescencia.
• En el caso de células adherentes tenemos que
despegarlas del soporte de cultivo, lo que puede alterar
su fisiología.
• Se consume muestra. La citometría convencional no
permite re-análisis de la misma.
Características de la
citometría de flujoServicio de separación celular y
citometría

27
INMUNOFENOTIPADO
citometría
• ¿Qué es un anticuerpo?.
• Marcaje directo extracelular. Representación de la
información: Histogramas, gráficas de puntos y densidad,
escalas.
• Otras estrategias de marcado: Marcaje intracelular, marcaje
indirecto.
• Controles en inmunofenotipado: Isotipo, biológicos y FMO.
• Bloqueo de receptores Fc
• ¿Cuánto anticuerpo uso?
citometría
• Se basa en la unión específica de los anticuerpos con su
antígeno correspondiente.
• Se generan anticuerpos frente a las proteínas cuya
presencia en la célula queremos determinar y se les acopla
un fluorocromo.
• Si la célula expresa la proteína el anticuerpo se une y
veremos fluorescencia asociada a esa célula
citometría

28
Anticuerpos
• Son glicoproteínas producidas por linfocitos B. Reconocen
con alta afinidad sustancias extrañas y activan la posterior
respuesta inmune.
• Principal Característica: Enorme diversidad.
- Recombinación somática.
- Hipermutación
- Cambio de clase.
• En proteínas reconoce zonas pequeñas (± 7 aa). Se
pueden generar varios anticuerpos misma proteína
citometría
Región
variable
Región
variable
Estructura de las
inmunoglobulinas
α, δ, ε, γ, µ
κ, λ
AnticuerposServicio de separación celular y
citometría
Anticuerpos monoclonales.
• Cuando inmunizamos un animal con un antígeno obtenemos una
mezcla de anticuerpos contra los diferentes epítopos → Anticuerpo
policlonal.
- Producción limitada: Necesidad de sucesivas inmunizaciones.
• Anticuerpos monoclonales. Son producidos por un único clon
específico de linfocitos B, pertenecen a una clase y subclase
determinadas y tienen una especificidad única frente a un antígeno
determinado.
Anticuerpos
citometría

29
Anticuerpos
citometría
λλλλ=488 nm
Excitación
λλλλ=530 nm
Emisión
Marcaje superficialServicio de separación celular y
citometría
Marcaje superficial
• La intensidad del marcaje es proporcional al número de
moléculas diana que hay en la superficie
citometría

30
Estudio
monoparamétricoServicio de separación celular y
citometría
Triples
negativos
Simples
positivos
Dobles
positivos
Triples
positivos
Estudio
multiparamétricoServicio de separación celular y
citometría
información
• Gráficas bidimensionales
citometría

31
S.C Bendall et al. Trens in Immunology
citometría
información
Gráficas tridimensionales Gráficas n-dimensionales
citometría
información
• Diagrama de puntos • Diagrama de densidad o de
contorno.
citometría

32
información
citometría
información
Escala lineal.
Escala logarítmica
citometría
Escala Logicle-biexponencial: Nos muestra los valores
negativos: Los software realizan una corrección del ruido de
fondo (baseline) que puede hacer que ciertas partículas muy
poco fluorescentes nos den un valor negativo
informaciónServicio de separación celular y
citometría

33
Escala Logicle-biexponencial
informaciónServicio de separación celular y
citometría
Estrategia de análisis
citometría
Estrategia de análisis
CD 95
CD28
citometría

34
HY Maecker Cytometry Part A 62A:169–173 (2004)
Fluorocromos
en Tándem.
Falsos
positivos
citometría
citometría
• El marcaje pude ser superficial o intracelular.
• En el caso del marcaje intracelular hay que.
- Permeabilizar la célula. Los anticuerpos no difunden
a través de la membrana celular → Detergentes
(Saponina, Tween).
- Fijar la célula para evitar que el contenido intracelular
salga al exterior → paraformaldehido, etanol.
• Comprobar que el tratamiento no afecte al marcaje.
citometría

35
Marcaje intracelular
Marcaje
superficial Fijación
Marcaje
intracelular
Permeabilización
citometría
Primario conjugado
(directo)
Primario sin conjugar
(indirecto)
Primario conjugado
con biotina
Complejo avidina-fluorocromo
Secundario conjugado
(indirecto)
Estrategias de marcado
Directo Indirecto Avidina-Biotina
citometría
• Para realizar el marcaje simplemente se añade el anticuerpo a la
suspensión celular, se deja incubar 15-30 min. A 4º C, se lava para
eliminar el exceso de anticuerpo, se resuspende y se lleva al
citómetro
• En el caso de marcaje indirecto se hacen 2 incubaciones
consecutivas con un paso de lavado intermedio.
• Si trabajamos directamente con sangre debemos realizar un paso
final de lisis de eritrocitos sin afectar a los leucocitos.
• Si no podemos analizarlas en el momento se puede fijar las
células
citometría

36
Controles de isotipo.
• El anticuerpo puede unirse inespecíficamente a la
superficie celular o a las proteínas citoplasmáticas →
Falso positivo.
• Para controlar este problema se usan los controles de
isotipo: Anticuerpos de la misma clase del que usamos y
con el mismo fluorocromo pero diseñados para reconocer
moléculas que nunca están presentes en las células → el
marcaje que aparezca sólo será por uniones
inespecíficas.
citometría
Primario conjugado
(directo)
Control de isotipo
Controles de isotipo
Unión específica Unión inespecífica Control de isotipo
citometría
información: Controles de
isotipo
citometría

37
CONTROLES BIOLÓGICOS
• Para que los controles de isotipo sean adecuados es
necesario que se comporten igual que los anticuerpos que
vamos a usar → Difícil de asegurar (¿concentración?
¿moléculas de fluorocromo por anticuerpo?)
• El mejor control es usar nuestro anticuerpo en unas células lo
mas parecidas posibles a las que queremos estudiar pero que
no expresen el marcador de interés → Control biológico.
citometría
CONTROLES
BIOLÓGICOS
CD8
citometría
Perfetto et al. Nature Review Immunology (4) 648-655, 2004
Controles FMO
• No corrigen la unión inespecífica sino la interferencia entre
fluorocromos que no elimina la compensación
•Se añaden en un tubo todos los fluorocromos menos el
“controlado” → Fluorescence Minus One
citometría

38
H.T MAECKER BD Biosciences
Controles
Comparación
de controles
citometría
Bloqueo de receptores Fc
• Diversos tipos de leucocitos poseen receptores que se unen a
la zona constante de los anticuerpos.
• Unen por lo tanto inespecíficamente cualquier anticuerpo que
se les añada
Receptor FcReceptor Fc
AntígenoAntígeno
AnticuerpoAnticuerpo
conjugadoconjugado
Servicio de separación
celular y citometría
Bloqueo de receptores Fc
• Para solucionar este problema, antes de añadir el
anticuerpo específico, se incuba la suspensión celular con
un gran exceso de anticuerpo sin marcar
• Especialmente importante si la señal fluorescente es
débil, en el caso de marcajes intensos aunque disminuye la
relación señal/ruido no es imprescindible
citometría

39
Receptor Fc
Antígeno
Anticuerpo
conjugado
IgG (ratón)
Bloqueo de
receptores FcServicio de separación celular y
citometría
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Cuánto anticuerpo añado?
• Si añadimos más anticuerpo tenemos más unión a la
proteína problema, pero también más unión inespecífica.
Concentración de anticuerpo
Señal/ruido
Titulación del anticuerpo:
Probar diferentes cantidades
hasta encontrar la que da la
relación señal/ruido óptima
citometría
Concentración de anticuerpo
Señal
Unión específica
Unión inespecífica.
ASPECTOS PRÁCTICOS
¿Cuánto anticuerpo añado?
• Lavar después de añadir el anticuerpo disminuye mucho la
unión inespecífica
citometría

40
ESTUDIO DE CICLO CELULAR Y
PROLIFERACIÓN
citometría
• Estudio de ácidos nucleicos.
- Fluorocromos usados.
- Aplicaciones:
+ Detección de células nucleadas.
+ Discriminación de células muertas.
+ Estudio de ciclo celular. Fundamento, adquisición y
eliminación de dobletes.
- Ciclo celular y BrdU
- Ciclo celular e inmunofenotipado.
• Estudios de proliferación. Número de divisiones celulares
citometría
• Se usan fluorocromos con las siguientes características.
- Unión estequiométrica a los ácidos nucleicos.
- Fijación estable a los mismos.
- La fluorescencia aumenta al unirse.
• Diversas especificidades: Unión a ADN y ARN, pares A-T,
pares G-C.
• 2 tipos.
- Impermeables. No atraviesan la membrana plasmática
intacta.
- Permeables. Atraviesan la membrana plasmática.
citometría

41
citometría
Detección de células
nucleadas
Stuart T.F et al Blood 2006
• Incubamos con una sonda permeable de unión al ADN.
Entra en todas las células y tiñe aquellas que tienen
núcleo
• Interesante si trabajamos en
sangre con poblaciones
minoritarias: Elimina hematíes
y agregados plaquetarios
citometría
Viabilidad celular.
• Cuando la célula muere se abren poros en la membrana lo
que permite la entrada de colorantes que se unen al ADN
incapaces de atravesar la membrana intacta
Importante eliminar del
análisis las células muertas
→ Más autofluorescentes y
más unión inespecífica del
anticuerpo.
citometría

42
Viabilidad celular.
Vivas/muertas Marcaje inespecífico
citometría
Ciclo celular y
contenido de ADN.
G0/G1→ 2n.
S → 2n/4n.
G2/M → 4n
Ciclo Celular
citometría
• La cantidad de fluorescencia emitida es proporcional a la
cantidad de ADN.
• El colorante más usado es el yoduro de propidio.
• El PI tiene una elevada eficiencia cuántica y es barato, pero
se une también a RNA bicatenario (hay que tratar con RNAsa)
y tiene un espectro de emisión ancho (dificulta la posibilidad
de otros marcajes).
Ciclo Celular
citometría

43
PI
Fijación
Permeabilización
G0/G1
S
G2/M
Ciclo Celular
citometría
Ciclo Celular.
Adquisición en el citómetro.
• Siempre en escala lineal: Mayor separación de los picos.
• Muy importante conseguir la mayor resolución de los picos
(bajo CV).
- Adquirir a la menor presión y velocidad de inyección
posibles.
- Adquirir el máximo número de células posible (> 10.000)
citometría
Yellow-W
0 30 60 90 120
Yellow-A
0306090120
R1
PI Anchura
PIArea
Ciclo Celular
2n2n 4n4n 2n+2n2n+2n
Igual área pero
diferente anchura del pulso.
Contenido de DNA
Tiempo
Láser
Discriminación
de dobletes.
citometría

44
Ciclo Celular
Discriminación de
dobletes
citometría
Ciclo Celular
CARIOTIPO DE
FLUJO
citometría
G0/G1
S
G2/M
G0/G
1
S
G2/M
• No es posible la
delimitación exacta de
las fases del ciclo
Ciclo CelularServicio de separación celular y
citometría

45
Channels (Yellow-A)
0 30 60 90 120 150
Number
070140210280
G0/G1
S
G2/M
• Se puede recurrir a
programas informáticos
que utilizan modelos
matemáticos para delimitar
las fases
Ciclo Celular
citometría
Channels (Yellow-A)
0 30 60 90 120 150
Number
040080012001600
• Mezcla de 2 poblaciones
celulares con diferente
contenido de ADN
Ciclo Celular
citometría
Channels (Yellow-A)
0 50 100 150 200 250
Number
0200400600800
• Mezcla de poblaciones 2n y 4n
Ciclo Celular
citometría

46
Ciclo Celular
• Controles en ciclo celular.
Timocitos de ternera
Eritrocitos de pollo 35% del
ADN humano
citometría
Ciclo Celular. BrdU
• La BromodeoxiUridina es un análogo de la Timidina. Se
incorpora al ADN de aquellas células que están duplicando el
ADN.
• Añadiendo posteriormente un anticuerpo anti BrdU y un
fluorocromo que se una al ADN podemos determinar que
células están en la fase S del ciclo.
• Problema. Para que el anticuerpo llegue hasta la BrdU es
necesario desnaturalizar el ADN (Calor, DNAsas, ácidos).
Existen otros análogos de la T que no requieren este paso.
citometría
BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine)
Br
Br
Incubación
Desnaturalización
Ciclo Celular. BrdU
citometría

47
EdU (5-ethynyl-2'-deoxyuridine)
Incubación
Ciclo Celular. EdU
citometría
Ormerod M. Basic flow cytometry
Ciclo Celular. BrdU
citometría
Gary Warnes. University of London
• Si añadimos BrdU al
cultivo, incubamos,
lavamos y vamos
recogiendo células a
diversos intervalos tenemos
una imagen dinámica del
ciclo
Ciclo Celular. BrdU
citometría

48
Ciclo Celular
• No se puede distinguir la fase G0 de la G1 (ambas 2n) y la
fase G2 de la M (ambas 4n)
• Si medimos el contenido en ARN podemos separa G0 de
G1
• Mediante inmunofenotipado de proteínas cuya expresión
cambia durante las fases del ciclo podemos discriminar G0
de G1 y G2 de M
citometría
Ciclo Celular.
Contenido de ARN
Pyronina. Intercalante en dsNA.
- Más especificidad por dsRNA, aunque no exclusivo.
- Marca rRNA y tRNA no RNA total.
- Exc 547-560nm, emi 565-574nm.
Naranga de acridinio.
- Mide el RNA total.
- Se excita a 488nm y emite en rojo unido al RNA y verde
unido al DNA
- Muy dependiente de las condiciones: concentración,
fuerza iónica, detergentes.
citometría
WOODWARD et al. PNAS 2007
Ciclo Celular.
Contenido de ARN
citometría

49
Ciclo Celular.
Inmunofenotipado
• Diferenciación de fase G2- M
citometría
Ciclo Celular.
Inmunofenotipado
Expresión de ciclinas y ciclo celular
Ormerod M. Basic flow cytometry.
citometría
CFSE
XX
Fluorescencia / célulaFluorescencia / célula
X / 2X / 2 X / 4X / 4
Sin dividir
Tras una
división
Tras dos divisiones
Estudio del número de
divisiones celulares
• Se usa una sonda que difunde a través de la membrana y
una vez en el interior de la célula se modifica, se vuelve
fluorescente y no pueda salir.
Servicio de separación celular
y citometría

50
No proliferantesProliferantes
• El número de ciclos distinguibles es limitado: Dilución
excesiva de la sonda.
• La fluorescencia depende del tamaño, poblaciones con
mucha dispersión del mismo dan resultados pobres.
citometría
• Combinación con marcaje
de membrana
• Combinación con estudio
de viabilidad
citometría
ESTUDIO APOPTOSIS Y MUERTE
CELULAR
citometría

51
Apoptosis
• La apoptosis es un modo de muerte celular activo y
fisiológico en el que la célula ejecuta el programa de su
propia muerte. Regulado por Caspasas
• La necrosis es una muerte accidental debida a un estrés:
choque térmico, hipotónico, pH..
• Los métodos deben distinguirlas
citometría
Apoptosis
citometría
Apoptosis
citometría

52
Apoptosis
citometría
Apoptosis Necrosis
Grupos de células
Núcleo Condensación densa
de la cromatina
Agrupación irregular de
la cromatina
Organelas
citoplásmicas
Intactas
morfológicamente
Anormales
Membrana celular Cuerpos apoptóticos
Blebbing
Blebbing y pérdida de la
integridad
Volumen celular Se incrementaSe reduce
En tejidos Células aisladas
Respuesta tisular Ninguna Inflamación
Diferencias entre
apoptosis y necrosisServicio de separación celular y
citometría
Apoptosis y patología.
• Aumentada:
- SIDA
-Enfermedades neurodegenerativas:
Alzeheimer, Parkinson, ELA, Retinitis
pigmentosa
- Anemia aplásica.
- Isquemia: Infarto, Accidente cerebro
vascular
- Cirrosis alcohólica
• Disminuida:
- Cancer: Linfomas foliculares, tumores
con mutación en p53, tumores
hormonodependientes (mama, próstata,
ovario)
- Enfermedades autoinmunes: LES,
Glomerulonefritis
- Virus: Herpesvirus, poxvirus,
adenovirus
citometría

53
Apoptosis
Métodos De Análisis por
citometría
• Exposición fosfatidilserina
• Fragmentación de ADN
• Detección de caspasas activadas.
• Función mitocondrial.
• Otros: Radicales de oxígeno, cambios en la permeabilidad
de membrana, niveles de iones, Familia Bcl2, cambios en
tamaño y complejidad
citometría
PS: Fosfatidil serina
Estudio de apoptosis.
Anexina V/PIServicio de separación celular y
citometría
Anexina V
YodurodePropidio
10 10 10 10 100 1 2 3 4
14%
37%
101010101001234
Control Fármaco
10 10 10 10 100 1 2 3 4
6%
5%
101010101001234
15%
5%
Células vivas
Apoptosis tardía Necrosis
Apoptosis temprana
citometría

54
• Método sencillo, rápido y relativamente barato.
• Fácil de combinar con inmunofenotipado de membrana: La
anexina se puede marcar con el fluorocromo que queramos y
el PI se puede sustituir por otra sonda similar (7-AAD).
• Limitaciones:
- Apoptosis sin exposición de PS.
- En la necrosis puede haber marcaje de Anexina V.
citometría
Anexina V/PI
VIVAS
APOPTOSIS
TEMPRANA
APOPTOSIS
TARDIA +
¿NECROSIS?
NECROSIS
citometría
Fragmentación del ADN
Rotura
internucleosomal
citometría

55
T – Tdt mediated
U – dUTP-biotin
N – nick
E – end
L – labelling
3’-OH-ADN
TdtPoli-BrdU
Anti-BrdU-FITC
3’-OH-ADN-UTP-Brd
3’-OH-ADN
3’-OH-ADN
ADN3’-OH-ADN
• Técnica relativamente sencilla.
• Implica fijar las células.
• Existen procesos apoptoticos sin rotura internucleosomal
citometría
• Se puede combinar con inmunofenotipado y con estudio
del ciclo celular.
citometría
0 40 80 120 160 200
G1
S
G2/M
Channels (FL2-A-PI CONTROL 24H)
3%
Control
G1
S
G2/M
Channels (FL2-A-PI MITO 24H)
0 40 80 120 160 200
21%
Mitoxantrona
0.25µg/mL
• Pico sub-diploide
citometría

56
Activación de caspasas
• El método más directo
es usar anticuerpos
marcados contra la
forma activada de las
caspasas
citometría
• Detección de rotura de sustratos.
- Anticuerpos anti-proteínas rotas por caspasas (PARP).
- Rotura de sustratos con cambio de fluorescencia.
SUSTRATO- SUSTRATO +
• Inhibidores fluorescentes (FLICA)
CASPASA
citometría
Ormerod. Basic flow Cytometry
• Rotura de sustrato fluorescente
Control Estaurosporina
citometría

57
Función mitocondrial
• La mitocondria es el mediador clave en la apoptosis
inducida por estrés celular.
• Uno de los primeros cambios que ocurre al iniciarse la
apoptosis es una pérdida del potencial de membrana
mitocondrial (Ψm).
• Existen fluorocromos cuya fluorescencia varia con Ψm
citometría
• Moléculas fluorescentes que se acumulan en la mitocondria
si Ψm está conservado, sino, salen de la mitocondria y de la
célula.
DiOC6(3)
Control KCN
N: Vivas; D: muertas; A: apoptóticas
citometría
• Moléculas que cambian su fluorescencia en función de su
estado de agregación: Si Ψ2 está intacto se acumulan en la
mitocondria (alta concentración, agregados) si no salen al
citoplasma (baja concentración monómeros)
JC-1.
• Agregados: rojos.
• Monómeros: Verdes
A: Control; B: Apoptosis
citometría

58
• Existen otros parámetros mitocondriales que se afectan
en la apoptosis y que podemos estudiar por citometría
• Liberación cit c.
• Producción de ROS: Disfunción de la cadena respiratorio
• Apo 2.7: Anticuerpo que reacciona con una proteína
mitocondrial que aparece en membrana en la apoptosis.
muy temprano
citometría
Proteínas de la familia
Bcl2
• Familia de proteínas que controla la formación de poros en
la membrana mitocondrial y regula la apoptosis.
- Pro apoptóticas: Bax, Bak, Bid, Bik, Bcl-Xs, Bad
- Anti apoptóticas : Bcl2, Bcl-XL, Bcl-w, Mcl-1, Brag-1, Bfl-1
Neutralida
d
Supervivencia Muerte
Ratio Bcl2/Bax
citometría
APOPTOSIS VOLUMEN COMPLEJIDAD
inicial Disminución Aumento
tardía Disminución Disminución
NECROSIS
inicial Aumento Disminución
tardía Disminución Disminución
Cambios en el volumen y
la complejidad celular
Poco específico y poco sensible: células muertas, debris,
núcleos aislados, cuerpos apoptóticos
citometría

59
Cambios en volumen y
complejidad celular
0 64 128 192 256
064128192256
SSC
FSC
Control Fármaco
0 64 128 192 256
064128192256
citometría
Cambios en la
permeabilidad de la
membrana
• A medida que aumenta la
apoptosis la membrana va
siendo mas permeable a
fluorocromos con carga como
PI, aunque no pierde totalmente
su funcionalidad.
• La cantidad de fluorocromo que entra es demasiado
pequeña para dar el máximo de fluorescencia posible
citometría
Formación apoptosoma
Disminución ∆ψm
Activación caspasa
Proteólisis PARP
Externalización FS
Fragmentación ADN
Cambios morfológicos
Membrana permeable
Horas aproximadas después de la inducción por anti-FAS
2 4 6 8 10
Secuencia de acontecimientos.
citometría

60
ANÁLISIS FUNCIONAL.
citometría
• Producción de ROS.
• Medida de pH
• Medida de concentración intracelular de Ca2+ libre
• Potencial de membrana
• Actividad enzimática.
• Estudio de genes reporteros: Proteínas fluorescentes.
• Estudio de la “side population”.
• Estudio de componentes celulares.
• Otras aplicaciones.
citometría
• Se acopla un cambio de emisión a un proceso biológico:
Moléculas cuya fluorescencia cambia con pH, nivel de iones,
procesamiento por una enzima, potencial de membrana celular
o mitocondrial ….. y que se retiene en la célula.
APLICACIONESEstudios funcionales
citometría

61
Producción de especies
reactivas de oxígeno
Dihidrorodamina 123
RODAMINA 123RODAMINA 123
HH22OO22
• Fluorocromos cuya
fluorescencia cambia
con su estado redox
citometría
Ormerod M. Basic Flow Cytometry
Producción de especies
reactivas de oxígeno
• Estallido respiratorio en
neutrófilos estudiado con
dihidroetidina
citometría
Structure Reactive Oxygen Species Detection Reagents
H2O2 Hydrogen peroxide
Carboxy-H2DCFDA ,CM-H2DCFDA ,Dihydrocalcein AM
Dihydrorhodamine 123 , Dihydrorhodamine 6G , H2DCFDA ,
Lucigenin Luminol , RedoxSensor Red CC-1
HO• Hydroxyl radical
3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl)
fluorescein (HPF), CM-H2DCFDA Proxyl fluorescamine ,TEMPO-9-
AC
HOCl Hypochlorous acid Aminophenyl fluorescein (APF) , Dihydrorhodamine 123 ,Luminol
NO Nitric oxide DAF-FM , DAF-FM diacetate, DAA , 2,3-Diaminonaphthalene ,Luminol
ROO•
Peroxyl radical, including both
alkylperoxyl and hydroperoxyl
radicals (wherein R = H)
BODIPY FL EDA, BODIPY 665/676, H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA,
CM-H2DCFDA, DPPP, Luminol, cis-Parinaric acid, RedoxSensor Red
CC-1
ONOO– Peroxynitrite anion
3'-(p-Aminophenyl) fluorescein (APF), 3'-(p-Hydroxyphenyl)
fluorescein (HPF), H2DCFDA, Carboxy-H2DCFDA, CM-H2DCFDA,
Coelenterazine Dihydrorhodamine 123, Dihydrorhodamine 6G,
Luminol
1O2 Singlet oxygen
Singlet Oxygen Sensor Green reagent, trans-1-(2'-
methoxyvinyl)pyrene
•O2
– Superoxide anion
Coelenterazine, Dihydroethidium, Fc OxyBURST Green assay
reagent OxyBURST Green H2DCFDA SE, OxyBURST Green H2HFF
BSA, Lucigenin Luminol, MCLA, MTT, NBT, RedoxSensor Red CC-1,
TEMPO-9-AC, XTT
citometría

62
Medida del pH
• Generalmente ácidos débiles con un pKa cercano a 7 y
con un fluorescencia diferente en las formas
desprotonadas y protonadas.
Cambio en la intensidad de
fluorescencia de la fluoresceina
con el pH
citometría
Medida del pH
• Generalmente se usan
fluorocromos con distintos
picos de emisión entre la forma
protonada y desprotonada →
Medidas ratiométricas
Espectro de emisión de
SNARF-1 en función del pH
citometría
O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001
Medida del pH
• Medidas cinéticas de cambio de pH intracelular en leucocitos
tras acidificación del medio con BCEF (ratio amarillo/verde)
citometría

63
Medida del pH
• Método cuantitativo → Crear
curvas de calibración
citometría
6.5 7 7.5
MUESTRA
Medida del pH
citometría
Concentración de Ca2+
libre intracelular
• Moléculas cuya fluorescencia varía con los niveles de Ca2+
intracelular
Cambio en la
intensidad
Espectros de emisión fluo-3 y
fura red en función de la
concentración de Ca2+
Cambio en la
λ de emisión
Espectro de emisión Indo-1 en
función de la concentración de
Ca2+
citometría

64
libre intracelular
Medidas
directas
Cambios en la
concentración de Ca2+
intracelular en linfocitos,
monocitos y macrófagos
medidos con Fluo 3
citometría
Medidas
ratiométricas
Medida de Ca2+ intracelular en células
JurkatJ6 después de añadir un anticuerpo
anti-CD3 con una mezcla de Fluo3 y Fura Red
(ratio 525/675)
libre intracelularServicio de separación celular y
citometría
Medida del potencial de
membranaServicio de separación celular y
citometría

65
Despolarización de Staphylococcus
aureus inducida por CCCP medida
con DiOC2(3).
Polarizada
Despolarizada
Medida del potencial de
membranaServicio de separación celular y
citometría
• Se añade un sustrato que difunde en la célula y al ser
procesado por la enzima se vuelve fluorescente (sustrato
fluorogénico).
• Podemos medir la actividad de proteasas (caspasas),
esterasas (CFSE), oxidasas, dehidrogenasas, transferasas,
fosforilasas…….
Medida de la actividad
enzimáticaServicio de separación celular y
citometría
ACTIVIDAD DE ALDOLASAEstudio de la actividad
de aldolasa
Con actividad enzimática Sin actividad enzimática
citometría

66
A
Genes reporteros,
proteínas fluorescentes
Control sin transfectar Células transfectadas con GFP
citometría
Chudakov D M et al.
Physiol Rev 2010;90:1103-
1163
©2010 by American Physiological Society
citometría
Estudio de la “side
population”
• Las células progenitoras presenta gran actividad de
transportadores de la familia ABC que expulsan fuera de la célula
el Hoechst 33342
citometría

67
Bone Marrow
population”Servicio de separación celular y
citometría
Hoechst Far Red
HoechstBlue
+ verapamil
A B
population”
• Se excita con laser UV y se mide emisión a 420 y 670 nm
citometría
Detección de
componentes celulares
• Marcaje con rojo nilo y Syto
62 para estudiar células
nucleadas con depósitos de
lípidos neutros
citometría

68
Otras aplicaciones
O´Connor JE et al. IUBMIB Life. 2001
citometría
SEPARACIÓN CELULAR.
citometría
Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS)
• Separación individualizada de células en función de
parámetros definidos por citometría de flujo.
• Posteriores estudios de biología molecular (RT-PCR,
FISH), clonación de líneas celulares, estudios
funcionales, etc.
citometría

69
Sorting Electroestático
Punto de incidencia del láser y de decisión
oooo oooo oooo
Izq basura der
Transductor Vibra a una frecuencia
determinada para producir separación del
chorro en gotas.
o o o o o
o o o o o
o o o o
o o o
o
o
o
o
o
o
o
o
Carga de la gota
+ Azul - rojo.
-+ Gotas cargadas son separadas en un
campo electroestático ± 3000 V
o-
o+
o
o+
o-
o
o
+
-
+
+
Drop delay
Recogida
citometría
Nozzle
citometría
Gota satélite
Amplitud
Frecuencia
• Se generan hasta
100.000 cels/seg.
• Lo ideal es que
haya un máximo de
1 célula cada 3
gotas
citometría

70
Separación de dos poblaciones celulares
citometría
citometría
citometría

71
Separación de cuatro poblaciones celulares
citometría
Separación de cuatro poblaciones celulares
citometría
• Se pueden separar células individuales directamente en
placas de 96 pocillos.
• Se puede separar directamente en placas de 6, 12, 24
pocillos o en un porta de microscopia.
• Se puede mantener la muestra a
4 o 37º C.
• Se puede recoger la muestra a 4
o 37º C. Medio de recogida PBS +
Suero fetal bovino, no medio de
cultivo
citometría

72
• El parámetro crítico es el drop delay: Tiempo que transcurre
desde que seleccionamos la célula hasta que se carga la gota
que la contiene.
• Depende de cómo se
forman las gotas → Ajustar
cada vez que hacemos una
separación.
• Separación de esferas
fluorescentes sobre un porta
citometría
• Accudrop. Sistema automatizado basado en esferas
fluorescentes. Un láser en la parte inferior del sorter nos
permite ver donde están.
citometría
• Recuperación-eficiencia: % de partículas sorteadas
recogidas del total de partículas que nos interesan.
• Pureza: % de partículas sorteadas recogidas que
cumplen los criterios seleccionados en función del total
sorteado.
• Si aumentamos la pureza disminuimos la
recuperación y viceversa
citometría

73
pureza
rendimiento
citometría
Nº deseado
de células
1.000
10.000
Concentración de células en la muestra
0,1%
8 min
1,4 h
1,0%
48 sg
8 min
5,0%
10 sg
1,7 min
50,0%
1 sg
10 sg
100.000
1.000.000
10.000.000
100.000.000
14 h
5,8 d
1,9 m
1,6 a
1,4 h
14 h
5,8 d
1,9 m
17 min
2,8 h
1,2 d
12 d
1,7 min
17 min
2,8 h
1,2 d
Velocidad lectura
2.000 cels/sg
¿ Y esto cuanto tarda?
citometría
• Sistemas de cámara abierta → RIESGO BIOLÓGICO.
• Sistemas Caros. Tanto equipamiento como consumibles.
• Sistemas lentos. Pureza depende de cuantas
células/segundo analicemos y la resolución de la citometría
es mejor si el número de células por segundo es bajo.
• Viabilidad celular variable: Tipo celular, tiempo y presión
de sorting, medio de recogida.
citometría

74
Sorters hidraúlicos
Cámara cerrada: no contaminación
Poco complicados, baratos y adaptables
Sistemas sin necesidad ajuste
Facilidad de uso (similar a analizador)
Baja velocidad de separación
Baja viabilidad del producto
Baja concentración celular
Emplean jeringas, energía acústica, etc.. para desviar el flujo
líquido durante algunos milisegundos y con él la célula
seleccionada.
citometría
Sorters hidraúlicos
citometría
Sorting de partículas
grandes. BIOSORTServicio de separación celular y
citometría

75
Nanopartículas
unidas a la célula
MACS
• Magnetic activated cell sorting. Utiliza partículas
magnéticas unidas a anticuerpos
citometría
ELECTROIMÁN N S
MATRIZ
FERROMAGNÉTICA
Anticuerpo unido a
nanopartícula magnética
MACS
citometría
FACS vs MACS:
Uno o los dos?
Son dos sistemas compatibles
FACS MACS
Separación
multiparamétrica
Separación por un solo
parámetro
No permiten
separaciones masivas
Separan un número elevado
de células.
Equipos caros, pero
amortizables a medio
plazo
Muy caros
Indicado para separar
poblaciones poco
frecuentes
Rápidos
citometría

76
ANÁLISIS MULTIPLEX.
citometría
• Estudio de moléculas solubles por citometría de flujo.
• El límite de detección en citometría de flujo es de 0.5 µ,
para poder estudiarlas necesitamos retenerlas en esferas
fluorescentes que se pueden detectar por el citómetro.
• La citometría nos permite estudiar diversas moléculas
simultáneamente asociando cada una a una esfera
diferente que puede distinguirse por citometría.
citometría
• Método realizable en cualquier citómetro aunque existen
equipos especialmente diseñados para el análisis
multiplex.
citometría

77
• Mezcla de beads de diferentes tamaños y con diferente
concentración de un fluorocromo que se excita con un láser rojo.
Diferenciación de las
esferasServicio de separación celular y
citometría
esferas
• Esferas del mismo tamaño
(5,6-6,5 µ) con una diferente
mezcla de 2 colorantes
excitados por el láser rojo
citometría
Matriz de
microesferas
coloreadas
Color 1
Color 2
citometría

78
citometría
Discriminador de dobletes
Elimina por tamaño
restos y agregados de
esferas
citometría
esferas
• Esferas del mismo tamaño con una
diferente mezcla de 3 colorantes
excitados por el láser rojo → Genera
500 esferas diferentes
citometría

79
• Las esferas se funcionalizan con diferentes moléculas
en función de lo que queramos estudiar
citometría
Multiplex
ILIL--22
ILIL--44 ILIL--1010
IFNIFN--gg
TNFTNF--alfaalfa
ILIL--55
ELISAELISA
PE
PE PE
PE
PE
PE
análisis de
concentración de
proteínas solubles
citometría
The Microsphere is a
5.6mM polystyrene bead
with two fluorescent dyes
incorporated into it in
different ratios.
A primary antibody specific
for the analyte is
conjugated to the bead
surface by an amine
coupling reaction
The primary antibody binds
to the specific analyte – no
crossreactivity with other
analytes occurs.
A biotinylated, analyte
specific reporter antibody is
added to the assay after
another wash step.
After another wash step
Streptavidin PE is added to
the assay. The biotinylated
reporter antibody binds to
one of the four available
sites.
In assays with high analyte
numbers excess biotinylated
reporter antibodies bind to
the Strep-PE in a non-
specific manner.
Free excess streptavidin-PE
binds to the non-specifically
bound biotinylated reporter
antibody leading to a signal
amplification.
The phycoerythrin is excited
by the reporter laser and
emits a fluorescence which
is quantified by the Luminex
reader.
The immune-complex/
microsphere is then excited by
the ****** laser. The bead
specific emmission is quantified
by the luminex and the bead
identified.
tomado de UPSTATE.
Serological corporation
análisis de
concentración de
proteínas solubles
citometría

80
Laser
A
Laser
B
análisis de
concentración de
proteínas solubles
citometría
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
1er trim. 2do trim. 3er trim. 4to trim. Este
Oeste
Norte
Coloranalizador
Color clasificador 1
Una vez clasificada la esfera con el primer láser, el segundo
mide la fluorescencia del fluorocromo asociado al segundo
anticuerpo que es proporcional a la cantidad de proteína en la
muestra
análisis de
concentración de
proteínas solubles
citometría
análisis de
concentración de
proteínas solubles
• Generando una curva de calibración podemos cuantificar la
concentración
citometría

81
5000 pg/ml625 pg/ml
156 pg/ml40 pg/ml0 pg/ml
312.5 pg/ml
Curva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibración
Se genera una curva de calibración asociando la
fluorescencia medida a unas concentraciones de analito
conocidas
citometría
Curva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibraciónCurva de calibración
citometría
Control negativoControl negativo
Por último los valores de fluorescencia obtenidos para cada
muestra se interpolan en la curva de calibración y se
calcula la concentración
citometría

82
MuestraMuestra
citometría
• Permite determinar hasta 500 proteínas en un solo ensayo.
• Gran ahorro:
- Económico: Equipamiento más caro que un ELISA pero se
compensa con el menor coste de los reactivos
- Tiempo
- Muestra: Con sólo 25 µl podemos determinar las 500
proteínas.
citometría
citometría

83
citometría
Aplicaciones en
biología molecular
• En lugar de anticuerpo funcionalizamos las esferas con
sondas de ácidos nucleicos.
• Se puede aplicar a múltiples aplicaciones: Genotipado
(estudios de SNPs), expresión génica, concentración de
micro RNAs, reordenamientos génicos.
• Funcionalizando con sondas de ácidos nucleicos también
podemos estudiar expresión de factores de trascripción
citometría
GenotipadoGenotipadoGenotipadoGenotipado
citometría

84
Genotipado
citometría
Genotipado
citometría
Genotipado
Ding C, Jin S. Methods Mol Biol. 2009
Comparación de métodos
MULTIPLEX
citometría

85
Cuantificación deCuantificación deCuantificación deCuantificación de
microRNAsmicroRNAsmicroRNAsmicroRNAs
• No necesita amplificación por PCR
citometría
Cuantificación deCuantificación deCuantificación deCuantificación de
microRNAsmicroRNAsmicroRNAsmicroRNAsServicio de separación celular y
citometría
• No es necesario
convertirlo en cDNA.
Expresión génicaExpresión génicaExpresión génicaExpresión génica
citometría

86
Grandes
reordenamientosServicio de separación celular y
citometría
Factores de
TrascripciónServicio de separación celular y
citometría
Factores de
TrascripciónServicio de separación celular y
citometría

87
• Sistema no basado en citometría de flujo.
• Requiere el uso de beads magnéticas.
• Equipo mas barato que los citómetros pero menos sensible
citometría
• Las partículas magnéticas
se retienen sobre un imán y
se iluminan con 2 LEDs:
Rojo y verde.
• La fluorescencia se lee con
una cámara CCD.
citometría

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