Articulo sobre la infeccion de Lutzomyia con el parasito leishmania

2. Se determino la presencia de flebotomíneos naturalmente infectados
con parásitos tripanosomatídeos en Los Montes de María, Colombia,
región endémica de leishmaniosis visceral y cutánea. Los
especímenes se colectaron usando trampas de luz tipo CDC y
trampas de papel con aceite de ricino. Se identifico 6 especies de
Lutzomyia entre los 159 flebotomíneos recolectados.
L. evansi
L. cayennensis cayennensis
L. trinidadensis
L. atroclavata
L. gomezi
L. dubitans
Un grupo de 9 se le amplificó un segmento de DNA de 800 pb del gen
que codifica el RNA de la subunidad pequeña ribosomal (ssrRNA) de
la familia Trypanosomatidae.

3. La leishmaniosis es una enfermedad emergente y reemergente
producida por el parasito tripanosomatídeo Leishmania, el cual es
transmitido al hombre por distintas especies de flebotomineos del
genero Lutzomyia. Cada año se diagnostican en Colombia mas de
18000 casos nuevos de leishmaniosis. En la costa caribe colombiana,
la leishmaniosis cutanea y viceral constituyen un importante problema
de salud publica por carácter endemico de la region, en especial en
Los Montes de Maria.

4. Hasta la fecha se han encontrado 9 especies flebotomineas
naturalmente infectadas con Leishmania spp.
• L. longipalpis (1912)
• L. evansi (1924)
• L. infantum (1908)
• L. spinicrassa (1969)
• L. braziliensis (1911)
• L. trapidoi (1952)
• L. yuilli (1972)
• L. gomezi (1931)
• L. panamensis (1926 y 1972)
• L. umbratilis (1977)
• L. guyanensis (1954)
• L. hartmanni (1957)
• L. colombiensis (1991)
• L. cayennensis cayennensis

5. Área de estudio
La investigación se desarrollo en el área rural del municipio de
Ovejas. Este municipio se encuentra ubicado sobre Los Montes de
María a una altura de 277 m. Sus características son bosque seco
tropical, temperatura promedio 26,7 °C, y precipitaciones de 1114,8
mm anuales.

6. Colección e identificación de Lutzomyia spp.
Los muestreos se realizaron durante los meses de marzo y abril de
2005, con trampas de luz tipo CDC entre 18:00 y 06:00 hrs y trampas
de papel impregnados con aceite de ricino, se efectuaron capturas de
flebotomineos en el interior de viviendas. Los especímenes fuero
preservados en etanol 70%
La cabeza, una ala y los últimos segmentos abdominales se
enviaron para la clasificación taxonómica.

7. Extracción de ADN
De acuerdo con la taxonomía, las hembras fueron puestas en tubos
de eppendorf en grupos de 2 a 9 ejemplares por especies. El DNA se
extrajo. El contenido del vial fue homogenizado con un micropistilo de
plastico en 60 μL de buffer de lisis e incubado a 65°C por 30 min, se
adicionaron 14 μL de acetato de sodio 8 M, se incuba en hielo 30 min
y se centrifuga a 13442 g por 10 min.

8. El sobrenadante se recolecta para la precipitación del DNA con 200
μL de etanol absoluto a 4°C durante toda la noche.
Centrifugar a 13442 rpm por 20 min, se retira el sobre nadante y el
precipitado se lava con 200 μL de etanol al 70% y después con 200 μL
de etanol absoluto.
El DNA se seca a temperatura ambiente, se resuspende en 50 μL de
agua estéril.

9. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
Para la reaccion de amplificacion se emplearon los cebadores
SSU561F y SSU561R, se amplifico un segmento de DNA de 800 pb
del gen que codifica el RNA de la ssrRNA de Trypanosomatidae.
La PCR se realizo en un Vt de 25 μL que contiene un buffer de PCR
1X, 25 mM MgCl2, 0.2 mM dNTPs, 1 U Tap DNa polimerasa, 5 μL del
DNA extraidoy 20 pM de cada cebador.
La mezcla fue incubada en un termociclador Hybaid PCR Express.

10. Se realiza una desnaturalización inicial del ADN a 94°C durante 3 min,
seguido por 35 ciclos consistentes de desnaturalización por 1 min a 90°C,
alineamiento durante 1 min a 50°C y extension a 72°C por 1 min, finalmente
con una extension de 10 min a 72°C, se incluyo un control negativo y uno
positivo constituido de ADN de Leishmania infantum.
Del producto amplificado se tomaron 12 μL que fueron mezclados con 2 μL de
buffer de carga (azul de bromofenol) y analizados mediante electroforesis en
gel de agarosa 1% en buffer TBE (Tris base, acido borico, EDTA) 0.5X.
Los productos se separaron durante 50 min a 80 v y se visualizaron con un
transluminador de luz ultravioleta, previa tincion con 0.5 μL de bromuro de
etidio.
Las muestras produjeron un producto aproximadamente 800 pb.

11. Se identificaron 6 especies de Lutzomyia entre los 159 flebotomineos
recolectados.
56
46
24 20 2 1 10
0
10
20
30
40
50
60
L.evansi
L.
cayennensis
cayennensis
L.
trinidadensis
L.atroclavata
L.gomezi
L.dubitans
Lutzomyia
spp
159 Especies de Lutzomyia

12. Se ha colectado especimenes de Lutzomyia cayennensis cayennensis
infectados con promastigotes no identificados.
Se demuestra por primera vez para la region de Los Montes Maria, la
ocurrencia de parasitos tripanosomatideos en Lu. cayennensis
cayennensis.
En Los Montes Maria una de las especies flebotomineas mas
abundantes dentro del domicillios es Lu. evansi, seguido por Lu.
cayennensis cayennensis.
Este flebotomineo desempeña algun papel en el mantenimiento del
ciclo de transmision de la enfermedad.