Diagnóstico e Innovación: Extracción y Purificación del DNA
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Farmacogenética del gen DPYD en pacientes en tratamiento con 5 Fluoruracilo
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Diagnóstico e Innovación: Extracción y Purificación del DNA
- 1. DIAGNÓSTICO e INNOVACIÓN: EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA DNA CIRCULANTE POLIMORFISMOS DPYD: 5-FU José Antonio Castellano (FIR-2) Análisis Clínicos HUGCDN 25/02/2015
- 2. I. EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA II. DNA TUMORAL CIRCULANTE (ctDNA) III. APLICACIONES: 5-Fluoruracilo - Polimorfismos DPYD
- 3. Medicina Personalizada Estrategias: Prevención, Diagnóstico y Tratamiento Avances, Técnicas y Abordajes. Desarrollo de la Farmacogenética y Farmacogenómica. (EMA) Conocimiento del Genoma Humano para: •Comprender bases moleculares: respuesta variable al tratamiento. •Identificar nuevas dianas terapéuticas
- 4. Un poco de historia… www.454.com
- 5. I.EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DEL DNA • Primera etapa de la mayoría de los estudios de Biología Molecular • Permite obtener ácidos nucleicos purificados a partir de diferentes fuentes • Esencial para realizar metodologías como: PCR cualitativa (1ª G) PCR cuantitativa indirecta (RT-PCR) (2ª G) PCR cuantitativa absoluta (PCR digital/ BEAMing) (3ª G) Secuenciación clásica ( SANGER) Pirosecuenciación Epigenética (Metilación del DNA) MLPA a-CGH Next Generation Sequencing (NGS)….
- 6. Bloque Tumoral Tejido Tumoral “gold standard” (Biopsia ó Citología) Suero o plasma Sangre Total Esputos o exudados bronquiales (poca celularidad) Orinas y otros líquidos biológicos Heces Muestras (5 μm) Selecciónm uestra Desparafi- nación Extracción ADN Observación por A.P. TEJIDO TUMORAL: IMPORTANCIA DE UNA BUENA SELECCIÓN DE LA MUESTRA TIPOS DE MUESTRA: Xileno + Etanol 56ºC 10 min aprox.
- 7. Métodos de Extracción A) MANUALES ó AUTOMATIZADOS B) SEGÚN TIPO DE SEPARACIÓN: 1. Basados en soluciones: (Método Fenol-Cloroformo, Guanidina tiocianato) 2. Basados en columnas cromatográficas: • Cromatografía INTERCAMBIO IÓNICO • Cromatografía ADSORCIÓN • Partículas MAGNÉTICAS www.cultek.com Sales caotrópicas (cloruro de guanidinio, urea y tiourea)
- 8. Características cobas® DNA SP Tamaño corte tejido Sección de 5µm % celulas tumorales ≥25% / 10% Proceso aislamiento Totalmente definido Tiempo aislamiento 3 horas Extracción ácidos nucleicos Alta Extracción ADN Alta Co-purificación RNA Baja EXTRACCIÓN MANUAL DE DNA REACTIVOS: -DNA TLB: Tampón Tris-HCl, , Triton x-100, KCl, EDTA, azida sódica. -PK (PROTEINASA-K) -DNA PBB: Tampón Tris-HCl ,Hidrocloruro de guanidina,urea, Triton x-100 . -WB I: Tampón Tris-HCl + 64% guanidina-HCl -WB II: Tampón Tris-HCl + NaCl -DNA EB: Tampón Tris-HCl + azida sódica (hiposalino), también H2O www.cultek.com
- 9. EXTRACCIÓN AUTOMATIZADA DE DNA MagnaPure Compact ROCHE® Características: -Diferentes tipos de muestra: tejido, suero, sangre, plasma… -Trabajar 1-8 muestras simultáneamente. -Posibilidad de elegir volúmen de elución (100-400 uL) -Menor tiempo de extracción (35-50 min, según protocolo) -Mayor protección para el operador: (Menor toxicidad reactiva) : Filtro HEPA y descontaminación UV incorporado BOLAS MAGNÉTICAS
- 10. Cuantificación del ADN mediante espectrofotometría Cociente de pureza: A260/A280 = 1,8-2,0 Interferencias: Proteínas /DNA Nanodrop 2000 (Thermo) Rango dinámico 2 ng/uL-15000 ng/uL Cociente de pureza: A260/A230 = 2,2 Interf.: HC, Péptidos, Fenoles, Comp. aromáticos…
- 11. ETAPAS: 35 ciclos 1.Desnaturalización (94-96ºC) 1-5 minutos 2.Hibridación (45-72ºC) Unión de cebadores. Si aumentamos Tª, aumenta Especificidad de unión. También modificar el tiempo mejora la Sensibilidad/Especificidad. 3.Extensión (72ºC) 2-5 minutos aprox. Depende del tamaño a amplificar (Act. Polimerasa) REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) PCR MIX Buffer Primers DNA molde dNTP’s (dATP,dGTP,dCTP,dTTP) Taq polimerasa MgCl2 (Cofactor Taq polimerasa) PCR MIX Buffer Primers DNA molde dNTP’s (dATP,dGTP,dCTP,dTTP) Taq polimerasa MgCl2 (Cofactor Taq polimerasa)
- 12. 1ª G. 2ª G. 3ª G.. Muestra con “Azul de Bromofenol” Agarosa 1-3 % Tampón TBEX Bromuro de Etidio Agarosa 1-3 % Tampón TBEX Bromuro de Etidio
- 13. II. DNA Tumoral Circulante ctDNA >75% ctDNA detectable en Ca AVANZADO : (Páncreas,ovario,CCR,vejiga,gastroesofágico,mama,melanoma, hepatocelular y de cabeza y cuello) 50%-70% ctDNA detectable en tumores LOCALIZADOS: (CCR,gastroesofágico,páncreas ymama) < 50% ctDNA detectable en tumores PRIMARIOS: (cerebro, renal, próstata o tiroides)
- 16. OTRAS UTILIDADES DEL DNA CIRCULANTE: DPNI: Diagnóstico Prenatal No Invasivo EN 1997 SE PRODUCE UN HITO EN EL USO DEL DNA CIRCULANTE, ES EL COMIENZO DE LA UTILIZACIÓN DE ADN FETAL EN EL DIAGNÓSTICO PRENATAL NO INVASIVO (Dennis Lo y cols, The Lancet,vol 350,issue 9076; 16 Agosto 1997, pp:485-487) A partir de sangre periférica materna posibilidad de realizar diagnósticos: -Sexo (gen SRY y DYS14) -Aneuploidías ( cromosomas X,Y,21,18, 13) -RH (exones 5,7 y ocasionalmente exón 10 del gen RhD) -Enfermedades monogénicas (Huntington, Distrofia Miotónica, FQ, b-Talasemia…)
- 17. III. APLICACIONES: 5-Fluoruacilo-DPYD Tumores sólidos: Colon, mama, piel (uso tópico) ,esofágico, estómago,hepatocarcinoma, cabeza y cuello Mecanismo de acción: Antimetabolito antagonista de pirimidinas (Fase S de la síntesis de DNA). Otros: Gemcitabina, Citarabina, Tegafur, Hidroxiurea, Procarbazina… Conocer la variación genética implica poder predecir la actividad enzimática y poder evitar efectos secundarios en el paciente tratado.
- 18. ADMINISTRACIÓN ORAL 5 FU (PROFÁRMACO)
- 19. FOLFOX-4: 5-FU + Leucovorin + Oxaliplatino (2 días consecutivos) FOLFIRI: 5-FU + Leucovorin + Irinotecan Regimen de dosis: Irinotecan [180 mg/m2 IV 90min] + Leucovorin [400 mg/m2 IV 120 min] + 5 FU [ bolus 400-500 mg/m2 ] y 5 FU [2400-3000 mg/m2 IV 46 h] Otras combinaciones: XELIRI: Capecitabina + Irinotecan + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 80%) XELOX: Capecitabina + Oxaliplatino + Bevacizumab (Supervivencia 6 meses 74%) PRESENTACIONES IV DE 5 FU:
- 20. Metabolismo 1. DPD= Dihidropirimidina Dehidrogenasa . 80-85% 5-FU administrado se degrada con DPD 2. TS= Timidilato Sintasa 3. MTHFR= Metilentetrahidrofolato Reductasa MTHFR
- 21. Reacciones adversasReacciones adversas RespondedoresRespondedores No respondedoresNo respondedores POBLACIÓN TRATADA CON 5-FU
- 22. EFECTOS SECUNDARIOS 5-FU •DIARREA •Náuseas y vómitos ocasionales •Pérdida de apetito, gusto metálico, llagas. •Fotofobia •Inflamación, Dolor. (lugar de punción) •Dermatitis, Alopecia •Leucopenia •Anemia y/o hemorragias (rectales) •Sequedad, agrietamiento, descamación de la piel •Eritrodisestesia palmo-plantar (EPP): Erupción cutánea, hinchazón, enrojecimiento, dolor y descamación •Dolor torácico (casos graves)
- 23. POLIMORFISMOS DPYD Nombre SNPs Mecanismo Implicaciones Observaciones DPYD*2A (IVS14+1G>A, rs3918290) Transición de G>A que provoca la delección del exón 14 “SPLICING” Toxicidad letal (4 veces) en pacientes con dosis habituales de 5 FU Constituye 50% alelos no funcionales conocidos Evidencia científica 1A DPYD*13 (rs55886062) Transición de: A >T (Ile560Asn) A >C (Ile560Ser) Exón 13 Aumenta toxicidad en: heterocigóticos (*1/*13) Toxicidad muy grave: Heterocigóticos(*2/*13) Homocigóticos(*13/*13) Evidencia científica 1A Mutación missense rs67376798 A (T funcional) (D*949V, 2846A>T) Transición de T>A (Asp949Val) Exón 22 Toxicidad grave en pacientes con este alelo mutado Evidencia científica 1A Mutación missense GEN DPYD (OMIM 612779): Gen con 4399 nucleótidos repartidos en 23 exones de codificación para la DPD que abarca 950 kb en el cromosoma 1p22. Existen al menos 30 mutaciones donde 20 son funcionales para el gen DPYD www.pharmgkb.org Otras: DPYD*9A *9B(T85C), rs1801158, rs1801159, rs1801160, DPYD*5 hasta un total 11 mutaciones del gen DPYD.
- 24. ¿Existen diferencias en los Polimorfismos DPYD según la raza? 5 grupos étnicos (N=288): Koreanos, Japoneses, Chinos, Afroamericanos y americanos de origen europeo. Se observaron similitudes entre la población asiática y diferencias en los SNPs respecto a los Afroamericanos y Europeos: -DPYD*9 (raro en asiáticos) -DPYD*2A (mayor en Africanos)
- 25. ¿Qué hacemos? - RT-PCR sondas Fluorescentes (TaqMan,SYBR Green) - 3 polimorfismos-SNPs: DPYD*2A, DPYD*13 y rs 67376798 Wild typeWild type Heterocigótico (3%)Heterocigótico (3%) Homocigótico mutado (0.1%)Homocigótico mutado (0.1%)
- 26. ¿Y cómo sería el informe de los resultados?
- 27. Medicina Personalizada: Guía de actuación clínica
- 28. CONCLUSIONES •Conocer la variación genética implica poder predecir la actividad enzimática • Existen muchas variantes, en especial SNPs, “single nucleotide polymorphisms” que nos obligan a ser precisos en el diagnóstico. •La aparicón de nuevas tecnologías nos ayuda a disminuir el tiempo de respuesta en los resultados, realizar varios pacientes y polimorfismos simultáneamente y una importante reducción en los costes. •Evitamos la administración de terapia ineficaz o que se produzcan efectos secundarios en el paciente (medicina personalizada)
- 29. GRACIAS POR SU ATENCIÓN
Notas del editor
- Pag 151 EMA European Medicines Agency. Utilizar nuestro conocimiento del genoma humano para comprender bases moleculares de la respuesta variable de los pacientes a un mismo tratamiento y por otra parte identificar nuevas dianas terapéuticas mediante el uso de herramientas genómicas de análisis masivo
- Watson y Crick 1953 Estructura tridimensional del ADN Desde que en 1977 Sanger (Bioquímico Inglés) descubriera una base química para poder obtener la secuencia de ADN, esta técnica ha ido evolucionando hasta nuestros días. Esta técnica en combinación gfcon el descubrimiento de la reacción en cadena de la polimerasa descubierta en 1983 por el americano Kary Mullis mediante el empleo de Thermus aquaticus como polimerasa de secuenciación taqpolimerasa y la secuenciación del genoma humano proyecto que llevó 13 años y más de 3000 millones de dólares, ha permitido obtener las bases para ya en 2005 publicar una nueva tecnología desarrollada por la compañía 454 life sciences, comienza la era de la NGS ( Next Generation Sequencing)
- Multiplex Ligation – dependent probe amplification. Variante de la PCR donde sucede una fijación de la estructura a analizar con amplificación de múltiples sondas dispuestas en un único par de cebadores.
- Por ello, la extracción de los ácidos nucleicos de la muestra toma un papel crítico y fundamental. Aunque en los últimos años se han hecho grandes progresos en la simplificación de la extracción y purificación de los ácidos nucleicos de muestras clínicas, todavía no se ha encontrado un método automático universal que se pueda utilizar con cualquier tipo de muestra.
- Cromatografía Pueden emplearse diversas técnicas cromatográficas de separación: permeación sobre gel, intercambio iónico, adsorción selectiva o unión por afinidad. La permeación sobre gel aprovecha las propiedades de las partículas porosas del gel para tamizar moléculas. Se emplea una matriz con poros de tamaño definido, que dejan pasar las moléculas más pequeñas por difusión, pero no las más grandes, que quedan eluidas en el volumen vacío. Así pues, las moléculas quedan eluidas por orden de tamaño decreciente. La cromatográfica de intercambio iónico es otra técnica, que se basa en la interacción electrostática de la molécula diana con un grupo funcional de la matriz en columna. Los ácidos nucleicos (polianiones lineales con fuerte carga negativa) pueden eluirse de las columnas de intercambio iónico con simples Tampones salinos. En la cromatografía de adsorción, los ácidos nucleicos se fijan selectivamente en sílice o vidrio, en presencia de determinadas sales (por ejemplo, sales caotrópicas), mientras que otras moléculas biológicas no se fijan. A continuación, los ácidos nucleicos pueden eluirse con agua o un tampón hiposalino y se obtiene una muestra que puede emplearse directamente en las aplicaciones posteriores.
- La figura 3 ilustra cómo se libera el ADN genómico cuando el detergente captura los lípidos y las proteínas al entrar en contacto la membrana celular y el tampón de extracción con CTAB. Con una concentración salina (NaCl) determinada, el detergente forma un complejo insoluble con los ácidos nucleicos. El EDTA es un componente quelante, que se une al magnesio, entre otros metales. El magnesio es un cofactor de la desoxirribonucleasa. Al unir el magnesio al EDTA, la actividad de la desoxirribonucleasa presente disminuye. El Tris-HCl confiere a la solución la capacidad de amortiguar el pH (un pH inferior o superior daña el ADN). Es importante señalar que, como los ácidos nucleicos se degradan fácilmente en esta fase de la purificación, debe reducirse al mínimo el tiempo transcurrido entre la homogeneización de la muestra y la adición de la solución tampón con CTAB. Una vez que se han roto las membranas de la célula y de los orgánulos (como los que se encuentran alrededor de las mitocondrias y los cloroplastos), se purifica el ADN. PBB = PARAFIN BINDING BUFFER Para extraer los ácidos nucleicos del material biológico es preciso provocar una lisis celular, inactivar las nucleasas celulares y separar los ácidos nucleicos de los restos de células. El procedimiento de lisis idóneo suele consistir en un equilibrio de técnicas y ha de ser suficientemente fuerte para romper el material inicial complejo (un tejido, por ejemplo), pero suficientemente suave para preservar el ácido nucleico diana. Entre los procedimientos usuales de lisis figuran los siguientes: rotura mecánica (trituración, lisis hipotónica, etc.); tratamiento químico (detergentes, agentes caotrópicos, reducción con tioles, etc.); digestión enzimática (Proteinasa K, . Para eliminar proteinas del medio Es posible romper la membrana celular e inactivar las nucleasas intracelulares al mismo tiempo. Por ejemplo, una misma solución puede contener detergentes que solubilicen las membranas celulares y sales caotrópicas fuertes que inactiven las enzimas intracelulares. Tras la lisis celular y la inactivación de las nucleasas, los restos de células se eliminan fácilmente por filtración o precipitación. Etapas en la extracción de ADN Los pasos necesarios para una correcta extracción y purificación del ADN mediante un procedimiento químico son: 1. Lisis de las células o virus. Las sales caotrópicas ayudan a romper la estructura tridimensional de macromoléculas como las proteínas o los ácidos nucleicos consiguiendo su desnaturalización. La adición de un detergente como el SDS es necesaria a menudo para eliminar las membranas. 2. Degradación de la fracción proteica asociada al ADN. Se consigue mediante la adición de una proteasa. La fracción proteica puede precipitarse mejor con la ayuda de sales como el acetato de amonio o el acetato sódico. 3. Purificación. Consta de 3 fases: • Precipitación del ADN. El ADN es insoluble en alcohol, por lo que se puede precipitar etanol frío o isopropanol i recuperar mediante una centrifugación. El alcohol del sobrenadante se llevará las sales añadidas previamente. • Lavado del pellet. Se realiza con alcohol frío volviendo a centrifugarse • Recuperación. El sedimento se puede resuspender en agua o tampón Tris tras ser secado completamente. La confirmación de la presencia de ADN se lleva a cabo mediante electroforesis en un gel de agarosa i posterior tinción con bromuro de etidio y observación con luz UV o directamente al espectrofotómetro mediante espectro de absorción de 200 a 350 nm. El ADN purificado se puede cuantificar con un espectrofluorímetro mediante el uso de fluoróforos específicos (Picogreen®, Molecular Probes) El paso 3 puede realizarse con la ayuda de minicolumnas equipadas con una membrana de sílica que retiene específicamente el ADN permitiendo el paso de las moléculas y sales que acompañan la reacción de lisis. Finalmente se lava con alcohol y se eluye el contenido
- Automatizar el procesamiento de 1 a 8 muestras co. Obtener ácidos nucleicos de alta calidad de diversos tipos de muestras con la química reactivo demostrado (ver figuras 1 y 2). Aproveche los protocolos a bordo para cada tipo de aislamiento de ácidos nucleicos. Elige la muestra y de elución diferentes volúmenes para una amplia gama de materiales de muestra (véanse las Figuras 3 y 4). Datos de la Documentación y muestras de pista utilizando el lector de código de barras. Ahorre tiempo y reducir al mínimo el riesgo de contaminación con precargadas reactivos y material desechable, movimiento escénico sincronizada, un filtro HEPA integrada y descontaminación UV. utiliza una tecnología magnética talón probada para el proceso de aislamiento. Esta tecnología se ha utilizado con éxito en todo el mundo para generar éxito de la investigación y numerosas publicaciones en los últimos diez años. La elección del protocolo de purificación de ácido nucleico depende del tipo de muestra y la aplicación específica. El MagNA Pure instrumentos compacto que incorpora una variedad de protocolos experimentales usando diferentes cantidades de muestras (100 - 1000 l) y los volúmenes de elución (50 a 200 mu l) a partir de una amplia variedad de materiales de muestra (sangre, células de la sangre, suero, plasma, tejido, o células cultivadas). Magna Kits puro Aislamiento compactoTodos los kits de aislamiento contienen reactivos que se precargada en cartuchos sellados optimizados, eliminando reactivo confusión o contaminación. La Herramienta de Perforación suministrado penetra las juntas del cartucho durante el protocolo de purificación. Los Consejos de reacción y la Herramienta de Perforación se entregan en Tip bandejas que se puede colocar fácilmente en el instrumento. Software Easy-de seguir guía al usuario a través de la configuración del instrumento. Este software se ejecuta en un ordenador personal integrado operado por un monitor de pantalla táctil y un lector de código de barras para facilitar la entrada de datos y la documentación. El código de barras del cartucho de reactivo contiene la información sobre el kit de aislamiento utilizado (por ejemplo, el nombre del equipo, fecha de vencimiento). Al entrar en este código de barras conduce a una selección previa de los protocolos para el kit de aislamiento correspondiente y los volúmenes de muestra y elución seleccionados. Ejecute documentación se puede guardar, imprimir con una impresora externa, o encaminado a través de la conectividad host. El aislamiento eficiente de ADN a partir de diversos tejidos es crucialen, por ejemplo, el análisis de mutación o cuantificación de genes. RocheCiencias Aplicadas ha desarrollado nuevos kits y protocolos parael aislamiento automatizado de ADN genómico utilizando el MagNASistema Lyser y el Sistema Compacto pura Magna.El MagNA Lyser (Figura 1a) es un pequeño instrumento de sobremesaque permite la homogeneización eficiente de hasta16 muestras de tejido dentro de sólo unos pocos segundos. Se basaen una tecnología de perlas-late, y utiliza desechable de 2 mltubos con cuentas de cerámica que se agita vigorosamente,con un máximo de 7.000 rpm para interrumpir el tejido.El sistema compacto Pure MagNA consiste en un sistema totalmente automatizadosobremesa instrumento (Figura 1b) y listo para el usokits de aislamiento de ácidos nucleicos con cartuchos precargadas,permitiendo el aislamiento automatizado de los ácidos nucleicos 1 a 8muestras dentro de 25-40 minutos. El sistema tiene un sistema integradoordenador de pantalla táctil y un lector de código de barras. ellacomprende el seguimiento completo de la muestra y líquido, coágulo, y la puntadetección.La combinación de los dos resultados de los sistemas de una forma rápida yproceso eficiente, permitiendo el aislamiento de ADN a partir de diversosmuestras de tejido en menos de una hora con mínimomanos a la vez. El MagNA Pure instrumentos compacto es una solución óptima para la automatización rápida y fácil de purificación de ácidos nucleicos a partir de un pequeño número de muestras. Se lleva a cabo la purificación de ácidos nucleicos 1 a 8 a partir de una amplia variedad de materiales de muestra (por ejemplo, la sangre de mamíferos, suero, plasma, o células) en 20 a 45 minutos (dependiendo del protocolo). El sistema es muy flexible en cuanto a los volúmenes de muestra y elución necesarios para obtener la concentración de ácido nucleico necesaria para cada aplicación. Las muestras se realiza un seguimiento y coágulos, punta-pérdida, los cartuchos y los volúmenes son reconocidos y controlados durante el tratamiento. Toda la información se guarda con fines de documentación.
- El ADN, el ARN, los oligonucleótidos e incluso los mononucleótidos pueden cuantificarse directamente en soluciones acuosas, en forma diluida o sin diluir, midiendo la absorbancia A (o densidad óptica, DO) de luz ultravioleta (también puede hacerse en el intervalo visible). Si la muestra es pura, es decir, no contiene cantidades significativas de contaminantes como proteínas, fenol o agarosa, la medición espectrofotométrica de la irradiación ultravioleta absorbida por las bases es sencilla y exacta. En este método, los tampones acuosos con escasa concentración iónica (por ejemplo, tampón TE) resultan idóneos. La concentración de ácidos nucleicos suele determinarse midiendo a 260 nm y comparando con un blanco. La interferencia de contaminantes puede determinarse calculando un «cociente». Dado que las proteínas absorben a 280 nm, se emplea el cociente A260/A280 para calcular la pureza de los ácidos nucleicos. Los cocientes respectivos del ADN y el ARN puros son aproximadamente de 1,8 y 2,0. Una absorción a 230 nm significa que la muestra está contaminada con hidratos de carbono, péptidos, fenoles, compuestos aromáticos u otras sustancias. El cociente A260/A230 de las muestras puras es de 2,2 aproximadamente. Cuando la cantidad disponible de ácidos nucleicos es escasa, puede emplearse el método de la placa de agarosa con bromuro de etidio. Permite calcular la cantidad de ácidos nucleicos a partir de la intensidad de la fluorescencia emitida por el bromuro de etidio irradiado con luz UV, comparándola con unos patrones de concentración. Una característica del ADN es que absorbe la luz ultravioleta (UV) a 260 nm y permite estimar su concentración mediante es- pectrofotometría. Cuando la longitud de la celda en que se disuelve el ADN, es de 1 cm, la absorbancia es igual a la densidad óptica (DO). En el caso de ADN genómico o de doble cadena, una densidad óptica equivale a 50 ug/ml (Leninger 1975). Se debe considerar el factor de dilución para obtener la con- centración en nanogramos/microlitro (ng/ul). En el caso de algunos equipos como el espectrofotómetro Nanodrop, no es necesario diluir la muestra y el equipo nos proporciona directamente la concentración en ng/ul. Considerando que para una reacción de PCR se requieren de 10 a 200 ng debemos obtener al menos, 5 ng/ul de ADN en cada muestra, si se recuperaron 50 ul, el rendimien- to neto de la extracción sería de 0.25 ug. Concentraciones menores dificultan la estandarización de la PCR u otras técnicas.
- La detección de ADN circulante tumoral en los pacientes con cáncer representa una nueva alternativa no invasiva para llevar a cabo no sólo un diagnóstico molecular, sino también como método para valorar el pronóstico y para monitorizar la enfermedad. Es lo que los autores del artículo han denominado “biopsias líquidas”. Teniendo en cuenta que ha sido demostrado que parte del ADN circulante en el plasma de los pacientes con cáncer tiene su origen en el tumor y que muchas de las alteraciones encontradas en el tumor se detectan también en el plasma, parecería lógico pensar en caracterizar en el ADN circulante tumoral todas aquellas alteraciones moleculares que a día de hoy representan marcadores pronósticos y predictivos bien establecidos, así como buscar nuevos marcadores tumorales. Además, el interés por el estudio del ADN circulante tumoral no sólo se centra en su posible valor pronóstico y predictivo, sino que también podría ser una herramienta que contribuya al diagnóstico, en la medida que ciertas alteraciones se asocian con determinados tipos de tumores y tienen una prevalencia tal que su presencia pueda considerarse un signo inequívoco que permita confirmar la presencia de un tipo concreto de tumor. El hecho de que múltiples técnicas de laboratorio que se utilizan hoy en día (PCR digital, secuenciación masiva de última generación, etc) sean capaces de detectar y cuantificar cantidades extremadamente pequeñas de ácido nucleicos circulantes y de sus alteraciones, hace que merezca la pena seguir profundizando en el estudio del ADN circulante tumoral. El análisis de dichas alteraciones en este material de partida podría abrir una nueva vía para caracterizar alteraciones con valor diagnóstico, pronóstico y predictivo, con la ventaja de ser una técnica mínimamente invasiva para el paciente, ya que solo requeriría una extracción de sangre. El ADN circulante lo constituyen fragmentos de entre 180 y 200 pares de bases, los cuales son liberados al torrente sanguíneo mediante dos mecanismos principales no necesariamente excluyentes: una fuente pasiva, derivada de células que mueren por fenómenos de necrosis y/o apoptosis
- Para qué se utiliza el 5-fluorouracilo: Cáncer de colon y recto. Cáncer de mama. Cánceres del aparato digestivo, como: Anal, esofágico, pancreático y gástrico (estómago). Cáncer de cabeza y cuello. * Hepatoma (cáncer hepático). Cáncer ovárico. Uso tópico (crema o solución) en el cáncer de piel de células basales y queratosis actínica. (Vea el documento &quot;5-fluorouracilo [crema]&quot;
- Cobas z480 Amplificación y detección. Resultados: Homocigoto wild type Heterocigoto ( 1 alelo mutado y 1 alelo normal) (3%) Homocigoto mutado ( 2 alelos mutados) grave. (0.1%)