es hermoso

1. TECNICAS MOLECULARES EN EL
ESTUDIO DE HLA (SSO – SSP)
Lic. T.M. Arturo Arzapalo
HNERM
SERVICIO DE BANCO DE ORGANOS
Y LABORATORIO DE HISTOCOMPATIBILIDAD

2. POLIMORFISMO DE HLA
SISTEMA HLA PRESENTA ALTO
GRADO DE POLIMORISMO
(PRESENCIA DE MULTIPLES ALELOS
EN UN LOCUS)

3. TIPIFICACION DE HLA MOLECULAR
HLA SEROLOGICO
ESTUDIO FENOTIPICO
MICROLINFOCITOTOXICIDAD
MEDIADA POR COMPLEMENTO
HLA MOLECULAR
ESTUDIO GENOTIPICO
PCR- SSO
PCR- SSP
PCR- SBT
A DIFERENCIA DE LOS METODOS SEROLOGICOS LOS METODOS
MOLECULARES PERMITEN ESTUDIAR LAS MULTIPLES
DIFERENCIAS ALELICAS DEL HLA

4. SEROLOGIA
MOLECULAR
POLIMORFISMO
SEROLOGICO
POLIMORFISMO
GENETICO

5. NOMENCLATURA – HLA MOLECULAR

6. ENFERMEDAD INJERTO CONTRA HUESPED EICH
– GVHD
• COMPLICACION DE MAYOR
IMPORTANCIA EN EL TRASPLANTE
ALOGENICO DE CELULAS MADRE:
(LEUCEMIAS, LINFOMAS, APLASIA..)
• UNA AFECCIÓN EN LA CUAL LAS
CÉLULAS DEL DONANTE ATACAN A
LOS TEJIDOS DEL RECEPTOR
• LOS ANTIGENOS DE HISTOCOMPATIBILIDAD (HLA) ESTAN
INVOLUCRADOS EN EL RECHAZO DEL INJERTO CONTRA EL HUESPED
• ES NECESARIO ENCONTRAR UN DONANTE COMPATIBLE “HLA
IDENTICOS”

7. 1 2
Exon 2
Exon 4
3
Leader
Exon 1
Exon 3

8. POLIMORFISMO – HLA A

9. POLIMORFISMO – HLA B

10. POLIMORFISMO – HLA C

11. 1 2
Exon 2
Leader
Exon 1
Exon 3

12. POLIMORFISMO – HLA DR

14. TIPIFICACION POR PCR-SSO
• SSO (Oligonucleotido de Sequencia Especifica)
– Son SONDAS complementarias al ADN objetivo
– ADN amplificado por PCR se hibridiza con SONDAS de SSO.
– Pueden llegar a resolucion generica o intermedia.
– De Alto rendimiento.
GARANTIZAN LA DISCRIMINACION ENTRE LA SECUENCIA DEL
ADN OBJETIVO (ALELO) Y OTRO ESTRECHAMENTE
RELACIONADO.

15. SECUENCIA DEL PCR - SSO
AMPLIFICACION
GENERICA DEL LOCUS A,
B Y DR
EXTRACCION DE
ADN
HIBRIDIZACION CON
SONDAS ESPECIFICAS
PARA LOS ALELOS
POLIMORFICOS DE HLA
DESNATURALIZACION
DEL MOLDE DE ADN
EN CADENAS SIMPLES
IDENTIFICACION
USANDO UN
CONJUGADO
UNIDO A UNA
ENZIMA O
FLUOROCROMO

16. PRIMER GENERICOS

17. SONDAS
3’ 5’
SONDA
SOPORTE
SE ENCUENTRAN UNIDOS A
UN SOPORTE Y SON
ESPECIFICOS PARA UN
ALELO DE HLA
SOPORTE SOLIDO:
- PERLAS DE LUMINEX
- MEMBRANA DE NYLON
- TIRAS DE NITROCELULOSA
- PLACAS DE
MICROTITULACION
- MICROCHIPS
PERLAS DE LUMINEX

18. ESPECIFICIDAD DE LAS SONDAS
DETECCION DE SECUENCIAS ESPECIFICOS POR
HIBRIDIZACION CON SONDAS
SONDA
LAS SONDAS PERMITEN LA DETECCION DE ALELOS ESPECIFICOS POR
HIBRIDIZACION

19. AMPLIFICACION
SE REALIZA LA PCR
USANDO PRIMERS
GENÉRICOS PARA LOCUS
A, B, DR
LOCUS A y B EXON 2 y 3
LOCUS DR EXON 2
LOS PRIMERS ESTAN
MARCADOS CON
BIOTINA
EXON
B
B
PRIMER
GEN HLA (ADN)
ADN
amplificado
B Biotina
5’ 3’

20. DESNATURALIZACION - HIBRIDIZACION
EL ADN SE DESNATURALIZA
PARA OBTENER CADENAS
SIMPLES DE ADN
LAS SONDAS SE UNEN A LA
SECUENCIA COMPLEMENTARIA
DEL ADN
CADA SONDA ES ESPECÍFICA DE
UNA SECUENCIA POLIMORFICA
(ALELO)
PERO ESTA SECUENCIA PUEDE
SER COMPARTIDA POR
DIFERENTES ALELOS
B
5’ 3’
ADN
amplificado
5’ 3’
3’ 5’
SONDA
B Biotina

21. DETECCION
SE USA CONJUGADO
ESTREPTAVIDINA
MARCADO CON:
FLUOROCROMO:
FLUORESCENCIA
ENZIMA + SUSTRATO:
COLORIMETRIA
DNA
amplificado
Fluorocromo
Estreptavidina
5’ 3’
3’ 5’
SONDA
Biotina
B

22. TECNOLOGIA LUMINEX
PERLAS +
SONDAS

23. TIPIFICACION POR SSP
• PCR-SSP :ES UN METODO QUE USA PRIMERS DE SECUENCIA
ESPECIFICA QUE PERMITIRA AMPLIFICAR SOLO ALELOS
ESPECIFICOS
• INVOLUCRA DISEÑO CUIDADOSO DE PRIMER, DONDE EL
EXTREMO 3’ DEL PRIMER COINCIDA SOBRE EL NUCLEOTIDO
DE LA SECUENCIA POLIMORFICA A SER ANALIZADO (ALELO)
• ES UNA PRUEBA RAPIDA
• DE BAJO RENDIMIENTO

24. FUNDAMENTO
LA AMPLIFICACION OCURRIRA SOLO SI EL EXTREMO 3’
DEL PRIMER COINCIDA PERFECTAMENTE AL ALELO
POLIMORFICO
X
EL PRIMER DE SECUENCIA ESPECIFICA (SSP) QUE TERMINA EN AGTACT AMPLIFICARA SOLO AL
MOLDE QUE PRESENTA LA SECUENCIA COMPLEMENTARIA
LOS RESULTADOS SON DETERMINADOS DIRECTAMENTE POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA

25. SECUENCIA DEL PCR - SSP
LOS AMPLICONES SON ANALIZADOS
POR ELECTROFORESIS EN GEL DE
AGAROSA
AMPLIFICACION DE ADN EN
UNA PLACA DE 96 POZOS
EXTRACCION DE ADN
ANALISIS DE DATOS:
POZOS QUE NO POSEEN
ALELOS
COMPLEMENTARIOS DEL
PACIENTE TENDRAN UNA
SOLO BANDA DE CONTROL
DE AMPLIFICACION
ANALISIS DE DATOS:
LAS MUESTRAS PRODUCIRAN 2
PRODUCTOS DE PCR (CONTROL Y
ALELO ESPECIFICO) SOLO EN
AQUELLOS POZOS Q CONTINEN EL
PRIMER COMPLEMENTARIO AL
ALELO DE HLA EN LA MUESTRA
CADA POZO DE REACCION CONTIENE
UNA MEZCLA DE PRIMERS DE
SECUENCIA ESPECIFICA Y UN
PRIMER CONTROL DE AMPLIFICACION

26. ELECTROFORESIS
SE USA BROMURO DE ETIDIO O SYBER GREEN
UNA REACCION POSITIVA: SI HAY AMPLIFICACION
DE UN ALELO DE HLA ESPECIFICO
SIEMPRE VISIBLE UNA BANDA DE CONTROL
INTERNO COMO CONTROL DE UNA
AMPLIFICACION SATISFACTORIA
LA AUSENCIA DE AMPLIFICACION DE CUALQUIER
POCILLO PUEDE ANULAR LOS RESULTADOS DE LA
PRUEBA

27. ANALISIS DE DATOS
CONTROL
NEGATIVO
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12

28. ANALISIS DE DATOS
HLA MOLECULAR
A*02XX
XX: 020101
020102….
???¿¿¿¿¿

29. SSO - SSP
SSO SSP
TECNOLOGIA BASADA EN LA
AMPLIFICACION DE PCR CON
HIBRIDIZACION CON SONDAS
ESPECIFICAS
UTILIZA PRIMER ALELO ESPECIFICOS
SON ESPECIFICO PARA UN DETERMIANDO
ALELO POLIMORFICO
USA SOFTWARE PARA SU
INTERPRESTACION SE REALIZA EN 10
HORAS (DOS DIAS)
ANALISIS SENCILLO Y RAPIDO USANDO
ELECTROFORESIS PARA LA OBSERVACION
(2 HORAS)
BAJA E INTERMEDIO RESOLUCION BAJA Y ALTA RESOLUCION
NECESITA 20 ng de ADN NECESITA 100 ng DE ADN
SE TRABAJA VARIAS MUESTRAS A LA VEZ SE TRABAJA POR MUESTRAS
INDIVIDUALES

30. GRACIAS