Tecnica MLPA

1. MLPA
Multiplex ligation-
dependent probe
amplification
Dra. Samantha González Ávila
Residente de Primer año de
Genética Médica
Laboratorio de Biología Molecular

3. Introducción
Variante de PCR
Amplificar diferentes fragmentos
de DNA (sondas ligadas)
En una misma reacción mediante
un solo par de cebadores y bajo
las mismas condiciones de ciclos
de temperatura
Se pueden amplificar regiones
génicas cercanas o
adyacentes con la finalidad de
determinar con certeza la
dosis génica en muestras de
DNA de pacientes con
mutaciones como deleciones o
duplicaciones grandes en
estado heterocigoto,
homocigoto o hemicigoto

4. Fundamento
Utiliza sondas de dos oligonucleótidos que reconocen sitios
adyacentes en el DNA
Cada región a analizar posee dos hemisondas con secuencias
inmediatamente adyacentes
Ambas sondas poseen una región de unión al primer (forward y
reverse) y solo una posee una secuencia de identificación
Todas las sondas que diseñemos para los targets utilizan un único
par de primers para la amplificación de todas las secuencias

5. Pasos: Desnaturalización
Hibridación
Ligacion
Amplificación
(PCR)
Separación de
fragmentos
Análisis de datos

6. Pasos:
Desnaturalización:
• 98°C durante 5 min
Incubar con sondas de hibridación:
• Se deja durante 1 min a 95 °
16 horas a 60°C

7. Pasos:
Ligación:
• Adicionar ligasa master mix (buffer de ligasa y ligasa 65 que es termoestable)
Se incuba 15 min a 54°C
Para inactivar, poner a 98° durante 5 min. ( para que se termine la ligación)
Si encuentra alguna alteración en la
hibridación no liga

8. Pasos
Amplificación por PCR:
• Se añade otro master mix de la polimerasa
• Cebador Forward ( con fluorocromo)
• Cebador reverse
• dNTPs
• Los primers no amplifican secuencias diana
• Cantidad de producto ligado es medida del numero de secuencias diana

9. Pasos
Separar los fragmentos por tamaño
• Como se añadió el fluorocromo que viene en la amplificación se puede
diferenciar y cuantificar en la electroforesis capilar
• También hay marcador de peso molecular
• Amplicones y el cargador de peso molecular tienen fluorocromos
diferentes

11. Análisis de MLPA
El análisis de los datos requiere varios pasos
Normalización de los datos: compara cada dato de la
muestra con datos de muestra de referencia
Intranormalización: esas intensidades absolutas que
se observan en el electroferograma se van a
convertir en valores relativos para poderlos comparar
con las muestras de referencia
Calcula asi una relación para cada sonda en cada
muestra
Se visualiza la intensidad de señal de cada sonda de
la muestra en el ratiochart
MRC-Holland desarrolló Coffalyser.net

14. Interpretación de resultados
Una disminución en el área de la señal indica deleción, al contrario un
incremento en el área de señal indica aumento del número de copias
Las deleciones o duplicaciones en heterocigosis producen una reducción o
aumento de la señal del 25% al 50% aprox de lo esperado para cada sonda
Cuidad con la interpretación de las deleciones o duplicaciones en
hemicigosis del cromosoma X en el varón
En ocasiones la interpretación es complicada y obliga a repetir el ensayo.
Cuidado con las deleciones o duplicaciones de una sola sonda

15. Como reconocer la calidad de la
muestra
Fragmento estándar: Es con el cual se hacen la comparación de todo lo demás

16. Permiten conocer si la cantidad de DNA fue adecuada

18. Va a determinar si la desnaturalización del DNA fue completa

20. Identificar si es femenino o masculino

22. ¿Cómo resolver los posibles
problemas?

23. ¿Cómo resolver los posibles
problemas?

24. ¿Cómo resolver los posibles
problemas ?

25. Interpretación de resultados

26. Interpretación de resultados

27. Tener cuidado…

28. Tipos de MLPA
Según la técnica Técnica
clásica
Deleciones/Duplicaciones
Variantes puntuales
específicas
Variantes de
la técnica
MS-MLPA
RT-MLPA

29. Variantes de la técnica
MS-MLPA
• MLPA específico de
metilación
• Detectar alteraciones
epigenéticas
• Cambios en el patrón
de metilación del DNA
en genes concretos
RT-MLPA
• MLPA transcriptasa
reversa
• Cuantificar la cantidad
de mRNA sintetizados
por genes de interés
específicos
• Se inicia desde RNA
• Retrotranscripción

30. RT-MLPA MS-MLPA

31. Limitaciones
Resultados dependen de la calidad de la muestra que
se analiza
Cambios en la secuencia de DNA donde se une la
sonda del MLPA puede modificar el resultado
Desnaturalización inadecuada de la muestra se
asocia a falsas deleciones
No detecta: reordenamientos genómicos balanceados o
del/dup fuera de la región donde se une la sonda

32. Ejemplo

34. Referencias
• Pierce B; Genética, un enfoque conceptual, 2da edición, Panamericana.
• Mérida F. & Moreno E; Manual para técnico superior de Laboratorio Clínico y
Biomédico, Panamericana, 2015.
• Alecia S. Willis; Ignatia van den Veyver; Christine M. Eng (2012). Multiplex
ligation-dependent probe amplification (MLPA) and prenatal día
• Theophilus, Bimal D.M.; Rapley, Ralph (2011). [Methods in Molecular Biology]
PCR Mutation Detection Protocols Volume 688 || Multiplex Ligation-Dependent
Probe Amplification (MLPA®) for the Detection of Copy Number Variation in
Genomic Sequences. , 10.1007/978-1-60761-947-5(Chapter 8), 97–
126. doi:10.1007/978-1-60761-947-5_8gnosis. , 32(4), 315–
320. doi:10.1002/pd.3860

35. • No partes de un DNA total, si no de concentración 50-100 ng/ml
• Hibridacion dura mas porque son varias sondas