El documento describe la importancia del Laboratorio de Histocompatibilidad en la evaluación de la compatibilidad entre donantes y receptores de trasplantes. Explica los diferentes métodos utilizados como pruebas de anticuerpos preformados, tipificación HLA y detección de anticuerpos anti-HLA. También destaca la necesidad de correlacionar los resultados de laboratorio con la situación clínica del paciente para una adecuada evaluación del riesgo inmunológico.

1. Laboratorio de Histocompatibilidad.
Importancia y Aplicación Clínica
Autor: QFB Carmen Adalid Sáinz
28 de Septiembre 2018

2. Dr. Federico Juárez de la Cruz
Fundador del Dpto. de Trasplantes y
del Laboratorio de Histocompatibilidad.
Jefe del Programa de Trasplantes de la
UMAE No 71 del IMSS (1987 -2015)
Q.F.B. Magdalena Limones Avitia
Pionera en la introducción, desarrollo, y
organización del Laboratorio de
Histocompatibilidad. (1982 -2009)

3. • Valorar la compatibilidad antigénica
entre el receptor y el donante.
• Optimizar la supervivencia del injerto y
minimizar reacciones inmunológicas.

4. El MHC es una región de aproximadamente 4100 kb de DNA
localizada en el brazo corto del cromosoma 6

5. Está compuesto por genes altamente polimórficos.
Estos genes juegan un papel central en la respuesta inmune ya
que controlan la síntesis de moléculas proteicas que son
expresadas en la superficie de diferentes células del Sistema
Inmunológico; estas moléculas son también conocidos como
Antígenos de Histocompatibilidad.

7. En 1964, el Dr. Terasaki desarrolló la prueba de
microcitotoxicidad, una prueba de compatibilidad
entre donantes y receptores de trasplantes de
órganos que requirió solo 1 microlitro de antisuero
para identificar presencia de anticuerpos preformados
contra antígenos leucocitarios (HLA) del donante.
La prueba fue adoptada como estándar internacional
en el estudio de la teoría humoral del rechazo de
trasplantes.

8. Técnica basada en el estudio
inmunológico.
IgG1,
IgG3, IgM

9. Este estudio nos permite detectar
anticuerpos preformados anti HLA del
receptor que están en bajos títulos y que
debido a esto, no activan el complemento
mediante la técnica convencional.
La AGH, incrementa la sensibilidad de la
técnica al hacer puentes entre los
anticuerpos de bajo título unidos en la
superficie de la células.
Garantiza la activación del complemento,
revelando finalmente, una prueba positiva
que de otro modo sería un falso negativo,
esto predisponiendo tanto al rechazo
hiperagudo como al acelerado.

10. Como agente reductor, el DTT, rompe los
enlaces de la IgM pentamérica, haciéndola
monomérica y de esta forma inactivando su
capacidad de activar el complemento.
Esto nos permite discernir realmente entre
los anticuerpos anti HLA de isotipo IgM,
que no invalidan el trasplante, de los
anticuerpos preformados de isotipo Ig G
que sí lo invalidan.
DTT

11. Esta técnica detecta la presencia de anticuerpos
anti-HLA mediante el uso de anticuerpos
monoclonales conjugados con fluorocromos,
sin necesidad de que el complemento se fije. El
empleo de fluorescencia hace a esta técnica
mucho más sensible que la de la citotoxicidad
dependiente de complemento (CDC) clásica.
La citometría de flujo permite determinar si
existen anticuerpos anti-HLA y si van dirigidos
frente a antígenos de clase I o II.
Habitualmente se utiliza anti-CD3 para
identificar los linfocitos T y anti-CD19 o anti-
CD20 para identificar los linfocitos B.

12. La metodología de Citometría de Flujo permite su detección. Estos
anticuerpos se han descrito relacionados con el rechazo del injerto.
Se infiere su participación en pacientes que han perdido un injerto previo
con evidencias de rechazo humoral (p. ej., depósitos de C4d), sin que haya
sido posible demostrar anticuerpos anti-HLA.
En caso de ser positivos se pueden determinar los alelos MICA del donante
de origen, e intentar evitar en un nuevo donante los antígenos MICA contra
los que existen anticuerpos..
Sólo se expresa en células endoteliales, especialmente tras activación, por lo
que no se pueden detectar en una prueba cruzada convencional.

14. Una Prueba Cruzada positiva por cualquier metodología seleccionada, indica
la presencia de anticuerpos preformados y específicos contra las células del
donador.
Es conveniente que se correlacione con otros estudios de
histocompatibilidad adicionales para obtener un espectro diagnóstico más
amplio y concreto.
Cada paciente representa un diagnóstico y un esquema clínico de estudio
individual, que su médico tratante seleccionará en base a los criterios y
estrategias que amerite y que tenga a su disposición.

15. Los resultados deberán de correlacionarse clínicamente con otros parámetros:
Previa sensibilización del paciente (transfusiones, embarazos)
Presencia de autoanticuerpos
Antecedente de previo trasplante
Anticuerpos no anti HLA que interfieran dando positividad en el resultado
(infecciones bacterianas, virales o fúngicas)

16. Este estudio permite identificar el porcentaje de reactividad de un suero de un
receptor hacia antígenos HLA de su donador, así como una estimación de la
presencia y especificidad de los anticuerpos hacia los antígenos HLA Clase I y Clase II
expresados sobre la superficie de células fenotípicamente bien determinadas en un
panel de referencia.
Se emplea en pacientes con antecedente de riesgo inmunológico.

17. Depende del efecto citolítico del Complemento de Conejo sobre los
linfocitos en cuya superficie tiene lugar una reacción antígeno con un
anticuerpo.
Esta técnica detecta la presencia en suero de anticuerpos citotóxicos de
clase IgG1, IgG3 e IgM.
Emplea un análisis de datos estadísticos que debe calcularse manualmente.
Implica un test de chi cuadrada a partir de una tabla de contingencia 2 x 2
para calcular cada especificidad antigénica.
La asignación de especificidad se realiza por correlación matemática entre la
presencia de un determinado antígeno en los linfocitos y las reacciones
positivas y negativas del suero.

18. El suero se incuba con el HLA pegado a la placa. Si
existen anticuerpos que reconozcan moléculas
HLA, se unirán a ellas y quedarán fijados en la
placa.
En un paso posterior, la presencia de los
anticuerpos fijados se determinará tras incubación
con un anticuerpo secundario, (anti IgG humano)
conjugado a una enzima o fluorocromos. Esta
enzima producirá una reacción colorimétrica al
actuar sobre su sustrato y la reacción se cuantificara
en un espectrofotómetro.
Se detectarán todos los anticuerpos anti HLA, tanto
fijadores de complemento como no fijadores.

19. Inmunoensayo basado en microesferas que
se utilizan para detectar cualitativamente
inmunoglobulinas IgG anti-HLA .
Estas microesferas están marcadas con un
fluorocromo y rebozadas con antígenos
HLA purificados; son detectadas mediante
el uso de un citómetro de flujo diseñado
para la doble lectura automática.
Identifica las aloespecificidades de los
anticuerpos anti HLA con alta precisión.
Los anticuerpos anti-MICA también pueden
detectarse por tecnología de Luminex.
Equipo:
Luminex: IT-E-IMM-009
Software Qicktype IT-E-IMM-011

20. Detecta sólo anticuerpos del tipo IgG pero no IgA o IgM.
Pueden obtenerse resultados erróneos por contaminación bacteriana de los
materiales, incubaciones demasiado cortas, lavado o decantado insuficiente
de las microesferas, exposición del conjugado a luz, u omisión de reactivos o
etapas de la prueba.
En análisis de laboratorio, se demostró que las muestras que contienen
timoglobulina pueden dar resultados positivos falsos.
Debido a la complejidad del análisis de HLA, la interpretación de los datos
debe ser revisada por personal calificado.

21. La prueba cruzada detecta en el suero del receptor anticuerpos citotóxicos
específicos o preformados dirigidos hacia antígenos HLA de sus posibles
donadores.
En el PRA la presencia de anticuerpos en el receptor, aunque no sea contra
los antígenos del donador, pone de manifiesto un estatus respondedor
inmunitario en el paciente que implica RI frecuentes e intensas y si es
trasplantado, aparecerán mayor número de rechazos que requerirán
tratamiento inmunosupresor más intenso.

23. En el caso del trasplante renal, la
determinación de los antígenos HLA en
donante y receptor es obligatoria, dada la
relación incuestionable entre su
compatibilidad y la evolución del injerto: la
supervivencia del injerto a largo plazo
disminuye cuanto mayor es el número de
incompatibilidades HLA.

24. Sangre periférica A
Ganglios Linfáticos B
Bazo C

26. Para esta técnica se requiere lo siguiente:
Linfocitos (T,B o ambos)
Una fuente de complemento de conejo.
Una batería de sueros anti-HLA con capacidad para reconocer todos los
antígenos (o especificidades) de histocompatibilidad clase I y clase II que se
pretenden identificar.

27. Los resultados se expresan en magnitud de reacción (1 = negativo, 2,4 =
débilmente positivo y 6,8 = fuertemente positivo) dependiendo del
porcentaje de lisis celular.
La asignación de la tipificación se basa en la especificidad de los antisueros
que producen reacciones positivas.

28. Si bien la técnica mencionada sirvió históricamente por más de 30 años a los
laboratorios de histocompatibilidad y logró estandarizarse a todo el mundo,
actualmente y debido al alto grado de polimorfismo que exhibe el HLA con
numerosas variantes alélicas, la tipificación basada a nivel del DNA ha permitido
mejorar la asignación del fenotipo HLA del individuo en estudio (se eliminan con
ello los errores de 20% en la asignación por serología).

31. Consiste en la amplificación mediante PCR de los exones polimórficos de los
genes HLA y su hibridación posterior con las sondas específicas de
oligonucleótidos específicos (-SSO), previamente inmobilizados en una
membrana de nitrocelulosa.

32. Se basa en la amplificación por PCR con primers específicos de secuencia (-SSP), que
sólo amplifican aquellas muestras en las que los primers reconozcan el alelo para el que
son específicos. Por tanto basta con comprobar por electroforesis en un gel de agarosa,
la existencia o no de productos amplificados y de esta manera identificar la región
genética del sistema HLA que posee el individuo.

33. Se trata de un método más laborioso pero que gracias a la aparición de los
secuenciadores automáticos, forma ya parte de la rutina de muchos laboratorios de
histocompatibilidad. Utiliza la secuenciación directa de las bases que conforman la
cadena de ADN resultante de la amplificación por PCR.

35. En la tecnología Luminex, las sondas hibridan, no en fase sólida, sino en fase
líquida, puesto que están acopladas a un conjunto de microesferas marcadas
con dos fluorocromos y el análisis se hace mediante citometría de flujo.
La amplificación del DNA genómico correspondiente a diferentes exones de
los genes HLA utilizan primers biotinilados. La hibridación es con sondas
fijadas a esferas que contienen en su interior fluorocromos con diferente
longitud de onda de emisión, lo que permite su identificación.
Después de un marcado fluorescente específico del DNA amplificado, la
especificidad de la hibridación se reconoce por la doble señal del DNA
amplificado y la fluorescencia de la esfera.
La interpretación se hace mediante un software adecuado.

36. EQUIPO
Equipo
Luminex IT-E-IMM-041
Software machit para la interpretacion
de Luminex IT-E-IMM-040
Fase del proceso
Amplificación el DNA Genómico (Area
Pre-PCR)
Hibridación con sondas específicas en
bolas (Area Post-PCR)
Lectura e interpretación de los
patrones

38. El uso de métodos moleculares por cualquiera de sus variantes, amplía el
conocimiento del polimorfismo HLA, de modo que permite saber con precisión
el grado de disparidad entre donante y receptor. Una mejor identificación de los
diferentes alelos sirve para elegir las parejas donante-receptor lo más
compatibles posible. Resulta de especial interés en el trasplante de médula ósea,
donde es obligado evitar ambigüedades y se requiere la identificación de
posibles discrepancias, que no pueden ser resueltas por métodos serológicos
convencionales, pues se trata de evitar no sólo la respuesta del huésped contra el
injerto sino también la respuesta del injerto contra el huésped.

39. El tipo de método para la tipificación del DNA dependerá del grado de
resolución (baja, media o alta) que cada programa de trasplante requiera, al
igual que la disponibilidad de recursos y experiencia.
Presencia de falsos positivos o falsos negativos, patrones ambiguos etc.,
debido a las mismas condiciones de hibridación para todas las sondas.
Es necesario un gran número de sondas para obtener algo más que baja
resolución.
Personal a cargo de la realización e interpretación de los estudios con el
conocimiento adecuado para comprender la complejidad de los eventos
Inmunogenéticos participantes, y poder discurrir debidamente en el
desarrollo de soluciones y estrategias que puedan surgir en el devenir de la
práctica de las metodologías.

40. Cada prueba en el laboratorio de Histocompatibilidad posee sus propias fortalezas y
debilidades, pero ninguna prueba puede predecir por si sola el riesgo inmunológico
del trasplante
Desarrollo de estudios en la detección de anticuerpos anti HLA precisos y confiables.
Conocer a los pacientes sensibilizados y coordinar con el clínico para su clasificación
en grupos de bajo y alto riesgo inmunológico en base al monitoreo de los mismos.
Comprender los eventos inmuno moleculares que participan en los diferentes
procedimientos.
Emisión de resultados bien fundamentados que coadyuven en la optimización del
manejo del paciente a través de diagnósticos concretos.
Compartir experiencias, criterios y una coordinación permanente con los especialistas
involucrados en la disciplina, con la finalidad de integrar conocimientos y estrategias
involucradas en el proceso del trasplante de órganos.

41. El laboratorio sigue teniendo el marco ideal para involucrar los resultados de
sus ensayos directamente con la práctica clínica
El Laboratorio de Histocompatibilidad tiene el compromiso de seguir
evolucionando de un laboratorio simple de “Pruebas Cruzadas” a uno capaz
de proveer mejores elementos para el aseguramiento del riesgo
inmunológico al equipo clínico.
El Laboratorio de Histocompatibilidad resulta en un patrimonio institucional,
el cual debe seguirse fomentando y fortaleciendo para su optimización de
recursos humanos y de infraestructura que permita avanzar en nuevas
tecnologías y herramientas diagnósticas, con personal bien adiestrado, y
contribuir así, al mejoramiento de la selección del mejor donante y los
resultados a largo plazo.

43. Comprende la organización de los pacientes ingresados en la Lista de Espera
Nacional de un órgano proveniente de Donante Fallecido que acuden al Laboratorio
de Histocompatibilidad periódicamente a la deposición de una muestra de suero para
su consideración en los estudios Inmunogenéticos correspondientes.
Los pacientes en lista de espera de trasplante renal, deben ser objeto de un estudio
periódico para detectar la existencia y, en su caso, isotipo y evolución de los títulos de
anticuerpos anti-HLA.
La detección y caracterización de los anticuerpos anti-HLA en los pacientes en lista de
espera de trasplante renal es imprescindible para un correcto manejo de selección.

44. Registro de Ingreso:
a) Fecha de Registro en el CENATRA.
b) ID del CENATRA.
c) Clínica de adscripción
d) Población: (Adulto o Pediátrico).
e) Grupo Sanguíneo.
f) Tipo de órgano a recibir.
g) Clasificación del Paciente (De Novo o Retrasplantado).
h) Edad.
i) Domicilio y teléfono actualizado

45. Determinación a solicitar de primera vez:
Grupo sanguíneo ABO
Tipificación HLA del receptor por DNA.
Aloanticuerpos anti-HLA para PRA
Frecuencia de deposición del suero: cada 3 meses según estándares EFI y ASHI.
Muestra necesaria:
Suero (sangre sin anticoagulante) 3-5 ml
Sangre total con ACD (para tipificación HLA): 15 ml

46. Este tipo de trasplante tiene un contenido social muy importante ya que no conlleva a la
disminución de la reserva funcional renal de ninguna persona, pero sí necesita:
Un Programa de obtención de órganos bien desarrollado.
Un Programa de diálisis con el menor riesgo de daño vascular y de infecciones
virales, así como con la menor morbimortalidad posible.
Laboratorios de Histocompatibilidad bien desarrollados y con personal
debidamente entrenado, capaces de realizar estudios de calidad en los aspectos
de la compatibilidad HLA entre donantes y receptores. De esta manera obtener
los mejores resultados a largo plazo.

47. Un programa automatizado para la selección donante-receptor donde se reúnan
todas las consideraciones necesarias como: Grupos Sanguíneos, compatibilidades
HLA, grados de sensibilización, edades, peso, tiempo en diálisis y posible tiempo
aceptable de isquemia fría.

48. Tiempo prolongado en lista de espera de TR
Alta incompatibilidad HLA entre donantes y receptores
Origen del donante:
1. Donante a corazón parado
2. Donante marginales o con criterios expandidos (más de 60 años, HTA
o ictus cerebral como causa de muerte, creatinina superior a 1.5, DM)
3. Tiempo de isquemia fría prolongado
4. Receptores sensibilizados con anticuerpos anti HLA pre-trasplante

49. Sin embargo la demanda de órganos para trasplante supera la oferta y, tristemente,
muchos enfermos fallecerán en diálisis, en lista de espera para la recepción de
organos, sin que esta posibilidad se haga factible. La expectativa debe cambiar, hay
que realizar un esfuerzo mayor y mejor organizado para la obtención de riñones
útiles que satisfagan las necesidades de los pacientes en ERC.

50. El trasplante es la expresión máxima del necesario trabajo en equipo a nivel
hospitalario y extrainstitucional.
Un elenco grande de profesionales intervienen en el sistema: Detección,
donación, realización de la selección basado en criterios inmunológicos,
envío de órganos, localización y traslado del receptor, hasta finalizar con el
trasplante.
Internacionalmente está bien identificado el hecho de que un órgano de
calidad es la principal variable vinculada con su exitoso implante y la
sobrevida del injerto a largo plazo.
Todo esfuerzo en la detección de potenciales donadores para incitar
socialmente la donación, y la extracción de órganos y tejidos para trasplantar,
debe continuar siendo estimulado.

51. A nivel gubernamental se ha venido conformando, consolidando y
articulando un Subsistema Nacional de Donación y Trasplantes con las
instituciones de salud, entidades federativas , organizaciones científicas,
organizaciones civiles . Esto ha permitido estandarizar procesos, coordinar
esfuerzos y mejorar en forma sostenida los resultados.
Es necesario la estandarización de procesos y procedimientos que permitan
mejorar y evaluar la calidad de los resultados de los laboratorios de
histocompatibilidad dado a que el futuro de un sistema equitativo y
transparente en la distribución y asignación de órganos se basa en la
compatibilidad y puntaje que se le asigne a los receptores.