HLA Tipificación_Marcelo Pando

1. ©2013 MFMER | slide-1
Tipificación de Antígenos de
Histocompatibilidad (HLA):
Evaluación de la Compatibilidad
entre Donante y Receptor
Marcelo Pando
Julio, 2014

2. ©2013 MFMER | slide-2
Parte 1:HLA Fundamentos Básicos
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA

3. ©2013 MFMER | slide-3
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:

4. ©2013 MFMER | slide-4
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:
Embarazo

5. ©2013 MFMER | slide-5
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:
Embarazo
Interacción
con KIR

6. ©2013 MFMER | slide-6
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción
con KIR
Trasplantes de
organos

7. ©2013 MFMER | slide-7
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción
con KIR
Trasplantes de
organos
Asociación a
enfermedad

8. ©2013 MFMER | slide-8
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción
con KIR
Trasplantes de
organos
Asociación a
enfermedad
Hipersensibilidad
a fármacos

9. ©2013 MFMER | slide-9
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción
con KIR
Trasplantes de
organos
Asociación a
enfermedad
Hipersensibilidad
a fármacos
Selección
de pareja!

10. ©2013 MFMER | slide-10
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción
con KIR
Trasplantes de
organos
Asociación a
enfermedad
Hipersensibilidad
a fármacos
Selección
de pareja!
DIVERSIDAD!

11. ©2013 MFMER | slide-11
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:
Embarazo
Interacción
con KIR
Selección
de pareja!

12. ©2013 MFMER | slide-12
HLA: Antigenos Leucocitarios Humanos
HLA
Presentación
antigénica
En la Naturaleza:En Medicina:
Embarazo
Interacción
con KIR
Trasplantes de
organos
Asociación a
enfermedad
Hipersensibilidad
a fármacos
Selección
de pareja!
DIVERSIDAD!

13. ©2013 MFMER | slide-13
Complejo HLA
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Chromosome_6.svg#filelinks (Wikimedia Commons)
Cromosoma 6
• Alrededor de 1900 genes
• 170 millones de pares de bases
• 4 Mbp en el complejo HLA
HLA 220 genes

14. ©2013 MFMER | slide-14
Complejo HLA
MHC
HLA
4 Mb

15. ©2013 MFMER | slide-15
Complejo HLA
MHC
HLA
4 Mb
Class I
Class II

16. ©2013 MFMER | slide-16
HLA Región de clase I
HLA-A HLA-B
HLA-C
1.3 Mb
81 Kb

17. ©2013 MFMER | slide-17
Región de clase II
HLA-DR
HLA-DP
398 Kb
47 Kb
HLA-DQ

18. ©2013 MFMER | slide-18
Desequilibrio de Ligamiento
93% de pacientes con B35 tendrán C*4
60% de pacientes con DR4 tendrán DQ8
39% de pacientes con DR4 tendrán DQ7
1% de pacientes con DR4 tendrán DQ4

19. ©2013 MFMER | slide-19
Serotipos: Antígenos Clásicos de HLA
HLA-A HLA-B
A1 Bw4
A2 Bw6
A3 B5
A9 B7
A10 B703
A11 B8
A19 B12
A23 B13
A24 B14
A2403 B15
A25 B16
A26 B17
A28 B18
A29 B21
A30 B22
A31 B27
A32 B2708
A33 B35
A34 B37
A36 B38
A43 B39
A66 B3901
A68 B3902
A69 B40
A74 B4005
continue… continue…
HLA-Cw
Cw1
Cw2
Cw3
Cw4
Cw5
Cw6
Cw7
Cw8
Cw9
Cw10
HLA-DR HLA-DQ
DR1 DQ1
DR103 DQ2
DR2 DQ3
DR3 DQ4
DR4 DQ5
DR5 DQ6
DR6 DQ7
DR7 DQ8
DR8 DQ9
DR9
DR10
DR11
DR12
DR13
DR14
DR1403
DR1404
DR15
DR16
DR17
DR18
DR51
DR52
DR53

20. ©2013 MFMER | slide-20
Serotipos: Antígenos Clásicos de HLA
HLA-A HLA-B
A1 Bw4
A2 Bw6
A3 B5
A9 B7
A10 B703
A11 B8
A19 B12
A23 B13
A24 B14
A2403 B15
A25 B16
A26 B17
A28 B18
A29 B21
A30 B22
A31 B27
A32 B2708
A33 B35
A34 B37
A36 B38
A43 B39
A66 B3901
A68 B3902
A69 B40
A74 B4005
continue… continue…
HLA-Cw
Cw1
Cw2
Cw3
Cw4
Cw5
Cw6
Cw7
Cw8
Cw9
Cw10
HLA-DR HLA-DQ
DR1 DQ1
DR103 DQ2
DR2 DQ3
DR3 DQ4
DR4 DQ5
DR5 DQ6
DR6 DQ7
DR7 DQ8
DR8 DQ9
DR9
DR10
DR11
DR12
DR13
DR14
DR1403
DR1404
DR15
DR16
DR17
DR18
DR51
DR52
DR53
630
Alleles

21. ©2013 MFMER | slide-21
Diversidad de HLA: IMGT/HLA
http://www.ebi.ac.uk/ipd/imgt/hla/

22. ©2013 MFMER | slide-22
Nomenclatura Molecular de HLA

23. ©2013 MFMER | slide-23
Niveles de Tipificación Molecular
• Baja resolución
• A*02, B*35
• Resolución intermedia
• A*02:01/02:03/02:07
• Alta resolución
• A*02:01

24. ©2013 MFMER | slide-24
HLA en Trasplantes
• Trasplantes de órganos solidos
• Tipificación de serotipos: A1, A2, etc.
O de Baja resolución: A*01, A*02, etc.
• Trasplante de Medula Ósea o Células Madre
• Tipificación de alta resolución: hasta el nivel de
secuencia aminoacídica:
• A*01:02, A*02:243, etc.

25. ©2013 MFMER | slide-25
Moléculas de HLA
• HLA de Clase I: HLA-A, HLA-B y HLA-C
• HLA de Clase II: HLA-DR, HLA-DQ y HLA-DP
β1
β2
DRA1 DRB1 -> DR1-18
DRB3, 4, 5 -> DR51, DR52, DR53
DQA1 DQB1 -> DQ1-9
DPA1 DPB1 -> DPs

26. ©2013 MFMER | slide-26
HLA de Clase I HLA de Clase II
Cadena Alfa
HLA-A
HLA-B
HLA-C
Cadena Alfa
DRA1
DQA1
DPA1
Cadena Beta
DRB1
DRB3
DRB4
DRB5
DQB1
DPB1
Cadena Beta 2
microglobulina
Moléculas de HLA: estructura y función

27. ©2013 MFMER | slide-27
HLA de Clase I
HLA de Clase II
Linfocitos T CD8 Linfocitos T CD4
Moléculas de HLA: estructura y función

28. ©2013 MFMER | slide-28
Estructura de HLA de Clase I

29. ©2013 MFMER | slide-29
Estructura de HLA de Clase II

30. ©2013 MFMER | slide-30
Epitopes de HLA
AA Pos 10 20 30 40 50
A*01 GSHSMRYFFT SVSRPGRGEP RFIAVGYVDD TQFVRFDSDA ASQKMEPRAP
A*02 ---------- ---------- ---------- ---------- ---R------
AA Pos. 110 120 130 140 150
A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV
A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A
AA Pos. 210 220 230 240 250
A*01 LRCWALGFYP AEITLTWQRD GEDQTQDTEL VETRPAGDGT FQKWAAVVVP
A*02 ------S--- ---------- ---------- ---------- ----------
AA Pos. 310 320 330 340
A*01 AVVAAVMWRR KSSDRKGGSY TQAASSDSAQ GSDVSLTACK V
A*02 ---------- ---------- S--------- ---------- -

31. ©2013 MFMER | slide-31
Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150
A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV
A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A

32. ©2013 MFMER | slide-32
Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150
A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV
A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A

33. ©2013 MFMER | slide-33
Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150
A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV
A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A

34. ©2013 MFMER | slide-34
Epitopes HLA AA Pos. 110 120 130 140 150
A*01 CDVGPDGRFL RGYRQDAYDG KDYIALNEDL RSWTAADMAA QITKRKWEAV
A*02 ----S-W--- ---H-Y---- ------K--- ---------- -T--H----A

35. ©2013 MFMER | slide-35
Genética del HLA: Genes HLA Clase I
Exon 1 Exon 2 Exon 3 Exon 4 Exon 5 Exon 6 Exon 7 and 8
ADN
ARNm
Proteína
Exon 2 Exon 3 Exon 4

36. ©2013 MFMER | slide-36
Exón 1 Exón 2 Exón 3 Exones 4, 5 & 6
Genética del HLA: Genes HLA Clase II
Cadenas alfa
DRA1
DQA1
DPA1
Cadenas beta
DRB1
DRB3
DRB4
DRB5
DQB1
DPB1
ADN
ARNm
Proteína
Exon 2 Exon 3
α2
α1 β1
β2

37. ©2013 MFMER | slide-37
Resumen Parte 1: HLA Fundamentos Básicos
• Gran diversidad: génica, alélica y haplotípica.
• Inmunidad contra las diferencias entre lo propio
y lo ajeno.
• La posición de la diferencias en la molécula de
HLA es importante en la generación de alo-
anticuerpos.

38. ©2013 MFMER | slide-38
Resumen Parte 1: HLA Fundamentos Básicos
• Tipos de resolución en la tipificación de HLA es
importante para cada tipo de trasplante.
• Exones 2, 3 y 4 son los tipificados en las
moléculas de HLA Clase I.
• Exones 2 y 3 son los tipificados en las
moléculas HLA Clase II.

39. ©2013 MFMER | slide-39
Parte 2: Tipificación de Antígenos de HLA
Metodologías:
Serología: usa células y detecta
los antígenos HLA en la superficie
celular.
Molecular: Usa ADN y detecta los
dos alelos de un gen.

40. ©2013 MFMER | slide-40
Tipificación de Antígenos de HLA:
ADN:
Proteína:

41. ©2013 MFMER | slide-41
Tipificación de Antígenos de HLA: Serología
NEGATIVO POSITIVO
Suero
contra
HLA-B57
HLA-B57
HLA-A1

42. ©2013 MFMER | slide-42
Tipificación de Antígenos de HLA: Molecular
Exon 2 Exon 3 Exon 4
Exon 2 Exon 3
HLA de Clase II
PCR
HLA de Clase I

43. ©2013 MFMER | slide-43
Tipificación por Primers Específicos de
Secuencia (SSP)
HLA-DR1
Paciente LM
Positivo para HLA-DR1
Control interno
Positivo
Paciente JM
Negativo para HLA-DR1
Control interno
Negativo

44. ©2013 MFMER | slide-44
Tipificación por Primers Específicos de
Secuencia (SSP)
HLA-ABDR TRAY

45. ©2013 MFMER | slide-45
Tipificación por Primers Específicos de
Secuencia (SSP)
HLA-ABDR TRAY

46. ©2013 MFMER | slide-46
Tipificación por Primers Específicos de
Secuencia (SSP)
HLA-ABDR TRAY
HLA-A1, A3
HLA-B35, B57
HLA-DR7, DR4

47. ©2013 MFMER | slide-47
Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
ADN:

48. ©2013 MFMER | slide-48
Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
ADN:

49. ©2013 MFMER | slide-49
Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
Sonda 1 Sonda 2
Isótopo Radioactivo

50. ©2013 MFMER | slide-50
Tipificación con Sondas de ADN: SSOP
Sonda 2Sonda 1
LUMINEX
Sonda 1 Sonda 2
Isótopo Radioactivo

51. ©2013 MFMER | slide-51
Cada perla tiene una fluorescencia verde y naranja
Tipificación con LUMINEX SSOP

52. ©2013 MFMER | slide-52
Cada grupo de perlas tiene una sonda diferente
Tipificación con LUMINEX SSOP
Red intensity
Greenintensity

53. ©2013 MFMER | slide-53
Cada perla tiene una fluorescencia verde y naranja
Tipificación con LUMINEX SSOP
Red intensity
Greenintensity
A3 B57

54. ©2013 MFMER | slide-54
Cada perla tiene una sonda diferente
Red intensity
Greenintensity
Tipificación con LUMINEX SSOP

55. ©2013 MFMER | slide-55
Cada perla tiene una sonda diferente
Red intensity
Greenintensity
Tipificación con LUMINEX SSOP
HLA-A1, A3
HLA-B35, B57
HLA-C*4, C7

56. ©2013 MFMER | slide-56
Secuenciación de HLA

57. ©2013 MFMER | slide-57
Secuenciación de HLA

58. ©2013 MFMER | slide-58
Secuenciación de HLA

59. ©2013 MFMER | slide-59
Secuenciación de HLA: Ambiguedades

60. ©2013 MFMER | slide-60
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14

61. ©2013 MFMER | slide-61
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC

62. ©2013 MFMER | slide-62
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
10
PC

63. ©2013 MFMER | slide-63
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
10
PC

64. ©2013 MFMER | slide-64
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC
9

65. ©2013 MFMER | slide-65
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC
9

66. ©2013 MFMER | slide-66
Resultados ambiguos de la tipificación
Allele 1 Allele 2
DQB1*03:01 DQB1*03:02
DQB1*03:03 DQB1*03:04
DQB1*03:04 DQB1*03:91Q
DQB1*03:113 DQB1*03:14
PC
1 2 3 4 5 6 7 8
16
24
31
PC

67. ©2013 MFMER | slide-67
Ventajas y Desventajas

68. ©2013 MFMER | slide-68
Resumen Parte 2
• Las distintas técnicas de tipificación obtienen
informacion diferente que se puede complementar.
• Serología detecta la molécula de HLA en la superficie
celular.
• Las técnicas moleculares usan ADN y asumimos la
expresión correcta.
• La tipificación de alta resolución nos da el nivel de
tipificación mas alto pero limitado a la región que se
secuencia.

69. ©2013 MFMER | slide-69
1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• Anticuerpos detectados:
• Contra Clase I:
• A:2 29 30 31 33 74
• B:27 44 46 47 50 5102 56 62 71 73 13 18 35 37 38
49 51 52 53 57 58 59 63 64 65 75 77 78
• C:15 4 A:23 24 25 32 68 69 17 18 2 5 6
• Contra Clase II:
• DR:11 8 9 04:02 103 12 13 16 7
• DR:01:01(DR51)
• DQA1:02:01
• DQ:4 5 6

70. ©2013 MFMER | slide-70
1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• Probabilidad de encontrar un donante de 1 en 270
• Donante potencial con 0 mismatches para ABDRDQ
• Crossmatch prospectivo positivo para celulas T y B
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08

71. ©2013 MFMER | slide-71
1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• Anticuerpos contra donante probables:
• DQA1*02:01 (MFI 4409-4813)
• DRB1*04:02 (MFI 14759)
• DRB1*04:04 (MFI 1605)
• Otros DR4 = Negativos

72. ©2013 MFMER | slide-72
1er Caso:
• Es DQA1*02:01 un DSA?
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08

73. ©2013 MFMER | slide-73
1er Caso:
• Es DQA1*02:01 un DSA?
• Evaluemos el desequilibrio de ligamiento:
DQ2  DQB1*02 --- DQA1*02:01  solo en DR7
El haplotipo de DR17 es:
DR17  DQA1*05:01  DQB1*02:01
DR17  DQA1*01:02  DQB1*06:02
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08

74. ©2013 MFMER | slide-74
1er Caso:
• Es DQA1*02:01 un DSA?
• Evaluemos el desequilibrio de ligamiento:
DQ2  DQB1*02 --- DQA1*02:01  solo en DR7
El haplotipo de DR17 es:
DR17  DQA1*05:01  DQB1*02:01
DR17  DQA1*01:02  DQB1*06:02
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08

75. ©2013 MFMER | slide-75
1er Caso:
• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?
• El desequilibrio de ligamiento no nos ayuda a resolver
este caso:
DRB1*04:01  DQB1*03:02 (DQ8)
DRB1*04:02  DQB1*03:02 (DQ8)
DRB1*04:04  DQB1*03:02 (DQ8)
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08

76. ©2013 MFMER | slide-76
1er Caso:
• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?
• Tipificación por SSP de alta resolución HLA-DR:

77. ©2013 MFMER | slide-77
1er Caso:
• Es DRB1*04:02 o 04:04 DSA?
• Tipificación por SSP de alta resolución HLA-DR:

78. ©2013 MFMER | slide-78
1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)
• FXM:
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Celulas T Celulas B
103 MCS 85 MCS
Positivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Donante

79. ©2013 MFMER | slide-79
1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)
• FXM:
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Celulas T Celulas B
103 MCS 85 MCS
Positivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Donante
• Auto FXM:
Celulas T Celulas B
79 MCS 69 MCS
Positivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Paciente

80. ©2013 MFMER | slide-80
1er Caso:
• Paciente con PRA de 100%
• DSA contra DRB1*04:04 (MFI 1605)
• FXM:
HLA-A HLA-A HLA-B HLA-B HLA-C HLA-C HLA-DR HLA-DR HLA-DQ HLA-DQ
Paciente 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Donante 01 03 08 60 10 07 17 04 02 08
Celulas T Celulas B
103 MCS 85 MCS
Positivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Donante
• Auto FXM:
Celulas T Celulas B
79 MCS 69 MCS
Positivo Positvo
Cutoff 57 MCS 78 MCS
Paciente
•El Paciente tiene auto anticuerpos
•Un DSA de bajo MFI que no explica el
Flow XM
•Es un muy buen donante para este
paciente

81. ©2013 MFMER | slide-81
2do Caso: Anticuerpo Alelo Específico

82. ©2013 MFMER | slide-82
2do Caso: Anticuerpo Alelo Específico
DRB3*02

83. ©2013 MFMER | slide-83
Resultados del Luminex:
MFI Allele Frequency
DRB3*01 1,200 21.0%
DRB3*02 24,000 65.3%
DRB3*03 2,500 13.7%
•El alelo DR52 (DRB3*02) es muy
frecuente y debería ser tipificado

84. ©2013 MFMER | slide-84
Resultados del Luminex:
MFI Allele Frequency
DRB3*01 1,200 21.0%
DRB3*02 24,000 65.3%
DRB3*03 2,500 13.7%
•El alelo DR52 (DRB3*02) es muy
frecuente y debería ser tipificado

85. ©2013 MFMER | slide-85
Y despues de la tristeza de no haber
ganado.

86. ©2013 MFMER | slide-86
Hay que felicitar al equipo por lo jugado!!!

87. ©2013 MFMER | slide-87
Y guardar la esperanza para el
proximo Mundial!

88. ©2013 MFMER | slide-88
Gracias!