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Resumen - síntesis - Unidad 1 - Ross-Pawlina - Histología -
Capitulo 1 - Técnicas
crecimiento y desarrollo (Universidad Nacional de Entre Ríos)
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Capitulo 1 - Técnicas
crecimiento y desarrollo (Universidad Nacional de Entre Ríos)
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2. UNIVERSIDAD NACIONAL DE ENTRE RÍOS
Facultad de Ciencias de la Salud
Medicina
Crecimiento y Desarrollo
2017
Unidad Problemática N° 1 “Evolución Humana”
Resumen – síntesis
“Ross-Pawlina – Histología – Capítulo 1”
Cagnoli, Juan Francisco – Comisión A4
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4. Técnicas
GENERALIDADES DE LAS TÉCNICAS UTILIZADAS EN HISTOLOGÍA
La histología es el estudio científico de las estructuras microscópicas de los tejidos y órganos del
cuerpo. Incluye muchos aspectos de la biología molecular y celular, que ayudan a describir la organización y
función celular. Los laboratorios de histología utilizan microscopios ópticos o microscopia virtual, que
representa métodos para examinar muestras microscópicas en la pantalla de un ordenador o dispositivo
móvil.
PREPARACIÓN DEL TEJIDO
Tinción con hematoxilina y eosina con fijación en formalina
El corte teñido con hematoxilina y eosina es la muestra que se utiliza con mayor frecuencia. El
preparado contiene por lo general muestras fijadas en formalina, incluidas en parafina y coloreadas con
hematoxilina y eosina (H&E). La mayor parte de las fotomicrografías utilizadas en histología se obtienen de
estos preparados.
El primer paso en la preparación de una muestra de tejido es la fijación para conservar la
estructura. La fijación obtenida mediante una sustancia química, conserva de forma permanente la
estructura del tejido para tratamientos posteriores. Las muestras deben sumergirse en el fijador
inmediatamente después de extraerse del organismo. Se utiliza para:
- Abolir el metabolismo celular.
- Impedir la degradación enzimática de las células y tejidos por la autolisis (auto-digestión).
- Destruir microorganismos patógenos tales como bacterias, hongos y virus.
- Endurecer el tejido como resultado de la formación de enlaces cruzados o de la desnaturalización
de moléculas proteicas.
El fijador de uso más común es la formalina, una solución acuosa de formaldehido al 37%. El
formaldehido conserva la estructura general de la célula y de los componentes extracelulares al reaccionar
con los grupos amino de las proteínas. Actúa con lentitud pero penetra bien en el tejido. Dado que no
reacciona con los lípidos, es un mal fijador de las membranas celulares.
En el segundo paso, la muestra se dispone para su inclusión en parafina con el fin de permitir su
corte. Para examinar una muestra se requiere de su infiltración con un medio de inclusión que permita
realizar cortes muy delgados (entre 5 y 15 micrones). Después de la fijación la muestra se lava y se
deshidrata en una serie de soluciones alcohólicas de concentración creciente hasta alcanzar alcohol al
100%. En el paso siguiente, el aclarado, se utilizan solventes orgánicos tales como el xileno o tolueno para
extraer el alcohol antes de la infiltración de la muestra con la parafina fundida.
Cuando la parafina fundida se ha enfriado y endurecido, se colocan una maquina cortadora
especial, el micrótomo que lo corta en rebanadas finas. Los cortes obtenidos se montan sobre el
portaobjetos de vidrio utilizando un medio de montaje como adhesivo.
En el tercer paso la muestra se tiñe para permitir su examen. Para teñir los cortes histológicos, la
parafina debe disolverse y extraerse, con xileno o tolueno y los tejidos deben rehidratarse mediante el uso
de una serie de soluciones de alcohol de concentración decreciente. El tejido sobre el portaobjetos se tiñe
con hematoxilina en agua. Debido a que el colorante de contraste, la eosina, es más soluble en alcohol que
en agua, se vuelve a deshidratar la muestra a través de una serie de soluciones alcohólicas de concentración
creciente y después se tiñe con eosina en alcohol. Después de la tinción, la muestra se pasa por xileno o
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5. tolueno y se le coloca un medio de montaje no acuoso antes de cubrirla con un cubreobjetos para obtener
un preparado permanente.
Otros fijadores
Los cortes teñidos con H&E de muestras fijadas en formalina son convenientes ya que muestran
adecuadamente las características estructurales generales, no son específicos para dilucidar la composición
química de los elementos celulares. Por ejemplo, los alcoholes y solventes orgánicos que se usan en
preparados de rutina diluyen los lípidos neutros.
Para conservar los lípidos neutros, se deben utilizar cortes por congelación de tejido fijado en
formalina y colorantes que se disuelvan en grasa; para ello se utilizan fijadores especiales con metales
pesados, como permanganato y osmio, que se unen a los fosfolípidos. El empleado de rutina de tetróxido
de osmio como fijador en la microscopia electrónica es la razón principal del excelente estado de
conservación de las membranas en las fotomicrografías electrónicas.
Otras técnicas de tinción
La hematoxilina y la eosina se utilizan para poner en evidencias las características estructurales. La
tinción con H&E no permite ver de forma adecuada ciertos componentes estructurales de los cortes
histológicos tales como elastina, fibras reticulares, membranas basales y lípidos. Se pueden utilizar otros
procedimientos de tinción, en su mayoría selectivos. Estos incluyen el uso de orceína y fucsina, resorcina
para el material elástico y la impregnación argentina para fibras reticulares y las membranas basales.
HISTOQUÍMICA Y CITOQUÍMICA
Composición química de las muestras histológicas
Muchos de los componentes de los tejido se pierden durante la preparación de rutina de los cortes
teñidos con H&E. Los ácidos nucléicos, proteínas y fosfolípidos se conservan en los cortes de tejidos. Las
proteínas pequeñas y los ácidos nucléicos pequeños, como los ARN de transferencia se pierden durante la
preparación del tejido. También pueden perderse otras moléculas grandes al ser hidrolizadas como
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6. consecuencia del pH desfavorable de las soluciones fijadoras. El glucógeno, los proteoglucanos y los
glucosaminoglucanos se pierden durante la fijación.
Sin embargo, estas moléculas pueden conservarse utilizando fijadores no acuosos o añadiendo
agentes ligadores especiales a la solución fijadora que preservan las moléculas extracelulares que contienen
hidratos de carbono.
Los componentes solubles, iones y moléculas pequeñas también se pierden durante la preparación
de muestras de parafina. Metabolitos intermedios, glucosa, sodio, cloro y sustancias similares se pierden
durante la preparación de muestras de rutina teñidas con H&E. Estos no constituyen los elementos
morfógenos de un tejido; participan en procesos de síntesis o reacciones celulares.
Fundamentos químicos de la tinción: colorantes ácidos y básicos
Un colorante acido, como la eosina tiene una carga neta negativa en su parte coloreada. Un
colorante básico tiene una carga neta positiva en su parte coloreada. La hematoxilina no es exactamente un
colorante básico pero tiene propiedades muy semejantes a las de los colorantes básicos.
Los colorantes básicos reaccionan con los componentes aniónicos de las células y de los tejidos que
tienen una carga neta negativa. Los componentes aniónicos incluyen los grupos fosfato de los ácidos
nucléicos, los grupos sulfato de los glucosaminoglucanos y los grupos carboxilo de las proteínas. La
capacidad de estos grupos aniónicos de reaccionar con una anilina o colorante básico se denomina
basofilia (afinidad por lo básico).
Los colorantes ácidos reaccionan con los grupos catiónicos en las células y los tejidos; en particular,
con los grupos amino ionizados de las proteínas. La reacción de los grupos catiónicos con un colorante acido
recibe el nombre de acidofilia (afinidad por lo acido).
Una cantidad limitada de sustancias dentro de las células y en la matriz extra-celular presenta
basofilia.
- Heterocromatina y nucléolos del núcleo (por los grupos fosfato ionizados en los ácidos nucléicos).
- Componentes citoplasmáticos (por los grupos fosfato ionizados en el ARN ribosómico).
- Materiales extra-celulares (por los grupos sulfato ionizados).
La tinción con colorantes ácidos es menos específica, mas sustancias dentro de las células y en la
matriz extra-celular presentan acidofilia.
- Filamentos citoplasmáticos.
- Componentes membranosos intracelulares.
- Fibras extra-celulares (a causa de grupos amino ionizados).
Grupos aldehído y el reactivo de Schif
La capacidad de la fucsina básica decolorada (reactivo de Schiff) para reaccionar con los grupos
aldehído trae como resultado la aparición de un color rojo distintivo y es la base de las reacciones de ácido
peryódico-reactivo de Schiff y de Feulgen.
La reacción de ácido peryódico-reactivo de Schiff (PAS) tiñe hidratos de carbono y macromoléculas
con abundancia de ellos. Se utiliza para demostrar glucógeno en las células, moco y la membrana basal,
epitelios y fibras reticulares en el tejido conjuntivo. El reactivo de Schiff también se utiliza en la reacción de
Feulgen, que se basa en una hidrólisis débil con acido clorhídrico para teñir el ADN. La reacción del reactivo
de Schiff con el ADN es estequimétrica, lo que significa que el producto de esta reacción es medible y es
proporcional a la cantidad de ADN.
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7. MICROSCOPÍA
Microscopía óptica
Un microscopio simple (una sola lente) o compuesto (lentes múltiples), es un instrumento que
amplifica una imagen y permite ver más detalles de lo que es posible a simple vista. El poder de resolución
del ojo humano es de 0,2mm, está determinado por el espacio que hay entre las células fotorreceptoras
contiguas de la retina. La función de un microscopio es la de ampliar una imagen a un nivel en el que la
retina pueda resolver la información que, de otro modo, estaría por debajo de su límite de resolución.
El poder de resolución es la capacidad de una lente de microscopio o sistema óptico para obtener
imágenes separadas de objetos que están muy cerca unos de otros. La resolución depende no solo del
sistema óptico, sino también de la longitud de onda de la luz y de otros factores como el espesor de la
muestra, la calidad de la fijación y la intensidad de la tinción. La máxima resolución posible con un
microscopio óptico de campo claro seria alrededor de 0,2 micrómetros.
El microscopio mayormente utilizado es el microscopio de campo claro. Los elementos que los
componen son:
- Fuente luminosa: para la iluminación se la muestra.
- Lente condensador: para enfocar el haz de luz a la altura de la muestra.
- Platina: sobre la que se coloca el portaobjetos.
- Lente objetivo: para recoger la luz que ha atravesado la muestra.
- Lente ocular: a través de la cual se puede examinar la imagen formada por la lente de objetivo.
Examen de un preparado histológico con el microscopio óptico
La realización de un preparado histológico requiere de una serie de pasos que comienzan con la
recolección de la muestra y termina con la colocación del cubreobjetos. En cada paso puede introducirse un
artefacto (un error en el proceso de preparación). Los artefactos que aparecen en el preparado terminado
están vinculados con la metodología, el equipo o los reactivos utilizados durante la preparación. La poca
pureza de las sustancias químicas y de los reactivos utilizados en el proceso (fijadores, reactivos y
colorantes), las imperfecciones en la ejecución de la metodológica (intervalos de fijación demasiado cortos
o demasiado largos, deshidratación, inclusión, coloración o descuidos en el montaje y la colocación del
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8. cubreobjetos) o equipo inadecuado (por ej., un micrótomo con una cuchilla defectuosa) puede introducir
artefactos en el preparado final.
Consideraciones funcionales: uso correcto del microscopio óptico
La iluminación Kohler es una de las claves de la buena microscopia. Los ajustes necesarios para
conseguirla son:
- Se enfoca la muestra.
- Se cierra el diafragma de campo.
- Se enfoca el condensador moviéndolo hacia arriba o hacia abajo hasta que el contorno de su
diafragma de campo aparezca bien nítido (en foco).
- Se centra el diafragma de campo con los controles de centrado de la sub-platina (donde está el
condensador). Se abre el diafragma de campo hasta que el haz luminoso cubra todo el campo observado.
- Se retira el ocular y se observa la pupila de salida del objetivo. Se verá un campo circular iluminado
cuyo radio es directamente proporcional a la abertura numérica del objetivo. A medida que se cierra el
diafragma del condensador, su contorno aparecerá dentro de este campo circular. El diafragma del
condensador debe cerrarse hasta cubrir aproximadamente dos terceras partes de la abertura del objetivo.
El ajuste del diafragma del condensador ejerce gran influencia sobre la resolución y el contraste con que se
pueden observar ciertos detalles de la muestra.
Otros sistemas ópticos
El microscopio de contraste de fases permite el examen de células y tejidos no teñidos y es
especialmente útil para estudiar células vivas. Aprovecha las pequeñas diferencias en el índice de refracción
que hay en diferentes partes de una muestra de células o tejidos. Se utiliza para examinar las células y
tejidos vivos (como las células de cultivo) y cortes semi-finos no teñidos.
En el microscopio de campo oscuro la lente objetivo no capta luz directa proveniente de la fuente
luminosa. Solo la luz refractada por las estructuras de la muestra penetra en el objetivo. Es útil en el examen
de auto-radiografías.
El microscopio de fluorescencia aprovecha la capacidad de ciertas moléculas de fluorescer bajo la
luz ultravioleta. Se utiliza para la detección de moléculas con fluorescencia natural (auto-fluorescencia)
como la vitamina A y algunos neurotransmisores. La aplicación principal de este microscopio consiste en la
detección de antígenos o anticuerpos en los procedimientos de tinción inmunocitoquimica.
El microscopio ultravioleta utiliza lentes de cuarzo con una fuente de luz ultravioleta. La imagen
depende de la absorción de la luz UV por las moléculas de la muestra. Es útil en la detección de ácidos
nucléicos, las bases de purina y pirimidína de los nucleótidos. También para la detección de proteínas que
contienen ciertos aminoácidos. Se utiliza en clínica para valorar el grado de ploidia (múltiplos de la cantidad
normal de ADN) en muestras tumorales.
El microscopio confocal de barrido combina componente de un microscopio óptico de campo claro
con un sistema de barrido para diseccionar una muestra ópticamente. Permite la visualización de una
muestra biológica en tres dimensiones.
El microscopio de polarización tiene su fundamento en el hecho de que las moléculas o los
conjuntos de moléculas muy bien ordenados pueden rotar el ángulo del plano de la luz polarizada. Es una
simple modificación del microscopio óptico de campo claro en la cual un filtro de polarización, llamado
polarizador, se coloca entre la fuente de luz y la muestra, y un segundo filtro, llamado analizador, se instala
entre la lente objetivo y el observador.
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9. Microscopia electrónica
Hay dos tipos de microscopio electrónicos: el microscopio electrónico de transmisión (MET) y el
microscopio electrónico de barrido (MEB).
El MET utiliza la interacción de un haz de electrones con la muestra para producir una imagen. La
óptica del microscopio electrónico de transmisión es, en principio, similar a la del microscopio óptico,
excepto que el MET utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz.
En el MEB, el haz de electrones no atraviesa la muestra, sino que se explora (barre) su superficie.
Son tridimensionales y muestran la estructura superficial de una muestra examinada.
Microscopia de fuerza atómica
El microscopio de fuerza atómica (MFA) se ha convertido en una de las herramientas más
poderosas para el estudio de la topografía superficial con resolución molecular y atómica. El MFA se trata
de un microscopio no óptico que funciona de la misma forma que los pulpejos del dedo, que tocan y
sienten la piel de nuestra cara cuando podemos verlo. Una ventaja del MFA para el examen de muestras
biológicas es que, a diferencia del MET y MEB, la muestra no tiene que estar en el vacío; incluso puede estar
en agua. Por lo tanto, es factible obtener imágenes de células vivas y de su medio circundante.
Microscopia virtual
La microscopia virtual es un procedimiento digital que se presenta con una alternativa al examen
de portaobjetos de vidrio utilizando un microscopio óptico. Integra la microscopia óptica convencional con
la tecnología digital. Los preparados se exploran utilizando sistemas de adquisición de imágenes ópticas con
enfoque automático, para crear archivos digitales de dos dimensiones que normalmente se almacenan en
los servidores virtuales dedicados de microscopia. La muestra virtual es una representación digital de un
preparado que se puede ver de forma remota sin un microscopio óptico.
Los microscopios virtuales ofrecen nuevas posibilidades para la visualización y manipulación de
muestras que no están disponibles en un microscopio óptico estándar.
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10. 7
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11. 8
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