El cáncer es una enfermedad de gran importancia puesto que es una de las principales causas de muerte en el mundo. Los principales factores de riesgo para el desarrollo de la enfermedad son la edad o el estilo de vida que promueve un índice de masa corporal elevado, ingesta reducida de frutas y verduras, falta de actividad física, consumo de tabaco y consumo de alcohol. Sin embargo, en la aparición del cáncer también se encuentran implicados otros factores como son la predisposición genética o la presencia de enfermedades como la obesidad o ciertos virus que pueden influir en el desarrollo del cáncer. La causa de esta enfermedad es la acumulación progresiva de alteraciones genéticas que confieren a las células ventajas proliferativas. Además, hay genes cuyas mutaciones son más susceptibles de dar lugar a cáncer debido a que regulan procesos esenciales como la estabilidad cromosómica y reparación del DNA, la señalización celular, o el crecimiento y diferenciación celular. Dichos genes son los denominados protooncogenes y supresores tumorales. Los protooncogenes son genes cuyas mutaciones los activan, pasándose a denominar oncogenes y cuya expresión favorece los procesos que concluyen en un aumento de la proliferación y crecimiento celular. Por otra parte están los genes supresores tumorales. Éstos se encuentran inactivados en cáncer y al contrario que los oncogenes, disminuyen los procesos que favorecen la proliferación y crecimiento celular. En las células sanas existe un equilibrio entre estos procesos y, si este equilibrio se rompe, se producirían alteraciones fisiológicas que podrían concluir in cáncer. Concretamente, estas alteraciones fisiológicas pueden aportar a la célula una autosuficiencia en señales de proliferación o la insensibilidad a señales inhibitorias de la proliferación, así como la capacidad de evadir la apoptosis, de replicarse de forma ilimitada, de inducir angiogénesis o incluso de invadir tejidos. Esta tesis aborda el estudio de las funciones biológicas de DRO1 y la implicación de AIB1 en su regulación. Por una parte, DRO1 es un supresor tumoral cuya expresión se ha observado disminuida en diferentes tipos de cáncer. Dicha expresión se encuentra regulada por hormonas esteroideas y por diferentes oncogenes. Además, DRO1 ha sido relacionado con diferentes procesos biológicos como la apoptosis, diferenciación celular y desarrollo, así como en metabolismo energético. Por otra parte, AIB1 es un oncogén que regula la expresión de genes reguladores de la proliferación y crecimiento celular y que se encuentra sobreexpresado en gran cantidad de cánceres. Como resultado de la expresión de los genes regulados por AIB1 las células poseen una mayor capacidad de proliferación y crecimiento y una mayor supervivencia y resistencia a la apoptosis. Además, AIB1 también se encuentra implicado en procesos metabólicos siendo necesario en la diferenciación adipocítica.

2. Cáncer
Importancia: Una de las principales causas de muerte en el mundo (13% del total de defunciones a nivel
mundial en 2008).
Factores de riesgo: - Edad
- Factores de riesgo conductuales y dietéticos:
· Índice de masa corporal elevado
· Ingesta reducida de frutas y verduras
· Falta de actividad física
· Consumo de tabaco
· Consumo de alcohol
- Predisposición genética
- Enfermedades (obesidad, virus, etc.)
Causa: Acumulación progresiva de alteraciones genéticas que confieren a las células ventajas proliferativas.
(GLOBOCAN 2008)

3. Hay genes cuyas mutaciones son más susceptibles de dar lugar a cáncer debido a que regulan
procesos esenciales como la estabilidad cromosómica y reparación del DNA, la señalización celular,
o el crecimiento y diferenciación celular.
Protooncogenes Supresores tumorales
Activados en cáncer
(Oncogenes)
Inactivados en cáncer
- Ras
- Ciclinas
- RARα
- c-Myc
- APC
- PTEN
- BRCA1
- BRCA2
Alteraciones fisiológicas
Cáncer
P
R
O
L
I
F
E
R
A
C
I
Ó
N
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O
P
R
O
L
I
F
E
R
A
C
I
Ó
N
C
R
E
C
I
M
I
E
N
T
O

4. Alteraciones fisiológicas conferidas a las células cancerosas
Autosuficiencia en señales de proliferación
Insensibilidad a señales inhibitorias de la
proliferación
Evasión de la apoptosis
Capacidad replicativa ilimitada
Capacidad de inducir angiogénesis
Capacidad de invadir tejidos
(Hanahan & Weinberg; Cell 2011)

5. DRO1

6. Secuencia y estructura de DRO1
SRPX
DRO1
211 141 281 347 404 487 588 615 760 771 913 950aa
N-terminal C-terminal
Cys Cys Cys Cys Cys Cys
Cys Cys
Muy conservada en las diferentes especies de vertebrados (homología ~ 90%)
DRO1 contiene tres dominios con una similitud del 30% con el quinto dominio de la proteína SRPX,
los cuales son dominios tipo Sushi con dos residuos de cisteína capaces de formar puentes disulfuro
entre ellos
Dominio muy conservado tanto en los diferentes ortólogos de DRO1 como en la proteína SRPX e
incluso en proteínas procariotas, por lo que se ha propuesto la existencia de una nueva família de
proteínas con el dominio P-DUDES (Procariotas-DRO1-URB-DRS-Equarina-SRPUL).
(Aoki et al., BBRC 2002)
(Aoki et al., BBRC 2002.; Ichinose et al. , JBC 1990)
(Pawlowski et al., BMC Gen. 2010)

7. Secuencia y estructura de DRO1Secuencia y estructura de DRO1
DRO1
211 141 281 347 404 487 588 615 760 771 913 950aa
N-terminal C-terminal
Cys Cys Cys Cys Cys Cys
Región rica en lisinas
Augura a la proteína una localización nuclear.
Estructura coiled-coil (hélice superenrrollada), presente en factores de transcripción e involucrada en la
regulación de expresión de genes.
Región rica en treoninas
Gran similitud a ApoER2, lo que sugiere que podría estar involucrado en el acoplamiento con la matriz
extracelular.
Esta región entre los dominios 1 y 2 es larga, flexible y desordenada, pudiendo permitir muchas
interacciones entre los dominios P-DUDES covalentemente unidos unos con otros por puentes disulfuro.
(Liu et al., BBRC 2004; Lupas et al., Science 1991)
(Liu et al., BBRC 2004)
(Pawlowski et al., BMC Gen. 2010)

8. Secuencia y estructura de DRO1Secuencia y estructura de DRO1
DRO1
211 141 281 347 404 487 588 615 760 771 913 950aa
N-terminal C-terminal
Cys Cys Cys Cys Cys Cys
Posee tres sitios de glicosilación
Péptido señal de reconocimiento por enzimas proteolíticas
Región N-terminal hidrofóbica característica de las proteínas de secreción
(Aoki et al., BBRC 2002)
(Liu et al., BBRC 2004)
(Aoki et al., BBRC 2002)

9. Expresión de DRO1
Tejidos Especie Referencia
(+) útero, hígado, pulmón, bazo, riñón, vesícula biliar, músculo esquelético y cerebro
(–) glándula mamaria e intestino
Rata Marcantonio et al. 2001a
(+) próstata Rata Marcantonio et al. 2001b
(+) tejido adiposo, cerebro, estómago, colon, recto, hígado, pulmón, riñón y testículos Ratón Aoki et al. 2002
(+) corazón, cerebro, hígado, médula espinal y nódulos linfáticos
(–) médula ósea
Humano Visconti et al. 2003
(+) células del estroma de médula ósea Ratón Liu et al. 2004
(+) corazón, timo, placenta, páncreas y bazo
(–) cerebro, músculo esquelético, riñón, hígado y pulmón.
Humano Liu et al. 2004
(+) células de la papila dérmica Humano Cha et al. 2005
(+) tejido adiposo Humano y ratón Okada et al. 2008
(+) cartílago Ratón Manabe et al. 2008

10. Regulación de la expresión de DRO1
(Marcantonio et al., JME 2001)
(Marcantonio et al., Endrocrinology 2001)
(Bommer et al., JBC 2005)
DRO1
Hormonas
Estrógenos
Andrógenos
Oncogenes
β- y γ-catenina
K-Ras
C-Mic
Gli
-DRO1 se encuentra reprimido en varios tipos de cáncer.
-Importante conocer los mecanismos que regulan la expresión de DRO1 para poder establecer la
relevancia de DRO1 en cáncer y la posibilidad de ser considerado como un marcador tumoral e
incluso como una potencial diana terapéutica.

11. Funciones biológicas de DRO1
(Viscontti et al., Oncogene 2003)
(Bommer et al., JBC 2005)
Supresor tumoral
Reprimido en cáncer
Disminuye proliferación
Induce apoptosis
Diferenciación celular
Adipogénesis
Embriogénesis
Osteogénesis
Metabolismo
Expresión en tejido adiposo
Proteína de secreción
relacionada con adiponectina
(Liu et al., BBRC 2004)
(Tremblay et al., JBC 2009)
(Aoki et al., BBRC 2002)
(Okada et al., BBRC 2008)

12. AIB1

13. Familia SRC (Coactivadores del Receptor de Estrógenos)
SRC1
SRC2 (GRIP-1, TIF2, NCoA2)
SRC3 (pCIP, RAC3, AIB1)
Función: Formar complejos coactivadores que se unen al receptor de estrógenos permitiendo la
transcripción de sus genes diana

14. Mecanismo molecular de la activación transcripcional por SRC
ER ER
E E
SRC
CBP/p300
CARM/PRMT1
ERE
Me
Me
Me
Me
Me
Ac
Ac
Ac Ac
Ac
RNA pol. II
TBP
TAF II
mRNA

15. Región S/T
- Secuencia rica en serinas y treoninas.
- Zona susceptible de sufrir fosforilaciones.
- Papel importante en la regulación y en la actividad de AIB1.
Motivos LXXLL o LLXXL (L = Leucina; X = cualquier aminiácido)
-Motivos conservados a lo largo de toda la secuencia.
- RID (Dominios de Interacción con Receptores): Responsables de la interacción con los
receptores nucleares
Dominio de activación 2 (AD2)
- Responsable de la interacción con metiltransferasas como CARM-1 y PRMT-1
Dominio de activación 1 (AD1)
- Responsable de la interacción con las histona-acetiltransferasas CBP y p300 a través de
sus motivos LXXLL
Dominio histona-acetiltransferasa (HAT)
- Posee actividad HAT intríseca, por lo que podría participar en la remodelación de la
cromatina
Región rica en glutaminas
-Q: gran porcentaje de glutaminas
- Poli-Q: cadena de glutaminas cuya longitud (26-32 glutaminas) es un polimorfismo en
humanos que ha sido relacionado con susceptibilidad a cáncer (más agresivo cuanto más
corta).
Estructura y dominios de las proteínas SRC
14241
bHLH/PAS AD-1 AD-2RID
AIB1
14411
SRC1
14641
SRC2
Q
Q
N-term. C-term.
HAT
HAT
S/T
S/T
S/T
Poli-
Q
~ 160 KDa
~ 1400 aa
50-55% similitud
43-48% identidad
Dominio bHLH/PAS
- bHLH (Hélice-Lazo-Hélice básico): presente en muchos reguladores transcripcionales.
- PAS: Característico de muchas proteínas nucleares como Per, AhR y Sim.
- Involucrado en la dimerización de proteínas que contienen este motivo.
- Interacción con factores miogénicos como miogenina y MEF-2C.

16. Modificaciones postraduccionales de AIB1
Fosforilación
-11 residuos: T24, S101, S102, S505, S509, S543, S601, S857, S860, S867 e Y1357
-MAPK múltiples sitios del AD1 reclutamiento de p300
T24, S857 y S860 translocación al núcleo y coactivación de ER
-IKK S857 translocación al núcleo y coactivación de NFκB
(Font de Mora & Brown, MCB 200)
(Amazit et al., MCB 2007)
(Wu et al. MCB 2002)
Ubicuitilación
-3 residuos: K723, K786 y K1194
-Monoubicuitilación en K723 o K786: aumento la capacidad coactivadora del ER.
-Poliubicuitilación: degradación por el proteasoma. (Wu et al. Cell 2007)
Sumoilación
-3 residuos: K723, K786 y K1194
-Ocurre en el núcleo y da lugar a la disminución de su actividad transcripcional.
-La sumoilación de AIB1 impide la fosforilación y viceversa. (Wu et al. JBC 2006)
Acetilación
-CBP/p300 K629 y K630 disociación del complejo coactivador tras el inicio de la transcripción.
(Chen et al. Science 1999)
Metilación
-Entre las argininas 1163-1195 y 839-961: restricción de la actividad transcripcional.
(Naeem et al. MCB 2006)

17. (Xu et al., PNAS USA 2000)
(Xu et al., PNAS USA 2000)
Funciones fisiológicas de AIB1
Desarrollo y reproducción
IGF-1
Estrógenos
Metabolismo
Metabolismo mitocondrial
Peso corporal y del
tejido adiposo
Otras
Inflamación
Vasoprotector
(Coste et al., PNAS USA 2008)
(Louet et al., PNAS 2006) (Yuan et al, Circulation 2002)
(Wu et al., MCB 2002)

18. AIB1 y cáncer
Relacionado con un fenotipo agresivo y de mal pronóstico de la enfermedad
Amplificado en 20q12 en un 5% de los cánceres de mama y ovario
Sobreexpresado en el 60% de los distintos tipos de cáncer

19. Mecanismos moleculares de la oncogénesis mediada por AIB1
ERER
AIB1
P
AIB1
P
AIB1
Ciclina D1
c-Myc
P
RTK RTK
EGF
MN
AIB1
P
Ciclina A
Ciclina E
Cdk2
E2F1
AIB1
E2F1
AIB1
P
IGF1
IRS2
PI3K AKT
AKT
P
GSK3
BAD
NFκB
MDM-2
mTOR
AP-1
IGFI
RAS
RAF
MEK
MAPK
IRS1,2
AKT
E2E2
AIB1
P
AIB1
P
AIB1
IL-6
Casp. proinfl.
IL1 TNFα
IKK
p50 p65
IKB
IKB
P
p50 p65
p50 p65
NFκB
NFκB
EGFREGFR
EGF EGF
PAK1
SRC3Δ4
SRC3Δ4
P P
P P
FAK
P
C-Src
Migración
celular
MEC
ER ER
P
E2E2
E2E2
Proliferación celular Crecimiento celular
Diferenciación
Supervivencia
Metástasis
Proliferación celular Crecimiento celular
Diferenciación
Supervivencia

20. Papel de AIB1 en proliferación celular y apoptosis y su implicación en cáncer
Proliferación celular
Apoptosis
Crecimiento descontrolado
Cáncer

21. Hipótesis

22. Hipótesis
La expresión de DRO1 puede estar regulada por AIB1 y otros oncogenes.
DRO1 puede tener un papel importante en apoptosis y proliferación celular,
el cual puede estar limitado por la sobrexpresión de AIB1.
Es posible que DRO1 intervenga en diferentes funciones metabólicas.
La fosforilación de AIB1 en S728 podría afectar a su función coactivadora de la transcripción.

23. Objetivos

24. Objetivos
Determinar el mecanismo por el que la expresión de DRO1 se encuentra reprimida
por AIB1 y otros oncogenes.
Estudiar el efecto de DRO1 en apoptosis y proliferación y establecer la
implicación de AIB1 sobre dicha actividad.
Elucidar el papel de DRO1 en diferentes funciones metabólicas.
Comprobar las consecuencias de la fosforilación de AIB1 en S728 sobre su función
coactivadora de la transcripción.

25. Resultados
y
discusión
Discusión

26. DRO1 está reprimido por AIB1
DRO1 (Ccdc80)
Valoresd(i)observados
Valores d(i) esperados
nº Sonda delta P R Gen
Silvestres
AIB1-tg
Cultivos primarios
de epitelio de mama
Microarrays
Affymetrix
Expresión
diferencial
Discusión

27. DRO1 está reprimido por AIB1
0
2
4
6
8
10
Control siRNA siAIB1
*
0
0.5
1
1.5
Ad-GFP Ad-AIB1
*
0
0.4
0.8
1.2
MCF-7 BT-474 ZR-75 HeLa A-549 U2OS HMEC MDA-
MB-321
MDA-
MB-468
H1299
NivelesrelativosdemRNAAIB1yDRO1
-tubulina
AIB1
-tubulina
AIB1
 AIB1
 DRO1
NivelesrelativosdemRNADRO1
NivelesrelativosdemRNADRO1
HMEC MCF-7
Discusión
Nuevo mecanismo para explicar el potencial oncogénico de AIB1: La represión de supresores tumorales.

28. DRO1 está reprimido por otros oncogenes y por estrógenos
+E2 -E2
DRO1
-actina
*
NivelesrelativosdemRNADRO1
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
Control v-H-ras v-Src HER2
U2OS
0 8 24
0
2
4
6
8
Estradiol
Tamoxifeno
ICI182780
tiempo (horas)NivelesrelativosdemRNADRO1
MCF-7
Discusión

29. DRO1 está reprimido por otros oncogenes y por estrógenos
-5959
ATCAACATTTACTCCCTCCCTTTAAAAAACAAAAAACAAAAAAACAACAAAAAAAACTCTTTCAAGTACGTATGTAGGCTTAGGTATTTTGTTTTTATTTTTATTGTCTGTTTCCCACCGTTGTAATGTAAGCTCCCGGGAGTCA
GGGAATGTTCATTTATGTATCCCTAGTGAGTAGAATAGTGCCTTGCATTGAGTAAATATTTGTCGAATGAATGAGCTGCCATCCTGTTGGTTCACACTTTCTGATGTAAGGTGATATTCTGAGTGATGTGGTCAAGACCTGCCA
TGCAAGGTCAGTACAGTGAACCGACCACTAAAGGATAGGGCAATCCTAGCAGGACAGGTGCCGGGCCGAAATTGGGACTGGGAAAATGAGATACAACACTTGTCTGCCAGACAAGAGTATCTGGGACTCTAGGGGACTC
CACAGCCAAAAGGACATACCAAGCAAGATCTTATAGGTGACACACAGTTGCTGCCATGGCAAGCCTCCTTCTGTGGAAAGCCTGCTCAAGGAATTGAAGAGGCAAATTCTCCAACAGAAATGAACTCTGTGCATACTGGCT
GCAGCCATAGTCAGCACTGAACTTTTACATGCAGAGAAAGTTGGCAGCACTGCTGTGGAGAGTATAATATTTATCTTCTCCAATGGGCTGTGAACTTCTAGAGGGGAGAGTCTGCTTGGTTCTGTGTCATTCCCGGTGCTCA
GTCTGCATTTTTGCCAAACATTTGAGAGAAGGATTGAAAAAAAGGAGAAAAAAATTATATCATCTTTATCTTCTTGGCCATACCTAAGGGCACGGAGAAAGGTACAATTGGAATGTTCTCCTTCAGATCCAATCGATGTAAAT
CTTTTGTATGCATTAAATAACCAATGATAAAGACTTTAAATCCACCCCTTCCAGACCCAAGCACTAGTCCCCCAAGCAGCAAATTCATATGCCCACAAGTTCACATCTTTTACATAAAATAACAACCAATAAATAATTGAACT
TTAAATCATTCACTCTGGAGATTTAAAATGAATCTTTGGGCCATTCACACAGCTCCTTAATTTCTGCTAGGGCAAGATCTTTAATTTGTACTAGCTAGGAGATGGACATTTTCTTAATTAAGCAACCTGCTACAGGGACAAAAA
GGTGCCTACAAGGTTTCCCCAGCAAACTCTAAGTAATTAAAAATAAATGCATAAAGAAAGAATATTAACAACTGTTCTCAAGAGCTTTGACCATTATCCCATTAGGTAACTTTTATTTTTAAAGTACACAGTTTCCTTCAATTTT
GGATTAAACATGTGACTTTGTTGACATTTCATGGACAATACTAAGTGTTTCTTTTGGGGGTTACGCTTTCTCAGAACATCCCTGTGAGAAAGGAATAATACAGGGTGGTTGGAGGAGATTAGAAAATTCCAAGCAGCAGTTTC
ACATGACTAGCAAAATGAAGCTTGAAATAGCTTCGGAAGCTATGGCCTAATAAGATCCTGAAAAAACAGGGATCAAGAGGGCCAGGCGTGGTGGCTCATGCCTGTAATCCCAGCACTTTGGGAGGTGGAGGTGGGCAGAT
CACGAGGTCAGTAGATCGAGACCATCCTGGCTAACATGGTGAAACCCCGTCTCTACTAAAAATACAAAAAAAAATTAGCTGGGTGTGGTGGCGGGCGCCTGTAGTCCCAGCTACTCGGGAGGCTGAGGCAGGAGAATGGT
GTGAACCCGGGAGCAGAGGTTGCAGTGAGCCGAGATCATACCACTGCACTCCAGCCTGGGGGACAGAGCGAGGCTCTGTCTCAAAAAAAAAGAGTAAAGAAAAAGCACCCAGGCTTATGCTTACAGCTTGTCTGCTGGG
GATCCTGAACGATACACTGTGGGGGCCACATCCGTGACTAGCAATGACCCTTACTGGAACTATCAACAGGACCAGGTTGATCTAAGAAAAATCATATGGTGACTTGTTTGGTGGAGGGAATGAAACAATATACCACTAAGC
CCGCGAACTGTAATAAAATAAGATAAATAAGAAAAGGATGAAAACTCAGCTTTGTTTCAGGGGCACCTTTGTGGAGGACCTAAGAACATATACTAACATTGATCTCAGTACTGACGCTGGCCAAATTTTTCTACAGACACAC
TTTATTAGCCAGTCAGCACCTGACATAAGAAGAACATTACAGAAATTGGCTTTGGAACTCTACACACCTATTAATGAAATGTTTGGTGTGGCTTTTGGGGTATTCAATAATAGGGACAGAGCTAAAATGGCTGAAATGACCCA
GAATGGCAAAAAATGGGATAGACAGCCAGCCCAAATGATTAGCAGTCACTGTAAACAGTGCCCTGCAACCTCAGGGTCACCCAGGAAGACGCTTCACCGCAGACCAAACAGGCTCAACAGCAAACCTGCAGGCAACGGT
TGCTGCTCCAAGTGTGAGAAGTCAGGACACTGGAGAAAGGACTGTCCCAGCCAAGGGAGCCCACCCAGACCCTGTCCTCACTGCAAGCAGGAGGGCCATTGGAAAAGGAATTGCTCTCAGCTCTGAAGGGAGAGGAGGC
CACCCAGTGCCGTAATGGCCATAACTGAGACTGAAGGGGCTTGAGGTCCCTGGCAGCTCCCATAAAAGGCATGGTCAACACAATTGAGGAGACTCTTGACGTGGCAGATTAGAATATCCTTGAATTCATTCTTTTGACAGT
GTCAAGAGCCTGGACACTGGCTGGGGTCAAGGTCCCACTGGCACCTGGGAAACCCCCAGCTCACTGGTATCACCTGGGCTGCAGCAGCACCCTGCATTAATAGTCATCTTTGGCTTTCTCTCTGACCTGGCAACTTATTTAT
TTAGTCTGTCCTACACTGAAAATACTGAGAAAGAGAAGAATTCTTTTTTCATTCTGAAGGACACAAATGCAGCCTAAGACTGAACATTTGATTGAGTTCTGCAAATGGGAAGGAAAAACACATAGCCTCCTCAGTGTGAGTA
TTGTCTGTGCTTCTGCCACAAAGGTGTGATAAAATGGCTCAGCTAATTTTCTTGCTGGGGATACTGATGATCACAGAGCAGGAGAGGTGGTTTCCCTCCAAAACCACACTGAACAGCATGCTGTTATCCCCTCCTTTTCTTTTT
ATTCTTGTTTCTTCTTAAGCAAATGCTTTTTTATTTTAGCAATAGAATTCAGTTCAGTAACATCTCTGAGTGTTACTTTGTGCAAGAGAACCAACGGCATGTGACAGAAACCCTGGTTTCTCTAGCGTGCCTGTCACAGCGTGTT
ACCCTGAGCCTTGGTCCCAGGTTGCTGAAGTCTTGGATTAGTGTGGGTCTGACCAGTTAGCACACTCCTTTTTGGATGCCTTCTTACATTCACTCCAGCTTTCATCAAATAACTATCCCCACCCTAGTTTCTCTAAAGCAGTTC
TAGTTTGTACATTCTTTCCTTTCCTCCCCACAAATTACTACAAAACAAATGTCAGGTAGTTTCCTATCAATTAATTCCCAAATTAGCATTTCTAAAGTCTACTTTAACATTTTCTTCCTTTCACCTTTTTCTGACTCAACATCAATG
TCTTCCTTTCAGATATCACCAACCCCCACCACCCTCCCCCAACCCCTAGCACTAATTGGTTAATTGTTTCTTCAGTTGCAGAAAAATAGAAAGATCTAAATGGAGGACTTACAAAATATGGAGCTCTTAAATAACGGACTTGA
AATTGAGAATTATTACAAGCCATTAATCATTATAGATCTCCCCGGAAATGAATGAATGAGAATTTATCATTGCTCTTATTAGGTACGTGCCTCCAATACTTCTTCAGGAGGATTTTCTGAAGCCCCAGGTAAGCGTTTAGGCAT
TGAGATGAAAACAAGCATGAGAAGCCCCACTTTGCCAGTGTGTGTGTATGTATCTGTGTGTGAGAAGAGACTGGGGGAAGGAGTTGGGTGTGGGGTGGGGACTAACGGCGGCGGTGGAGTGTTAGGTCCTCTCTGGTGTG
TGTGTTTAGTGCGCCATCTGGTGACTGAAGCTCACAGAGGGAAGAAAGCCTGAGGTCCTAGGAAGACAGGCACAACCCAGGGTTGGGGTGGCTCCTCATGGTCAATTCGGGGTTGCTAAAGTGGCTGTATTTCAGCTTTAC
CAGCGCACAGGTGACAAATGTTGTGCACATCATGGAGAGGTTTGTGTAAGTCATGACTTATTCAAGAAAAATAATAAAGGGCTTTAAGGACCTATTGAGAAAAGCAAAAAGTACAGTTACACAATTATCCCAGACAGTAGG
ACTCTAAAAGTGTAAGTACTCTGGTTGAACAAATAAATGAAACTCTTCTACGAATGTGGGAAATGCAAAAAGGAATTGAAGGAAGGGAAAAAACTGAAGGTATGAGTAGAAAATTAAAGAGAGAGGCAGGATAGCATCAC
GCTTTGTAGGCTGTTCTAAACCTGGGTTCAAATTTCAGAGCTACTGCTTACCTTTTGTGGGACAATAGGCAATTTATTTAAACTCACCAAGCCTCAGTTTGCTCATCTATAAAATGAGGATCATTCTGTTTACTTTCTAAGGATA
CTGTGAGGGTTAAATAAAAGAATTCACAAAAATACTAAGCCCAAAGCTTCACATGTAAATGCTCAATAAATGGTAGTTGTTATAAGCAGAGAGAAGAGAAGAGGAAATGAAAAGCCAGAAGGGAGAAAGCTCAGTAAGGA
TAGTGTAGGACGCCTTAGAAAATTATGAGAAAGGAAGTAACATCTAGGACCCTCCAACTTAGCACAAGGCTAGGTTGATCAACCCAACAGGTGAATACCACGAAGGCTGCAATCTATGACTCCAGTGGACAGAGGGTCTC
TGCCTGAAGCCCACTTTTGTTATTATCCTTACAAGTGTCTGAGAGAATGCCACAGCAGGGCTGGCCATCCTTCTTGGTACCCCTGGGACTTCAAGGTGTGGCCGGGCAACTCTATAGTTAACCTCTATACAGGACTTTCTCAG
TTCCATGCTCGTAGCTTATGTGAAAAAAGTCAAATGTGACCAGGGCAAGATGGGGCTGATCAAGGCATAACAACTAGGGATGAAGTTTGATCCAGTGAGGGACGCTATTAGCATGACTGAGCTGGCAAGGAGGTTTCTGAG
AACCCTGGCTTGTCACTGTTGGTGGCAGTTAATAGTGACATGGAGAGTCAGCTCGCCCAGCATGGCCGGAAGAAATATCCACGTAACCTGAGACCCCTTCCTTCTCCATTGAATCCTTATGGCAGACTCAGGAGGTGGAAT
CCCAAAGCTGCCTCACTCTCTCTTTCAGAACCTGATAAGTCTACTTCTATGGATTGCCTAAAGCCCTTCAGACATCTAAAGTCTCTGCAGAGGAAAATATTGCACTACACACACACACACAAACACACACACTCGGGACCTC
CAAGGGAGCCCTTAGTCTACCATCTGCAGCCAGAGCTTTGAAGCTAGAGATCATAATGCCTGTTCCCTGATGTAACAGTCAACTGCAATCTCGACTTGCAGCCATTGCCTGCATTTCTAACCTTTTACCAGCTTCCTTCCATG
CCGAGGAGAAACTAGGACCAAGAACACAGTAATATGATCCCCAATTAGCATAAAATAAAAACAACCTAGTCATGTTTTCCATGGGCTTTTCCAACCTCAAACTAAAAGCACAAAGCAGGGAGAAAGATATAAGAATATACA
CATGGGACTATAAATACATATATACTGTCTGTGTCAGCACAGCCAAGCACCCTGACCCAAATGAGTATCTGTCTCTAAGAAAAGAATGTAGCCTGATGCAGAAATCTGAGAATTTTCTCCTTCCAAAGTACAGTGTAAGAAC
AGACTGGAAGAGAAGTTACCCCGATGACTTGGTTTGGAAGGGGTTAAGGCACCAGTCATCCTCTTCTAAAGTGATTTATGATGATGTGTGGAGTTTAAAAACTTTACCCCACCCCAAAGAACAGCCTTCTCACTC
-1
Discusión
La represión de DRO1 mediada por estrógenos podría ser debida a una regulación en cis por el
receptor de estrógenos y AIB1 podría estar actuando como correpresor en dicha regulación.

30. AIB1 reprime a DRO1 a nivel de promotor
Promotor DRO1 DRO1
(-4813/+1829)
Luciferasa
Luciferasa
Luciferasa
-4813/-2134
-2094/-1
+5/+1829Luciferasa
-4813/-3795 Luciferasa
-3794/-2745
Luciferasa
-2744/-2134
0
0.5
1
1.5
2
2.5
3
AIB1
*
(-4813/-3795) (-3794/-2745) (-2744/-2134)
- + - + - +
pGL3
Unidadesrelativasdeluciferasa
(-4813/-2134) (-2094/-1) (+5/+1829)
AIB1 - + - + - +
pGL3
*
Unidadesrelativasdeluciferasa
COS1
COS1
0
1
2
3
4
5
6
7
(-4813/-3795) (-3794/-2745) (-2744/-2134)
siAIB1 - + - + - +
pGL3
Unidadesrelativasdeluciferasa
* MCF-7
Discusión
DRO1 es reprimido por AIB1 a través de la secuencia de -4813/-3795 del promotor de DRO1.

31. Obtención de un sistema biológico para el estudio de DRO1
MCF7
pTetOn
Selección
G418
pTRE2hyg DRO1-Flag
Selección
higromicina y G418
MCF7TetOn MCF7-TetOn-DRO1-Flag
Dox+
Dox-
Clon
Flag
β -actina
Flag
β -actina
0
1
2
3
4
5
6
7
Dox- Dox+
NivelesdemRNADRO1
1 2 4 5 6 7 8 9 10 11
*I I
Discusión

32. Efecto de la expresión de DRO1 en cultivos celulares
Día 11
Día 8
Día 4
MCF7-TetOn-DRO1flag dox- MCF7-TetOn-DRO1flag dox+
Día 3
Discusión

33. Efecto de DRO1 en la expresión de genes implicados
en diferentes procesos celulares
Apoptosis
Ciclo celular
Metabolismo y Diabetes
ECM y moléculas de adhesión
Discusión

34. DRO1 está localizado en el aparato de Golgi y en la membrana citoplasmática
Endosomas
DRO1-Flag
Peroxisomas
DRO1-Flag
R. E.
DRO1-Flag
Mitocondria
DRO1-Flag
Golgi
DRO1-Flag
Discusión
La localización de DRO1 en el aparato de Golgi y en la membrana citoplasmática sugiere que podría
tratarse de una proteína de secreción

35. DRO1 es un proteína de secreción
WT
IRS2KO
CDK4tg
IRS2KO/CDK4tg
Medio condicionado
Subconfl. Confluentes
DRO1
- + - +
(4 días) (7 días)
Inhibidores de proteasas
- 100 kDa
- 150 kDa
DRO1
MCF7-TetOn-DRO1-Flag Grasa subcutánea de ratón
Análisis de medios condicionados
Discusión
DRO1 es secretado al medio
extracelular y procesado por
proteasas
-La secreción o la síntesis de DRO1 está
modulada de manera conjunta por IRS2 y CDK4.
- El rescate frente a la diabetes por CDK4 en
ratones que no expresan IRS2 podría ser en
parte debido al aumento de secreción de DRO1.

36. DRO1 es un proteína de secreción
Flag
β- actina
BFA (h)
Dox- + + + + +
0 0 2 4 8 24
0
5
10
15
20
25
30
35
Flag
β- actina
siControl siDRO1
%ApoptosisporBFA
Discusión
-El bloqueo de la secreción de DRO1 por BFA produce su acumulación en el interior de la célula.
- La apoptosis por BFA no depende, al menos exclusivamente, de la acumulación de DRO1

37. Papel de DRO1 en apoptosis
CHX/TNFα- + - +
DRO1
Tubulina
Citocromo C
Citosol Mitocondria
Mitocondria
DRO1-Flag
Golgi
DRO1-Flag
Discusión

38. Discusión
Papel de DRO1 en apoptosis
ER
DRO1-Flag
- -
--
+ +
++
Doxiciclina
Caspasa-3
Flag
Caspasa-3 activa
Caspasa-3
-DRO1 se encuentra parcialmente retenido en el
retículo endoplasmático tras estímulo apoptótico.
-DRO1 podría participar en la apoptosis inducida
por estrés en el retículo endoplasmático.
-La expresión de DRO1 en células MCF7-TetOn-
DRO1flag es suficiente para activar caspasa 3 sin
necesidad de un estímulo apoptótico previo.
-DRO1 posee una gran importancia en la inducción
de apoptosis.

39. Papel de DRO1 en apoptosis
0
10
20
30
40
Control siAIB1 siAIB1
siDRO1
%apoptosisinducidapor
EstaurosporinaenMCF7
AIB1
β- actina
DRO1
***
Ensayo
TUNEL
Doxiciclina
Estaurosporina
%apoptosis
10
20
30
40
0
- +- +
- + - +
**
*
-
- +-
+ +
+
-
Campo
claro
0
1
2
C DRO1
NivelesrelativosdemRNA
deBCLAF1
0
10
20
30
40
50
%apoptosisinducidapor
EstaurosporinaenBT-474
Control siAIB1 siAIB1
siDRO1
AIB1
β- actina
DRO1
Discusión
-DRO1 duplica la población apoptótica y potencia el efecto
apoptótico de estaurosporina.
-La actividad antiapoptótica de AIB1 está en gran parte mediada
por la inhibición de la expresión de DRO1.
-DRO1 induce la expresión del gen proapotótico BCLAF1.

40. Efecto de DRO1 en proliferación
Proliferación celular
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1 2 3 4
DíasAbsorbancia(450nm)
MCF7-TetOn-DRO dox-
MCF7-TetOn-DRO dox+
PLZF
Lisado
antes
IP
Lisado
después
IP
IP
anti-
Flag
Discusión
-DRO1 interacciona con el factor de transcripción PLZF.
-DRO1 disminuye la expresión de genes reguladores del ciclo celular como MCM2 y aumenta la de RBBP8.
-Posiblemente la disminución de la expresión de MCM2 por DRO1 impida la replicación del DNA y división
celular, y el aumento de RBBP8 medie la inhibición de la proliferación tras daño al DNA.

41. Efecto de DRO1 sobre proteínas de adhesión celular y su implicación en
migración transendotelial
Flag
- + Doxiciclina
β -catenina
ICAM-1
E-cadherina
β -actina
Vimentina
MCF7-TetOn-DRO1-Flag dox- MCF7-TetOn-DRO1-Flag dox+
0
500
1000
1500
2000
2500
Migracióntransendotelial(TEM)
(Fluorescencia488nm)
Control DRO1
*
β – catenina E - cadherina
MesenquimalEpiteliales
ICAM-1 Integrina DRO1
Endotelio
Discusión
-DRO1 disminuye la migración transendotelial.
-Este efecto podría deberse a la represión de ICAM-1 y β-integrinas.

42. La fosforilación de AIB1 en S728 favorece la interacción con ERα y TFIIEα
4.5%
lisado
total C A E C A E
Unido a
sefarosa Sobrenadante
TFIIEα
16%
ERα
total C A E C A E
Unido a
sefarosa Sobrenadante
ERα
- AIB1 se fosforila en las serinas S728 y S867 por CDK1/ciclina B al inicio de la mitosis.
- Esta fosforilación permanece hasta la salida de la fase M.
- No está asociada con ubicuitilación ni degradación de AIB1.
- ¿Estará implicada en alterar la interacción con factores de transcripción durante la mitosis?
250 -
150 -
100 -
75 -
50 -
KDa C
S
7
2
8
A
S
7
2
8
E
Discusión
-Mutaciones que mimetizan o bloquean la fosforilación en S728 no alteran su capacidad
de interaccionar con ERα ni su capacidad de coactivar a ERα. Incluso dicha fosforilación
es capaz de aumentar la afinidad de AIB1 por el factor de transcripción TFIIEα.

43. La fosforilación de AIB1 en S728 lo excluye de la cromatina durante la mitosis
DAPI AIB1 β-tubulina
S I
AIB1
Lamina A/C
pAIB1
AIB1
Nocodazol
Discusión

44. La fosforilación de AIB1 en S728 lo excluye de la cromatina durante la mitosis
Discusión
DAPI
pAIB1
β-tubulina
Nocodazol
AIB1pAIB1
(S728)
β-actina β-actina
-La fosforilación de AIB1 en S728 por CDK1 no regula su actividad pero coincide con su restricción física de la
cromatina, constituyendo un mecanismo alternativo de regulación transcripcional durante mitosis.
-Es posible que esta exclusión de la cromatina sirva para impedir la transcripción inadecuada de genes (por
ejemplo ciclinas D1, A1 y A2) durante la mitosis.

45. Conclusiones

46. 1- La transcripción de DRO1 está reprimida por AIB1 y por los oncogenes v-H-ras, v-src y HER2,
coincidiendo con la disminución de los niveles de proteína.
2- La transcripción de DRO1 está inversamente regulada por moduladores del receptor de
estrógenos.
3- AIB1 reprime a DRO1 a través de una región distal en su promotor, situada entre las bases -4813 y
-3795.
4- DRO1 tiene actividad apoptótica y sensibiliza a estímulos apoptóticos.
5- El efecto antiapoptótico de AIB1 en células MCF-7 depende de la represión de DRO1.
6- DRO1 inhibe la migración transendotelial de células MCF-7.

47. 7- DRO1 podría estar regulando el ciclo celular mediante interacción con PLZF y regulando la
expresión de MCM2 y RBBP8.
8- DRO1 es una proteína de secreción.
9- La secreción de DRO1 está modulada por IRS2 y CDK4 en células de grasa subcutánea de ratón.
10- La expresión de DRO1 modula la expresión de genes importantes para el metabolismo y podría
proteger contra el síndrome metabólico.
11- La fosforilación de AIB1 por CDK1 en S728 ocurre exclusivamente en células mitóticas.
12- La fosforilación de AIB1 por CDK1 en S728 lo excluye de la cromatina. Esta exclusión podría
actuar como un mecanismo potencial de la regulación transcripcional durante la mitosis.