En el presente trabajo se busca aislar esta bacteria, para lo cual se realizaron una serie de metodos para ver si asi lograbamos lo requerido.

1. Aislamiento de Bacillus
thuringiensis
Felix Chanduvi, Karen Geraldinne
Tamayo Romero, Jhulian Roberto
Integrantes:
Profesor: Juan Juscamaita Morales

2. Bacilo gram positivo
Largo: 3 a 5 um - Ancho: 1,2 um
Anaerobio facultativo, quimiorganotrofo
Familia: Bacillaceae
2 características diferenciales que le dan individualidad:
CARACTERÍSTICAS BIOQUÍMICAS COMUNES:
La presencia de la inclusión o cristal parasporal
Sus propiedades insecticidas
Poseen la capacidad de fermentar glucosa, fructosa, trealosa,
maltosa y ribosa, y de hidrolizar gelatina, almidón, glucógeno,
esculina y N-acetil-glucosamina.
Bacillus thuringiensis

3. Naruraleza proteíca,
Toxico para algunos invertebrados,
especialmente larvas de insectos.
Base del insecticida
biólogico más difundido
a nivel mundial .
CRISTAL PARASPORAL

4. ¿Cuál es el objetivo de aislar Bacillus
thuringiensis?
El objetivo del experimento es aislar este organismo, para aprovechar la
capacidad de síntesis de la proteína Cry, con el fin de aplicarla como
plaguicida.

5. No es muy efectivo al filo coleóptera,
debido a diversos factores, entre ellos la
capacidad de las proteasas de este
orden que degradan la proteína, caso
contrario al de lepidópteras.
Al tratarse de una proteína, tiene la
facilidad de ser biodegradable frente a
pesticidas sintéticos
La gran capacidad entomopatologica
de la proteína, permite eliminar un
gran espectro de insectos, incluso
algunos nematodos, patológicos para
el ser humano.
Al ser una toxina de amplio espectro,
también afecta a especies inocuas, lo
cual podría generar cambios en la
cadena trófica, extrema precaución con
el uso o incluso es la formación de
humus.
VENTAJAS
DESVENTAJAS

6. 2. Preparación del caldo madre #1
Para la dilución de la muestra se tomaron 5g del
muestreo agrícola, los cuales fueron vertidos en
los 100 mL de suero fisiológico .
Subsecuentemente se incubo a 29 grados por 24
horas
5. "Plaqueo" (Preparación de las placas
para el agar)
Después de auto clavar nuestro agar y 18 placas ,
se procedió a verter el agar caliente (40°C aprox.).
En este proceso se selecciono los tubos de
ensayos desde la 6 dilución en adelante para
proceder con la siembra.
4. Preparación del Agar McConkey (Medio
selectivo)
La preparación fue sencilla debido a que el
laboratorio contaba con el agar ya preparado. se
preparo 750mL para 18 placas. Pero en caso de no
tener un agar preparado, el agar MacConkey
tiene los siguientes componentes:
3. Diluciones sucesivas #1
La dilución sucesiva nos permite disminuir la
carga microbiana, se desarrollo este paso con la
finalidad de obtener visualmente colonias
separadas, se tomo 1 mL de nuestro "Stock o
caldo madre" se procedió verter este mililitro en
tubos de ensayo con 9mL de SFB de esta primera
dilución extraemos un mililitro, y procedemos a
repetir el proceso 9 veces más.
6.- Siembra por agotamiento
Se opto por realizar estrías en el agar con la
finalidad de obtener colonias separadas y tener
una mayor facilidad de poder aislarlas.
7. Análisis
En el análisis se procede a observar cada
crecimiento en placa al microscopio, primero a
40X, 100X y 1000X.
1.Preparación del suero fisiológico Braun
(SFB) #1
Tomamos 100mL de agua destilada, vertimos 0,9
g de NaCl, esto nos permitirá tener a las células
bacterianas turgentes.
METODOLOGIA NÚMERO 1

7. Preparación de Cultivo nutritivo (CN) #1
1.
Tomamos 1L de agua destilada, añadimos
peptona, unos 5g, luego 3g de extracto de carne,
8 gramos de NaCl.
2. Preparación del caldo stock #2
De los 1000 mL se empleo solo 100 mL para
obtener nuestro caldo stock. sin embargo a
diferencia del caldo madre #1, aquí se emplea el
CN, añadiéndole 5g de nuestra muestra agrícola.
e incubando por 4 días a temperatura ambiente
17°C.
3. Diluciones sucesivas #1
La dilución sucesiva nos permite disminuir la
carga microbiana, se desarrollo este paso con la
finalidad de obtener visualmente colonias
separadas, se tomo 1 mL de nuestro Caldo Stock,
se procedió verter este mililitro en tubos de
ensayo con 9mL de agua destilada cada uno, de
la primera solución procedemos a repetir el
proceso 9 veces más.
4. Preparación del Agar Nutritivo
Al igual el Agar MacConkey, el agar nutritivo ya
estaba preparado, sin embargo si no tenemos a la
mano dicho agar, lo podemos preparar con la
siguiente receta :
5. "Paqueo" (Preparación de las placas
para el agar)
Después de auto clavar nuestro agar y las 18
placas , se procedió a verter el agar caliente (40°C
aprox.).En este proceso se selecciono los tubos de
ensayos desde la sexta dilución en adelante para
sembrar las placas por agotamiento.
6.- Siembra por agotamiento
Se opto por realizar estrías en el agar con la
finalidad de obtener colonias separadas y tener
una mayor facilidad de poder aislarlas.
7. Análisis
En el análisis se
procede a
observar cada
crecimiento en
placa al
microscopio,
primero a 40X,
100X y 1000X.
METODOLOGÍA NÚMERO 2

8. La cultura de un organismo, no significa que tanto a leído, estudio o que tanto sabe, son aquellas
moléculas, medios o compuestos que consume, medios donde vive u orgánicos que genera el
microorganismo, lo cual lo diferencia de otros
Son los características metabolicas que le dan Apellido y nombre a un
microorganismo
Prueba en agar inclinado TSI
Agar almidon
Agar gelatina
Agar Urea Tinción Gram
Prueba de
Catalasas
CULTURA DEL ORGANISMO

9. Tinción Gram
La tinción Gram es una de las principales formas de clasificar y diferencia un
organismo bacteriano, esta tinción nos permite conocer a cual de los grandes
grupos bacterianos pertenece el individuo en estudio, si es Gram positivo o Gram
negativo. Además nos permite observar la forma del procarionte y la presencia
de sus endosporas , esta ultima estructura también puede ser observada por la
tinción verde malaquita o Giemsa.
Resultados :
Materiales:
Tinción de las diferentes
muestras extraídas de
las diluciones sucesivas
porta objetos
microscopio óptico
Gradilla de tinción /
Soporte de tinción
Mechero
1.
2.
3.
4.
5. Cristal violeta
6. Lugol
7. Acetona
8. Safranina
9. Agua destilada
Análisis de resultados:
Como se observa en las imágenes
tanto bacilos e hifas de hongos. No
obstante nuestro interés se centra en
los bacilos, en gran parte de llos
reportes observamos bacilos Gram
positivos, lo que nos da en primera
instancia, la pertenencia de este
espécimen al Gram grupo de los
Gram positivos. Además también se
observa un zona refulgente en el
centro de los bacilos, esto nos indica
la presencia de una endospora, por lo
cual se opto por no realizar la tinción
VM y Giemsa
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

10. Agar TSI
El agar urea es un medio de cultivo, que permite identificar la fermentación de
azucares, este agar presenta sacarosa, lactosa y dextrosa , el Rojo fenol será
nuestro indicador de cambio de pH, El Rojo del agar, indica que se los azucares
no han sido empleados, si existiese presencia de algún tipo de fermento que
cambie el pH, este cambiaria viraría su color por el cambio de pH básico a acido
(Amarillo).
Resultados :
Materiales:
Digerido pancreatico
de caseina
Digerido peptico de
tejido animal
Cloruro sodico
Lactosa
Sacarosa
Dextrosa
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7. Sulfato ferroso de
amonio
8. Tiosulfato sódico
9. Rojo fenol
10. Agar
11. Agua destilada
Análisis de resultados
Como se puede apreciar en las
imágenes, no hay un viraje del color,
lo que indica que la bacteria no es
fermentadora, y empleo para su
crecimiento los componentes
nitrogenados del agar, Caseína
digerida y péptidos de tejido animal.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

11. Prueba de catalasas
La prueba consiste en aplicar agua oxigenada sobre una pequeña toma de
nuestro organismo, y observar si este emite burbujas, estas indicarán la reacción
de oxido/reducción para el peróxido de hidrogeno, produciendo Oxigeno y agua.
Resultados :
Materiales:
Porta objetos
agua oxigenada
1.
2.
Análisis de resultados:
Como la imagen muestra, el
organismo tiene la capacidad de
reducir el peróxido de hidrogeno, el
burbujeo, indica la liberación de
oxigeno y formación de agua, por lo
cual podemos confirmar la presencia
de catalasa por parte del organismo.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

12. Agar gelatina
El Agar gelatina, nos permite observar el fenotipo proteolítico de nuestro
microorganismo, pues la bacteria tendrá que generar una enzima "Gelatinasa"
con la cual digerirá la gelatina. Este consumo o licuefacción de la gelatina, se
observara mediante la aplicación del Cloruro Mercurio acido, que hará que la
gelatina no digerida precipite en color blanco, de esa forma destacando la
hidrolisis de gelatina.
Resultados :
Materiales:
Extracto de carne
Cloruro sódico
Gelatina
Agar
Agua destilada
Acido clorhídrico
concentrado
Cloruro de mercurio
Análisis de resultados:
Aunque no se observe con claridad
debido a la poca cantidad de cloruro
de mercurio que se pudo emplear,
existe un " Halo de consumo", este
indica que nuestro individuo esta
degradando la gelatina, mientras que
la zona más blanquecina, estaría
completamente intacta y sin
consumir.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

13. Agar almidón
Al igual que el agar previamente explicado, el agar almidón nos permitirá
entender el fenotipo de la bacteria, si es que esta tiene la facultad de degradar el
almidón o no, para observar el "Halo de consumo" emplearemos Lugol, para
tener en detalle la zona que ha sido hidrolizada y convertida en azucares simples.
pues como bien es sabido el Lugol solo teñirá el almidón más no los azucares
simples
Resultados :
Materiales:
Extracto de carne
Cloruro sódico
Almidón
Agar
Agua destilada
Lugol
Análisis de resultados
Semejante al caso de la la prueba de
gelatina, Se observa un " Halo de
consumo" alrededor de la area de
inoculación, esto nos indica la
presencia de amilasas, lo que
podemos interpretar del fenotipo del
organismo es que tiene la capacidad
de producir amilasas para poder
degradar el almidon.
PRUEBAS BIOQUÍMICAS

14. Como se menciona Flores, Egúsquiza., Alcarraz, Woolcott, Benavides, Godoy, Huerta, Jesús y Patiño
(2011), las cepas de bacillus thuringiensis tienen la capacidad de degradar la gelatina, lo que indica la
producción de proteasas, ser capaces de reducir el peróxido de hidrogeno, con la producción de
catalasas, además de salir positiva en la prueba de GRAM, para Gram positivas, observamos en nuestros
resultados que estos fenotipos se cumplen.
Bacillus thuringiensis puede ser capaz de hidrolizar el almidón (Keshavarzi, 2008), en los resultados
obtenidos se obtuvo que efectivamente hidroliza almidón, mostrando la formación del halo alrededor
del disco inoculado lo que podemos interpretar del fenotipo del organismo es que tiene la capacidad de
producir amilasas para poder degradar el almidón.
Aunque no se observó con claridad debido a la poca cantidad de cloruro de mercurio que se pudo
emplear, en la prueba de agar gelatina también se evidencio la existencia de un " Halo de consumo",
este indica que nuestro individuo está degradando la gelatina.
El medio de TSI contiene como hidratos de carbono la glucosa, la lactosa y la sacarosa.
A la hora de contrastar los cuadros de reacción de Romero et al, 2017, nuestra prueba de TSI da resultado
negativo, lo que indica su incapacidad para fermentar azúcares muy al contrario que las pruebas
realizadas por los antes mencionados.
DISCUSIONES

15. Los resultado dados por la tinción GRAM, almidón, gelatina y
peróxido, nos indican que estamos frente a un ejemplar del genero
Bacillus, sin embargo la especie, por los estudios desarrollados no
han sido los suficientemente rigurosos para determinar la especie.
Por las características del fenotipo, podemos afirmar que es un
integrante del genero bacillus, más no podemos afirmar que es
Bacillus thuringiensis.
CONCLUSIONES

16. Flores, A., Egúsquiza, R., Alcarraz, M., Woolcott, H., Benavides, E., Godoy, J., Huerta, D., Jesus. M. &. Patiño, A. (2011). Biodiversidad De
BacillusthuringiensisAisladosDe Agroecosistemas Peruanos YEvaluación DelPotencialBioinsecticida.Centrode investigación. 14(1)30
– 35.
José Luis Romero Bozzetta, Estefany Estrella Canales Carrera, Patricia Katherine Meneses Huacachi, Selene Fabiola Herbozo
Róndan. (2017).
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REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS