Bacterias gram-negativas

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Bacterias gram negativas
Microbiologia (Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua Managua)
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Bacterias gram negativas
Microbiologia (Universidad Nacional Autónoma de Nicaragua Managua)
Descargado por Maritza Lopez (maritza.olivas@yahoo.es)
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Bacilos Gram Negativos: β lactamasas.
Los antibióticos β lactámicos tienen como mecanismo de acción principal efectos sobre la
integridad de la pared celular bacteriana, en consecuencia destrucción de la bacteria. En
defensa las bacterias desarrollan diferentes mecanismos de resistencia para neutralizar a los
β lactámicos (Rossi, 2006).
La función catalítica de las enzimas β lactamasas es la causa primaria de la resistencia
bacteriana con relación a los antibióticos ß lactámicos, es motivo de continua investigación
La habilidad de las β lactamasas para producir resistencia depende de localización, cinética
y cantidad.
1. Qué son las ß lactamasas?
Son enzimas, producidas por bacterias con peptidoglucano y por algunos hongos, utilizadas
para defenderse de antibióticos betalactámicos, o bien son utilizadas por la bacteria para
sintetizar su pared bacteriana.
2. Cuál es la ubicación con respecto a las estructuras de la bacteria?
El sitio activo de la betalactamasa en las bacterias S. aureus meticilino resistente está
ubicado en el aminoácido de serina, posición 70 (Ser-70).
3. Investigue como se conformó la nomenclatura de las β lactamasas.
4. Cuál es el sitio de la estructura bacteriana en el que esta codifica la resistencia por β
lactamasas.
Se encuentra a nivel plasmidico o cromosómico.
5. Investigue a que se refieren los términos expresión constitutiva y expresión
inducible.
Expresión constitutiva: aquellos que se transcriben permanentemente, independientemente
de las condiciones ambientales
Expresión inducible: síntesis de ciertas enzimas (o aumento de su síntesis) debida a la
presencia en el medio de sustratos metabolizables adecuados.
6. Elabore una lista de los bacilos Gram negativos de β lactamasas ampC.
Las AmpC son serin-betalactamasas pertenecientes al grupo 1 de la clasificación de Bush-
Jacoby-Medeiros, presentes de forma natural en diversas enterobacterias y en bacilos
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gramnegativos no fermentadores como Pseudomonas aeruginosa y Acinetobacter
baumannii.
Las betalactamasas de la clase molecular C de
Ambler (grupo 1 de la clasificación de Bush-Jacoby-
Medeiros) se caracterizan por su espectro de hidrólisis (actividad cefalosporinasa) y por su
perfil de inhibición. Las AmpC hidrolizan cefalosporinas de primera (cefalotina) y segunda
generación
(cefuroxima), incluidas las cefamicinas (cefoxitina y cefotetán) y, en menor medida, las de
tercera generación (cefotaxima, ceftriaxona, ceftazidima), mientras que generalmente son
muy poco eficaces hidrolizando las cefalosporinas de cuarta generación (cefepima y
cefpiroma) y los carbapenémicos (imipenem y meropenem)
Este espectro de hidrólisis puede ampliarse y afectar además a cefalosporinas de cuarta
generación (AmpC de espectro extendido), pero se desconoce cuál es la prevalencia y la
relevancia clínica y epidemiológica de estas variantes de AmpC. La cloxacilina y el
aztreonam, así como el ácido borónico y sus derivados (ácido fenil-borónico), inhiben a las
betalactamasas de tipo AmpC, mientras que el ácido clavulánico, sulbactam y tazobactam
no son buenos inhibidores
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Las betalactamasas AmpC están asociadas a elevada mortalidad y, a nivel de laboratorio,
con falsos reportes de susceptibilidad antimicrobiana. Por lo tanto, es de vital importancia
su investigación de rutina en los laboratorios de microbiología.
7. Haga una lista de antibióticos inductores β lactamasas ampC.
El grado de inducción de blaAmpC depende del tipo de inductor y es máximo con
inductores fuertes como la cefoxitina y los carbapenémicos. En los aislados que tienen un
gen blaAmpC inducible, su expresión puede estar desreprimida establemente de forma
parcial o total (mutaciones en genes reguladores de tipo ampD y ampR) dando lugar a la
producción estable de grandes cantidades de AmpC (hiperproducción parcial o total de
AmpC).
8. Mencione los antibióticos se muestran sensibles a las bacterias productoras de
β lactamasa ampC
Estas enzimas son capaces de resistir la inhibición por ácido clavulánico, sulbactam y
tazobactam. Aunque para la detección de AmpC no existen métodos estandarizados por el
CLSI, se han diseñado diversas técnicas con elevada sensibilidad y especificidad; suelen ser
además sensibles a cefalosporinas de cuarta generación y a los carbapenémicos, aunque
dicha sensibilidad se reduce significativamente si se produce la pérdida de alguna porina
relacionada con la resistencia antimicrobiana.
9. Cuáles son β lactamasas cromosómicas e inducibles?
La inducción de AmpC requiere de la exposición de la bacteria a drogas β-lactámicas o a
otros estímulos, lo cual está ligado a la vía de reciclaje de la pared celular (10,17); esta
inducción abarca de AmpC incluye diferentes productos génicos asociados a esta vía, los
cuales incluyen AmpR, AmpD y AmpG, además de precursores muropéptidos, que al
parecer actúan como cofactores (9,10,17,40,48,53,56)
10. Qué es una β lactamasas de espectro o extendido BLEE?
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Las betalactamasas de espectro extendido (BLEE), también
llamadas betalactamasas de espectro ampliado (BLEA), son enzimas producidas por
bacilos gran negativos fundamentalmente enterobacterias, con más frecuencia por E.
coli y Klebsiella pneumoniae.
Bacilos Gram Negativos: β lactamasas.
Los antibióticos β lactámicos tienen como mecanismo de acción principal efectos sobre
la integridad de la pared celular bacteriana, en consecuencia destrucción de la bacteria.
En defensa las bacterias desarrollan diferentes mecanismos de resistencia para neutralizar a
los β lactámicos (Rossi, 2006).
La función catalítica de las enzimas β lactamasas es la causa primaria de la resistencia
bacteriana con relación a los antibióticos ß lactámicos, es motivo de continua investigación.
La habilidad de las β lactamasas para producir resistencia depende de localización, cinética
y cantidad.
11. Elabore una lista de BLEE, bacterias productoras y antimicrobianos, opciones de
tratamiento.
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12. Explique cómo es detectada una cepa ampC en el laboratorio.
Detección de AmpC usando inhibidores
específicos: El método de aproximación de
discos no es de ninguna utilidad en cepas
derreprimidas, hiperproductoras o con
betalactamasas AmpC plasmídicas
constitutivas. En estos casos, deben
adicionarse técnicas que incluyan la
utilización de inhibidores de AmpC. La
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cloxacilina, constituye un inhibidor de AmpC cuya técnica consiste en inocular la cepa en
estudio en placas con agar Mueller-Hinton según métodos convencionales, para luego
colocar un disco de cloxacilina (500µg) y a ambos lados, discos de ceftazidima (30µg) y
cefotaxima (30µg) a una distancia de 25mm centro-centro. Un aumento del halo de
inhibición de las cefalosporinas adyacente a la cloxacilina, se interpreta como prueba
positiva para la producción de AmpC. Otros antimicrobianos como la oxacilina y el
aztreonam, presentan de igual manera acción inhibitoria. La detección de AmpC también
puede llevarse a cabo utilizando ácido fenil borónico. Beesley y col., determinaron que el
ácido fenil borónico (AFB), es un inhibidor competitivo reversible de las betalactamasas
AmpC. Uno de los métodos con AFB, consiste en utilizar discos de cefotetán (30µg) solos
y suplementados con 20µl de una solución de AFB (400µg). Tras la realización de un
antibiograma convencional, con los dos discos, se considera que existe una betalactamasa
de tipo AmpC, si el halo de inhibición del disco con presencia de AFB es mayor o igual a 5
mm, en comparación con el halo del disco que no contiene este inhibidor. Esta técnica es
conocida como potenciación de doble disco (28). La preparación de la solución de ácido
fenilborónico requiere dimetil sulfóxido (DMSO) como solvente, no obstante, debido a su
toxicidad y poca accesibilidad en los laboratorios clínicos, se ha diseñado, recientemente,
una técnica en donde se sustituye el DMSO por agua destilada, obteniendo los mismos
resultados (29). La técnica de sinergia de doble disco también es otra sencilla opción para
detección de AmpC usando AFB. Se basa en inocular una placa de agar Mueller-Hinton con
la cepa a evaluar y colocar un disco de AFB (300µg). Seguidamente disponer a ambos
lados de este, discos de cefotaxima (30µg) y ceftazidima (30µg) a una distancia centro-
centro de 18mm. Después de la incubación, el observar una distorsión (expansión) del halo
de inhibición de una o ambas cefalosporinas en las proximidades al disco de AFB, es
indicativo de una prueba positiva (cepa productora de AmpC) (30).
13. Qué factores de riesgo son asociados a BLEE
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Factores de riesgo de Enterobacterias productoras de BLEE
Habrá que considerar la posibilidad de Enterobacterias productoras de BLEE en pacientes
con infecciones potencialmente producidas por enterobacterias:
 Infecciones comunitarias: Infecciones urinarias e infecciones intrabdominales
 Infecciones nosocomiales: Además, infecciones relacionadas con catéter
(fundamentalmente catéteres centrales y sobre todo los de localización femoral) y
neumonía nosocomial
Factores de riesgo para infecciones de inicio extrahospitalario (bacterimias) por
BLEE
 Colonización/infección reciente por enterobacteria BLEE (el más importante)
 Uso de sonda vesical
 Uso de antibióticos sistémicos en los 2 meses previos (sobre todo
quinolonas/cefalosporinas)
Actitud:
 En pacientes graves (sepsis grave/shock séptico) de origen abdominal la existencia
de uno de estos factores puede ser suficiente para considerar necesario cubrir BLEE
 En pacientes con menos gravedad, habitualmente se considera cuando existen varios
factores (a más factores, más riesgo)
14. Investigue cuales son las pruebas para detectar BLEE en el laboratorio.
Método de aproximación de discos: Propuesto por Sanders, es aplicable a betalactamasas
AmpC inducibles. La técnica consiste en realizar un antibiograma convencional, para luego
colocar un disco de cefoxitina o cualquier otro antimicrobiano inductor a una distancia de
27mm centro-centro de un disco de cefamandol, ceftazidima, ceftriazona o cefotaxima
(antimicrobiano sustrato, revelador o testigo). El microorganismo producirá una
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betalactamasa inducible si se observa un halo de inhibición truncado del antimicrobiano
sustrato, testigo o revelador.
Técnica con AFB en casos de coexistencia BLEE – AmpC: En aquellas cepas con
producción conjunta de BLEE y AmpC, el AFB tiene una de las utilidades más notorias. La
técnica confirmatoria de BLEE recomendada por el CLSI incluye la utilización de ácido
clavulánico y, tal como se mencionó al inicio del artículo, las AmpC resisten la inhibición
por el clavulanato, por consiguiente, la presencia de BLEE puede ser enmascarada por la
producción de AmpC. La consecuencia de estos casos es el reporte de falsos negativos para
BLEE. Song y col., modificaron la prueba confirmatoria de BLEE estandarizada por el
CLSI. Esta técnica modificada consiste en añadir 20µl de una solución comercial de AFB
(20g/l), a discos de cefotaxime (CTX) de 30µg (o ceftazidime de 30µg) y CTX con ácido
clavulánico (10µg) (o ceftazidime-ácido clavulánico). Luego de inocular una placa con agar
Mueller-Hinton según el método convencional, se coloca el disco de CTX+AFB y el de
CTX-ácido clavulánico+AFB. Un incremento de 3mm o más en el diámetro del halo del
disco de CTX+ácido clavulánico+AFB, en comparación con el disco de CTX+AFB, se
considera una prueba positiva para BLEE [32]. El AFB inhibe la AmpC permitiendo
determinar la presencia de BLEE. Derbyshire y col. desarrollaron una técnica similar con la
finalidad de detectar coexistencia BLEE – AmpC, a través de la utilización de discos de
cefepime y cefepime-ácido clavulánico [33].
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Técnica de detección con discos AmpC, según Black y col: Este método está basado en el
uso de Tris-EDTA para permeabilizar la célula bacteriana y liberar las betalactamasas al
medio externo. Los discos AmpC se preparan aplicando 20µl de una mezcla 1:1 de Tris-
EDTA 100X y solución salina fisiológica estéril (SSFE), a discos de papel de filtro
previamente esterilizados. Una vez preparados se dejan secar y se guardan en refrigeración
hasta su uso. Seguidamente, se inocula una placa con agar Mueller-Hinton según el método
de difusión con discos, con la cepa ATCC 25922 de E. coli. Los discos preparados en el
paso anterior, se rehidratan con 20µl de SSFE y se le aplican colonias de la cepa a estudiar.
Posteriormente, se coloca un disco de cefoxitina (30µg) y, los discos AmpC ya inoculados,
se ubican muy cercanos, pero sin tocar el borde del disco de cefoxitina. La aparición de una
distorsión de la zona de inhibición, indica inactivación de la cefoxitina por parte de la
AmpC (AmpC +), y la ausencia de distorsión representa un resultado negativo (AmpC -).
Esta técnica mostró un 100% de sensibilidad y 98% de especificidad. Una prueba muy
semejante, pero sin la adición de EDTA, es el método tridimensional descrito por Coudron.
Método fenotípico simple para la diferenciación entre AmpC cromosómicas y
plasmídicas: Los diversos métodos fenotípicos mencionados no permiten diferenciar entre
AmpC cromosómicas o plasmídicas (adquiridas). Mirelis y col., durante un estudio de
rutina, observaron que aislados de E. coli, K. pneumoniae y P. mirabilis con un patrón de
resistencia compatible con la producción de AmpC, mostraban un fenotipo diferencial en
las placas de antibiograma. Este patrón consistió en la presencia de colonias dispersas
localizadas dentro de los halos de inhibición de los discos de cefoxitina, cefotaxima,
ceftazidima y aztreonam, cerca del borde de los mismos. Posteriormente, estudiaron por
técnicas moleculares tres de los aislados, seleccionados al azar, encontrando que poseían la
betalactamasa AmpC plasmídica CMY-2. En estudios subsiguientes, el patrón fenotípico de
presencia de colonias dispersas dentro del halo arrojó 100% de sensibilidad y especificidad
para la detección de AmpC plasmídicas. El método resulta de particular utilidad en aquellas
bacterias en las cuales es prácticamente imposible distinguir fenotípicamente entre una
hiperproducción de AmpC cromosómica natural y una AmpC plasmídica debido a que
ambas presentan el mismo patrón de resistencia. Sin embargo, esta diferencia es crítica para
la vigilancia epidemiológica y el control de infecciones debido a que los genes mediados
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por plásmidos, pueden ser transferidos a otras especies bacterianas en el medio hospitalario
y comunitario.
15. Elabore un listado de Carbepenemasas y las bacterias que las producen.
Carbapenemasas de clase A
Entre ellas podemos distinguir las codificadas en cromosomas y aquellas codificadas en
plásmidos, destacando de este último grupo la carbapenemasa de Klebsiella pneumoniae
(KPC) por ser la enzima de mayor importancia en la práctica clínica.
Está codificada por el gen blaKPC, localizado en un transposón con capacidad de inserción
en plásmidos diferentes de bacterias Gram-negativas. Esto le confiere una gran capacidad
de diseminación tanto geográfica como entre especies. Además, suele asociarse con
determinantes de resistencia para otros antibióticos.
Carbapenemasas de clase B: metalo-betalactamasas
La mayoría de estas enzimas son del tipo Verona integron-encoded metallo-betalactamase
(VIM), IMP y más recientemente del tipo New Delhi metallo-beta-lactamase-1 (NDM-1).
Todas ellas hidrolizan todos los antibióticos betalactámicos excepto aztreonam. Sin
embargo, muchas de las bacterias portadoras poseen además mecanismos de resistencia
complementarios que las hacen también resistentes a éste antibiótico. A menudo se
identifican en estas bacterias betalactamasas de espectro extendido (BLEE) que si son
capaces de hidrolizar el aztreonam. Se caracterizan por su resistencia a los inhibidores de
betalactamasas comerciales, y su susceptibilidad a los agentes quelantes como el EDTA,
debido a la estructura metálica de su centro activo metálico como ya hemos comentado.
Carbapenemasas de clase D: OXA
Las enzimas tipo OXA se pueden dividir en varios grupos según la homología de la
secuencia. Uno de ellos es OXA-48, enzima que tiene una mayor actividad carbapenemasa
que el resto de las OXA, con las cuales comparte menos de un 50% de homología en su
secuencia de aminoácidos.
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El primer productor de OXA-48 identificado fue una enterobacteria, K. pneumoniae, en
Turquía en el año 2003. Desde entonces ha sido extensamente identificado en brotes
nosocomiales.
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