Estudio químico computacional sobre la formación del intermediario l th dp en el ciclo catalítico de la enzima acetohidroxi sintasa

Universidad de Concepción
Facultad de Ciencias Químicas
Departamento de Físico Química
Grupo de Química Biológica y Computacional
Estudio químico computacional sobre la
formación del intermediario LThDP en el
ciclo catalítico de la enzima acetohidroxi
sintasa
Tesis para optar al grado académico de Licenciado en Química y al
título profesional de Químico
Omar Blas Alvarado Carripán
Concepción, Octubre del 2012

Licenciatura en químicaquímico Universidad de Concepción i i
Resumen
El ácido acetohidroxi sintasa (AHAS) es una enzima tiamina dependiente que
cataliza los primeros pasos de la ruta biosintética de los aminoácidos de cadena
ramificada valina, leucina e isoleucina. Esta enzima se encuentra en plantas, hongos
y bacterias por lo que es el principal blanco de acción de herbicidas, fungicidas y
agentes antimicrobianos. El ciclo catalítico de la AHAS está constituido por cuatro
pasos principales. En el primer paso el intermediario iluro realiza un ataque
nucleofílico sobre una molécula de piruvato para dar paso a la formación del
intermediario (2S)2LactilThDP (LThDP). La formación de este intermediario
necesita además la presencia de un hidrógeno el cual en la AHAS es de
procedencia desconocida, debido a la inexistencia de grupos ionizables cercanos a
las zonas del sitio activo de la enzima. Por este motivo en la presente tesis se
estudió el mecanismo de reacción para la formación del LThDP, postulando que
el grupo encargado de promover la transferencia protónica es el grupo amino del
anillo de pirimidina cuando este se encuentra bajo la forma APH⁺. Para ello se
realizó una exploración de la superficie de energía potencial (SEP) de la reacción
considerando a los sustratos aislados en fase gas. Además se realizaron cálculos de
las funciones de Fukui para el sustrato piruvato, para el estado de transición y para
el intermediario iluro bajo las formas AP y APH⁺ con el fin de contrastar la
reactividad de ambas formas tautomericas. Por último se realizaron cálculos
termodinámicos utilizando medios de distintas constante dieléctrica, con el
propósito de verificar la estabilidad de formación del intermediario iluro bajo la
forma APH⁺ debido a la protonación del anillo pirimidínico por parte del
aminoácido glutamato. Los cálculos computacionales se realizaron con el paquete
computacional GAUSSIAN 03, empleando la teoría de los funcionales de densidad
(DFT) a nivel B3LYP/631++G(d,p) para la exploración de la SEP y B3LYP(C
PCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) para los cálculos termodinámicos, en
tanto los estudios de reactividad se realizaron con el paquete computacional Jaguar
7.7, empleando B3LYP/631++G(d,p). Los resultados obtenidos indicaron que la
formación del LThDP ocurre de manera concertada, mostrando una barrera de
activación de aproximadamente 21 Kcal/mol. Además se observó que es el iluro
bajo la forma AP quien realiza el ataque nucleofílico sobre la molécula de piruvato.

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Abstract
Acetohydroxy acid synthase (AHAS) is a thiaminedependent enzyme that catalyzes
the first steps in the biosynthetic pathway of branched chain amino acids valine,
leucine and isoleucine. This enzyme is found in plants, fungi and bacteria making it
the main target of action of herbicides, fungicides and antimicrobial agents. The
catalytic cycle of AHAS consists of four main steps. In the first step the
intermediate ylide performs a nucleophilic attack on a molecule of pyruvate to
make way for the formation of the intermediate (2S)2lactylThDP (LThDP). The
formation of this intermediate also needs the presence of a hydrogen which is of
unknown origin in the AHAS, due to the absence of ionizable groups in the active
site of the enzyme. For this reason in this thesis studied the reaction mechanism for
the formation of LThDP, postulating that the group responsible for the
protonation is the amino group of the pyrimidine ring when the form is APH⁺. In
order to validate this hypothesis, the potential energy surface (PES) was explored
considering the reaction between isolated substrates in gaseous phase. Furthermore,
Fukui function calculations were performed for the substrate pyruvate, for the
transition state and for the intermediate ylide under the forms and AP and APH⁺ in
order to compare the reactivity of both tautomeric forms. Finally thermodynamic
calculations were performed using different dielectric media, in order to verify the
stability of the intermediate ylide formation under the form APH⁺ owing to
protonation of the pyrimidine ring by the amino acid glutamate. The computations
were performed using the GAUSSIAN 03 software package, using the density
functional theory (DFT) at B3LYP/631++G(d,p) for the exploration of the SEP
and B3LYP(CPCM)/6311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p) for thermodynamic
calculations, while reactivity studies were performed using the software package
Jaguar 7.7 employing B3LYP/631++G(d,p). The results obtained indicated that the
formation of LThDP occurs in a concerted way, showing an activation barrier of
approximately 21 Kcal / mol. Also was observed that the ylide in the AP form is
responsible for the nucleophilic attack on the molecule of pyruvate.

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Índice general
CAPITULO 1: Introducción………………………………………………………….……………….1
1.2 Propuestas de investigación................................................................................... 6
1.3 Propuestas de investigación................................................................................. 11
1.4 Hipótesis y objetivos del trabajo de tesis ............................................................ 13
1.4.1 Hipótesis .............................................................................................. 13
1.4.2 Objetivos .............................................................................................. 13
CAPITULO 2: Metodología..................................................................................... 14
2.1 Construcción de la SEP con los sustratos aislados ............................................ 15
2.2 Cálculos de reactividad ....................................................................................... 17
2.3 Cálculos termodinámicos ................................................................................... 18
2.3.1 Cálculos en fase gas ............................................................................. 18
2.3.2 Cálculos en solución ............................................................................ 19
CAPITULO 3: Resultados y discusión .................................................................... 20
3.1 Exploración de la SEP con los sustratos aislados .............................................. 21
3.1.1 SEP a nivel semiempirico ................................................................... 21
3.1.2 Corrección DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................ 28
3.1.3 Optimización de los puntos críticos de SEP DFT al nivel B3LYP/6
31++G(d,p) .................................................................................................... 30
3.2 Estudio de reactividad ........................................................................................ 36
3.3 Análisis termodinámico ...................................................................................... 39
CAPITULO 4: Conclusiones y proyecciones ......................................................... 41
4.1 Conclusiones ....................................................................................................... 42
4.2 Proyecciones ....................................................................................................... 43
Bibliografía ................................................................................................................ 44

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Índice de figuras
Figura 1: síntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato................... 6
Figura 2: estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros Φp y ΦT .................. 7
Figura 3: mecanismo de protonación del cofactor ThDP correspondiente a las
etapas de activación del cofactor para formación del intermediario Iluro ................ 8
Figura 4: estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y
el grupo difosfato ......................................................................................................... 9
Figura 5: ciclo catalítico de la enzima AHAS reportado en literatura ..................... 10
Figura 6: mecanismo de formación del intermediario LThDP en literatura......... 12
Figura 7: mecanismo postulado para la formación del intermediario LThDP............... 12
Figura 8: coordenadas de reacción para exploración de SEP en la formación del
intermediario LThDP............................................................................................... 15
Figura 9: equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=
CH2CH2OH. ............................................................................................................. 18
Figura 10: ciclo termodinámico para calculo de ΔG° del equilibrio en solución.... 19
Figura 11: representación 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3....................... 22
Figura 12: representación bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3..... 22
Figura 13: estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en
fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET1, (C) intermediario I, (D)
estado de transición ET2, (E) producto LThDP .................................................... 23
Figura 14: estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario
I................................................................................................................................... 24
Figura 15: mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario
LThDP mediante cálculos a nivel PM3................................................................... 27
Figura 16: diagrama de energía para SEP a nivel semiempírico PM3..................... 27

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Figura 17: representación 3D de la superficie de energía potencial a nivel DFT... 28
Figura 18: representación 2D de la superficie de energía potencial a nivel DFT... 29
Figura 19: estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel DFT optimizados en
fase gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET, (C) producto LThDP......... 30
Figura 20: estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT..................... 31
Figura 21: estructura del estado de transición ET con el stretching simultáneo de las
coordenadas de reacción C2C2α y H4’O2α.......................................................... 32
Figura 22: esquema de los cálculos IRC aplicados al estado de transición ET....... 32
Figura 23: estabilización por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de
protonación del anillo de aminopirimidina en la forma AP con R¹ igual a 5(2
[hidroxidifosfato]etil)4metil1,3tiazol3io.............................................................. 33
Figura 24: mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario
LThDP mediante cálculos a nivel B3LYP/631++G(d,p)....................................... 35
Figura 25: diagrama de energía para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p).............. 35
Figura 26: funciones de Fukui para el (A) APH⁺Iluro, (B) APIluro, (C) estado
de transición ET y (D) piruvato. Función de Fukui para (E) piruvato............... 36
Figura 27: índices atómicos de Fukui para APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=
CH2CH2OH .............................................................................................................. 37
Figura 28: índices atómicos de Fukui (A) y (B) para la molécula de piruvato
.................................................................................................................................... 37
Figura 29: índices atómicos de Fukui y , en paréntesis, para el estado de
transición ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.......................................... 38
Figura 30: equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=
CH2CH2OH .............................................................................................................. 39
f -
f +
f -
f -
f +
f -
f +

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Índice de tablas
Tabla I: valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y de los ángulos diedros Φp
y ΦT para los puntos críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel
semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3......................................................... 23
Tabla II: valores de longitudes y ángulos de enlace para los puntos críticos de la
SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el hamiltoniano PM3
.................................................................................................................................... 24
Tabla III: valores de cargas atómicas tras MPA para los puntos críticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel PM3........................................................................ 24
Tabla IV: valores de longitudes de enlace del anillo pirimidínico para los puntos
críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el
hamiltoniano PM3..................................................................................................... 26
Tabla V: ordenes de enlace de Mulliken del anillo pirimidínico para los puntos
críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel semiempirico utilizando el
hamiltoniano PM3..................................................................................................... 26
Tabla VI: valores de cargas atómicas tras MPA para el anillo pirimidínico del
cofactor ThDP en el mecanismo de reacción obtenido a nivel PM3..................... 26
Tabla VII: valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y los ángulos diedros Φp
y ΦT para los puntos críticos de la SEP en fase gas a con el método DFT a nivel 6
31++G(d,p)................................................................................................................. 30
Tabla VIII: valores de longitudes de enlace de los puntos críticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31
Tabla IX: valores de ángulos de enlace para los puntos críticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP/631++G(d,p)............................................ 31
Tabla X: valores de ordenes de enlace para los puntos críticos de la SEP
optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............................................. 31

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Tabla XI: valores de cargas atómicas tras análisis NBO para los puntos de críticos
de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p) ................................................................... 33
Tabla XII: valores de longitudes de enlace para el anillo pirimidínico de los puntos
críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p) ............... 34
Tabla XIII: valores de ordenes de enlace NBO para el anillo pirimidínico de los
puntos críticos de la SEP optimizados en fase gas a nivel B3LYP 631++G(d,p)... 34
Tabla XIV: valores de cargas atómicas del tipo NBO para el anillo pirimidínico del
cofactor ThDP en el mecanismo de reacción a nivel B3LYP/631++G(d,p) ...... 34
Tabla XV: valores de ΔG° para la reacción acido base entre el residuo altamente
conservado Glu139, simulado con una molécula de acido acético y APIluro....... 39

Capitulo 1: Introducción
Licenciatura en QuímicaQuímico Universidad de Concepción 1 1
Capítulo 1
Introducción
n este capítulo se dará una breve descripción de lo que son las enzimas y
sus propiedades. Posteriormente, se expondrán aspectos generales de la
enzima AHAS tales como: los organismos en que se encuentra, las
reacciones que cataliza, los cofactores que posee y el ciclo catalítico que hasta el
momento se le ha postulado en literatura. Esto permitirá revelar las interrogantes
asociadas a la enzima y así dar paso a la propuesta de trabajo en que está enfocada
esta tesis.
E

1.1 Enzimas.
Las enzimas son proteínas globulares, de gran tamaño y que funcionan como
catalizadores biológicos. Están formadas por largas cadenas de aminoácidos unidos
a través de enlaces peptídicos¹. Estas cadenas de residuos de aminoácidos
presentan una secuencia definida, la cual otorga las propiedades específicas que
posee cada enzima. En este sentido las enzimas pueden presentar diferentes
estructuras de ordenamiento: la primera de ellas corresponde a la secuencia de
aminoácidos de la cual está constituida la enzima y es lo que se considera como la
estructura primaria. El siguiente nivel de organización abarca a las hélices alfa y a la
conformación beta plegada, estas dos formas están determinadas por el tipo de
interacción entre las cadenas laterales de aminoácidos de distintos polipeptidos
dentro de la enzima y son las que componen las estructuras secundarias. La
estructura terciaria corresponde a la disposición tridimensional de todos los átomos
que componen la proteína. Por último se encuentra la estructura cuaternaria, la
cual se compone de complejos de más de una cadena polipeptídica². Estos tipos de
plegamientos están regidos por las interacciones entre los enlaces no covalentes
presentes en el ambiente enzimático. Estas interacciones corresponden a enlaces de
hidrógeno, enlaces iónicos y a fuerzas de Van der Waals las cuales ayudan a
mantener la forma de las enzimas³. Es así como la distribución de los
aminoácidos polares y no polares orientan la forma en que se pliegan las enzimas.
Las cadenas laterales apolares tienden a agruparse en el interior de la enzima,
mientras que las cadenas laterales polares, tienden por sí mismas a disponerse cerca
del exterior. En general una enzima siempre se pliega de tal forma que su
estructura adopte la menor energía libre posible⁴. Las diferencias de plegamientos y
formas, definen las llamadas isoenzimas o isozimas. Estas enzimas corresponden a
enzimas que difieren en su secuencia de aminoácidos y por ende en su
ordenamiento estructural. Sin embargo se caracterizan principalmente por catalizar
la misma reacción química que otras enzimas, pero mostrando diferentes
parámetros cinéticos⁵’⁶.

Cada enzima actúa sobre un sustrato específico y generalmente cataliza
exclusivamente una sola reacción, aunque esto varía dependiendo de la cantidad de
cofactores que presente cada enzima en su composición. La región en que las
enzimas llevan a cabo la reacción con los sustratos se denomina sitio activo. Las
enzimas en su sitio activo requieren además de la presencia de moléculas no
proteicas para ejercer su actividad catalítica que se denominan cofactores, estas
pueden ser metales divalentes o moléculas orgánicas que reciben el nombre de
coenzimas.
En un principio se pensaba que esta interacción enzimasustrato ocurría bajo el
modelo de “llave cerradura”, pero sin embargo este modelo falla al intentar explicar
la estabilización de los estados de transición. Por este motivo Daniel Koshland⁷
sugiere en 1958 el modelo de acoplamiento o encaje inducido, en donde se
establece que las enzimas son estructuras bastante flexibles con lo que el sitio activo
podría cambiar su conformación estructural debido a la interacción con el sustrato.
Como resultado, las cadenas aminoacídicas que componen el sitio activo
interactúan específicamente con los distintos cofactores y sustratos, permitiendo a la
enzima llevar a cabo su función catalítica. Existe un tercer modelo, llamado tensión
sobre el sustrato, que es derivado del modelo de Koshland⁸. En este modelo el
sustrato es tensionado hacia la formación del producto como resultado de una
transición conformacional inducida por la enzima, la cual deforma los ángulos de
enlace y activa al sustrato.
Una manera de cuantificar la interacción enzimasustrato es a partir de la constante
de Michaelis (Km), obtenida desde la ecuación de MichaelisMenten. Esta
constante tiene una gran importancia práctica debido a que es independiente de la
concentración de la enzima, permite el cálculo de la concentración de sustrato que
conduce a la velocidad correspondiente al 50% de la velocidad máxima de reacción
y constituye una medida de afinidad de las enzimas por el sustrato. Dentro de este
ámbito existen además otros factores que influyen en la interacción enzimasustrato
y que están directamente relacionados con la actividad enzimática. Entre ellos se
encuentran la temperatura, la cual cuando aumenta también lo hace la velocidad
enzimática, pero si esta aumenta demasiado se produce la desnaturalización del
ambiente proteico, con lo que se anula la actividad enzimática. Otro factor es el
pH, el cual es específico para la actividad máxima en cada enzima y basta un

pequeño cambio para provocar la desnaturalización de esta, que en otras palabras
se refiere a la modificación de todas las estructuras de la enzima, excepto la
estructura primaria. Los diferentes tipos de cofactores, el efecto de la concentración
de sustrato y de los productos finales, la existencia de isoenzimas, además de
modificaciones alostéricas y covalentes en la estructura proteica de las enzimas,
también provocan variaciones de la actividad enzimática. Uno de los factores más
importantes que influyen en la actividad enzimática y que generan un gran interés
debido a sus aplicaciones, es la presencia de inhibidores. Estos pueden clasificarse
según la forma en que interactúan con las enzimas, la cual puede ser de forma
reversible o irreversible. Los inhibidores irreversibles reaccionan con la enzima
para producir una proteína que no tiene actividad enzimática y a partir de la cual es
imposible regenerar la enzima original. En cambio los reversibles se unen
covalentemente a la enzima pero posteriormente puede ser liberado, por lo que se
habla de una unión temporal. Dentro de esta última clasificación estos pueden
subdividirse según la manera en que intervienen en la reacción, de forma
competitiva y no competitiva con respecto al sustrato⁹.
En la actualidad se conoce un gran número de enzimas, las cuales catalizan una
amplia gama de reacciones en los más diversos organismos. Por este motivo la
Unión Internacional de Bioquímica y Biología Molecular ha desarrollado una
nomenclatura para identificar a las enzimas, basada en los denominados números
EC (Enzyme Commission), donde la clasificación comienza con las letras EC,
seguidas por cuatro números los cuales están separados por puntos. El primer
número indica la clase principal de la enzima y los siguientes son especificaciones
progresivas. Las clases principales se dividen en: 1. Oxidoreductasas: que catalizan
reacciones de oxidorreducción; 2. Transferasas: que transfieren grupos activos a
otras unidades receptoras, pero no transfieren moléculas de agua; 3. Hidrolasas: las
cuales catalizan reacciones de hidrólisis con la consiguiente obtención de
monómeros a partir de polímeros; 4. Liasas: que catalizan reacciones en las que se
adicionan grupos a dobles enlaces o se forman dobles enlaces a través de la
eliminación de grupos H2O, CO2 y NH3; 5. Isomerasas: que transfieren grupos
dentro de la misma molécula para formar isómeros; 6. Ligasas: que catalizan la
degradación o síntesis de los enlaces CC, CS, CO y CN mediante el
acoplamiento de moléculas de alto valor energético.

Dentro de la clasificación de las transferasas se encuentra una de las enzimas más
importantes para la vida de organismos tales como bacterias, hongos y plantas. La
enzima acetohidroxi sintasa, conocida comúnmente como AHAS o acetolactato
sintasa se denomina con el número EC 2.2.1.6. El primer número se debe a que la
AHAS participa en las primeras etapas de la ruta biosintética de los aminoácidos de
cadena ramificada valina, leucina e isoleucina, por lo que sus productos son
transferidos a otras enzimas de la ruta biosintética, (transferasa). El segundo
número, el 2, se debe a que las moléculas transferidas poseen al menos un grupo
cetónico en su estructura. En tanto el tercer número, el 1, denota que la enzima
corresponde a una transcetolasa (transfiere moléculas formadas por la
condensación de dos átomos de carbono). Por último el numero 6 corresponde
solo a un número arbitrario de clasificación para las transferasas¹⁰.
La producción de los aminoácidos de cadena ramificada en la que está involucrada
la AHAS es de vital importancia para el desarrollo y crecimiento de los organismos
antes mencionados. La inhibición de esta enzima y por ende de la producción de
estos aminoácidos conduce a la muerte de los organismos. Con esta característica la
AHAS se ha convertido en el principal blanco de inhibidores, entre los que se
encuentran herbicidas, fungicidas y agentes antimicrobianos. Los herbicidas se
utilizan en las plantaciones para la eliminación de malezas, las cuales son dañinas ya
que compiten directamente con los cultivos por el acceso al agua, al sol y a los
nutrientes. En tanto los agentes antimicrobianos se han desarrollado para la
eliminación de bacterias responsables de enfermedades tales como la
tuberculosis¹¹.

1.2 AHAS.
El acido acetohidroxi sintasa (AHAS; EC 2.2.1.6) es una enzima que se encuentra
en plantas, algas, hongos y bacterias, tal como se mencionó anteriormente. Su
función es catalizar los primeros pasos comunes que posee la ruta biosintética de
los aminoácidos de cadena ramificada valina, leucina e isoleucina. Las reacciones
que cataliza la AHAS consisten en la condensación de dos moléculas de αceto
ácidos, figura 1. En primera instancia cataliza la descarboxilacion, de forma
irreversible y no oxidativa, de una molécula de piruvato.
Figura 1. Síntesis de (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2hidroxibutirato. Los átomos de
carbono en negro, los de oxigeno en rojo y los de hidrógenos en blanco.
Posteriormente la enzima puede formar dos tipos de productos, dependiendo de
cuál sea el segundo αceto ácido en reaccionar. Si este corresponde a una segunda
molécula de piruvato, se produce la formación de (2S)2acetolactato (AL), el cual
es el precursor de los aminoácidos de cadena ramificada valina y leucina. Pero si el
segundo sustrato corresponde a una molécula de 2cetobutirato (2CB) se produce
la formación de (2S)2aceto2hidroxibutirato (AHB) el cual es el precursor del
aminoácido de cadena ramificada isoleucina¹¹⁻¹³.

N
N
CH2
N
+
S
NH 2 C H 3
CH 3
CH2
CH2
O
P
O
O
O

P
OH
O
O

H
Mg
2+
1`
1 2
3
4
5
2`
3`
4`
5`
6` 6
7
7` PF
TF
La AHAS pertenece a la familia de las enzimas tiamina dependiente, ya que para su
actividad catalítica requiere del cofactor tiamina difosfato (ThDP). Pero además, la
AHAS requiere de la presencia de otros dos cofactores. El primero corresponde al
metal divalente Mg²⁺ y el segundo corresponde al cofactor flavina adenina
dinucleotido (FAD)¹⁴.
El cofactor encargado de llevar a cabo las reacciones al interior de la enzima es el
cofactor 3[(4’amino2’metilpirimidina5’il)metil]5(2[hidroxidifosfato]etil)4
metil1,3tiazolio, el cual es el derivado activo de la vitamina B1 y es conocido
comúnmente como ThDP. Este cofactor está formado por un anillo tiazolio y por
un anillo pirimidínico. El anillo pirimidínico se encuentra sustituido en la posición
2’ por un grupo metilo y en la posición 4’ por un grupo amino. Ambos anillos están
enlazados a través de un carbono puente con el cual forman los ángulos diedros ΦP
= N3C7’C5’C4’ y ΦT = C2N3C7’C5’ tal como se muestra en la figura 2. Las
tres conformaciones básicas que puede adoptar el ThDP debido a la torsión de
estos diedros son: la conformación tipo F (± 90°, 0°), la conformación tipo S (±
150°, ±100°) y la conformación tipo V (± 70°, ±95°)¹⁵, en donde el primer valor
corresponde al diedro Φp y el segundo al diedro ΦT, respectivamente.
Figura 2. Estructura del cofactor tiamina difosfato con diedros Φp y ΦT.
La conformación tipo V es la que confiere la actividad al ThDP, debido a la
cercanía existente entre el grupo imino del anillo pirimidínico y el hidrógeno
enlazado al carbono C2 en el anillo tiazolio, entre los cuales existe una distancia
promedio de 3.0 Å. Esta cercanía permite la abstracción del hidrógeno enlazado al
carbono C2 por parte del grupo imino, produciendo de esta manera la formación
de la especie activa conocida como iluro¹⁴’¹⁵, figura 3. Estas etapas de activación
consideran un equilibrio tautomerico que comienza con la protonación del
nitrógeno N1’ por parte del aminoácido altamente conservado acido glutámico
(Glu139 en la AHAS). Con esto el anillo de aminopirimidina pasa de la forma 4’

aminopirimidina (AP) a la forma 4’aminopirimidinio (APH⁺). Luego, el grupo
amino cuaternario cede uno de sus protones y el anillo queda en la forma 1’,4’
iminopirimidina (IP). Por último, el grupo imino del anillo de pirimidina en la
forma IP extrae el átomo de hidrógeno enlazado al carbono C2 formando la
especie altamente reactiva iluro. Se ha postulado que estas etapas de activación son
comunes para todas las enzimas tiamina dependientes, al igual que los dos
primeros pasos del ciclo catalítico de la AHAS ¹¹’¹⁶⁻¹⁸.
Figura 3. Mecanismo de protonación del cofactor ThDP correspondiente a las etapas de
activación del cofactor (verde) para formación del intermediario iluro (azul).
Por otra parte en lo que respecta al anillo tiazolio, éste además de estar unido al
carbono puente, se encuentra enlazado por su otro extremo a un grupo
etilhidroxidifosfato, el cual a su vez esta unido al metal divalente Mg²⁺. Este metal
cumple la función de anclar al ThDP al sitio activo de la AHAS al interactuar con
dos aminoácidos del ambiente enzimático, los cuales corresponden específicamente
a un ácido aspártico y a una asparraguina¹⁷.
El otro cofactor presente en la AHAS y que no interacciona con sustratos debido a
que la AHAS no lleva a cabo reacciones de oxidoreducción, es el cofactor flavina
adenina dinucleotido (FAD). Este cofactor está compuesto por una unidad de
riboflavina (vitamina B2), que está unida a un grupo pirofosfato, el cual que está
enlazado a una ribosa, la que a su vez está unida a una adenina, figura 4. Se ha
postulado que el FAD confiere dos propiedades fundaméntales a la AHAS, una de
ellas consiste en el aumento de la actividad catalítica de la enzima cuando este

N
N
N
N
O
N H 2
O
OH O H
O
P
O
O
O H
P
O
OH
OH
O H
OH
N
NH N
O
O
CH 3
C H 3
cofactor se encuentra presente y la otra es que estimula a la AHAS a adoptar la
conformación de tetrámero, confiriendo al FAD un rol estructural dentro de la
enzima¹³’¹⁹.
Figura 4. Estructura del cofactor FAD, las unidades de riboflavina, adenina, ribosa y el
grupo difosfato se muestran con los colores: azul, rojo, verde y amarillo, respectivamente.
El ciclo catalítico de la AHAS postulado hasta el momento²⁰⁻²² se muestra en la
figura 5. Consta de cuatro pasos principales, el primero de estos pasos se compone
de un ataque nucleofílico por parte del carbono C2 del intermediario iluro sobre el
carbono carbonílico de una molécula de piruvato, generando al intermediario (2S)
2[(1carboxi1hidroxi)etil]tiaminadifosfato también conocido como 2lactil
tiaminadifosfato (LThDP). En el segundo paso el LThDP sufre una
descarboxilación dando origen al segundo intermediario del ciclo catalítico: el 2(1
hidroxietil)tiaminadifosfato (HEThDP). Una característica importante de este
intermediario es que sus dos estructuras resonantes correspondientes a la forma de
enamina y la forma activa C2αcarbanión poseen diferente reactividad, siendo más
estable la forma de enamina. En tanto la forma C2αcarbanión es la que continúa
con el ciclo catalítico de la AHAS, dando origen al tercer paso del ciclo. En este
tercer paso el HEThDP, en su forma aniónica, reacciona con el segundo αceto
ácido, el cual puede ser una molécula de piruvato o una molécula de 2cetobutirato.
En esta etapa el carbono C2 realiza un ataque nucleofílico sobre el carbono
carbonílico de la segunda molécula de sustrato en cuestión, formando el
intermediario (1S,2S)2[(2carboxi1,2dihidoxi1,2dimetil)etil]tiaminadifosfato,
comúnmente conocido como 2acetolactatotiaminadifosfato (ALThDP), cuando
reacciona con una molécula de piruvato, como también el intermediario (1S,2S)2
[(2carboxi1,2dihidoxi2etil1metil)etil]tiaminadifosfato que comúnmente recibe

el nombre de 2acetohidroxibutiratotiaminadifosfato (AHBThDP) cuando
reacciona con la molécula de 2cetobutirato, respectivamente.
Figura 5. Ciclo catalítico de la enzima AHAS reportado en literatura.
De acuerdo a lo postulado en bibliografía, un punto a destacar en este tercer paso
es que al igual que en el paso número uno del ciclo, aquí también es necesaria la
presencia de algún residuo cercano al cofactor que posea un grupo ionizable capaz
de protonar al oxígeno carbonílico del segundo αceto ácido. Por último, en el paso
número cuatro del ciclo catalítico el producto es liberado tras el rompimiento del
enlace C2C2α y el cofactor ThDP es regenerado en la forma de iluro el cual se
reinserta nuevamente en el ciclo. Pero, además en este cuarto paso, nuevamente es
necesaria la presencia de algún residuo cercano al cofactor que posea un grupo
ionizable, el cual ahora debe promover la extracción del hidrógeno ubicado en el
primer hidroxilo formado de los intermediarios ALThDP o AHBThDP, según
sea el caso, con el fin de formar los productos (2S)2acetolactato y (2S)2aceto2
hidroxibutirato, respectivamente¹¹’²⁰⁻²². Sin embargo, a raíz de los análisis de la
estructura cristalina de la AHAS presentados en literatura, los aminoácidos
cercanos al sitio activo de la enzima y principalmente aquellos que se encuentran

próximos al grupo amino del anillo pirimidínico y al carbono C2 del anillo tiazolio,
no poseen grupos ionizables capaces de realizar estas funciones¹¹. Debido a estas
interrogantes, se ha postulado para los pasos número 3 y 4 del ciclo, la posibilidad
de que el mecanismo ocurra intramolecularmente sin la presencia de grupos
ionizables pertenecientes a cadenas laterales cercanas al sitio activo²³.
1.3 Propuesta de investigación.
En los últimos 30 años se han publicado una gran cantidad de artículos
relacionados con esta enzima, con el fin de comprender en su totalidad los
mecanismos de activación e inhibición. Entre los aspectos más relevantes que se
han publicado se encuentran por ejemplo la obtención de la estructura cristalina de
la AHAS a partir de extracciones de la enzima realizadas a diversas bacterias, clases
de hongos y tipos de plantas. Además se han realizado estudios enfocados tanto en
su actividad catalítica, como también en la detección de los intermediarios
presentes en el ciclo catalítico, para los cuales además se han determinado las
constantes de velocidad de formación¹¹’¹⁴’²¹⁻²³. Sin embargo, a pesar de esta gran
cantidad de estudios realizados, aun existen interrogantes relacionadas con esta
enzima. Entre estas interrogantes se encuentran aspectos relacionados directamente
con su ciclo catalítico, referentes a la forma en que ocurren los mecanismos de
reacción que dan paso la formación de los intermediarios en los distintos pasos del
ciclo catalítico, además de la ausencia de grupos ionizables cercanos al sitio activo
capaces de promover transferencias protónicas para la formación de estos
intermediarios. En lo que respecta a estas interrogantes, uno de los pasos del ciclo
catalítico de la AHAS que se ve principalmente afectado por la falta de estos grupos
ionizables y del cual además se desconoce la forma en que ocurre su mecanismo de
reacción, es el paso número 1 del ciclo catalítico, correspondiente a la formación
del LThDP. Tal como se describió en la sección anterior, este paso consta de un
ataque nucleofílico por parte del cofactor tiamina difosfato (ThDP) hacia el primer
sustrato incorporado en el ciclo catalítico de la AHAS correspondiente a una
molécula de piruvato cuando el cofactor ThDP se encuentra bajo la forma de iluro,
figura 6.

Figura 6. Mecanismo de formación del intermediario LThDP en literatura.
Además, en este paso se requiere de la protonación del oxígeno carbonílico de la
molécula de piruvato, para la formación del intermediario LThDP²⁴. Pero, debido
a que en el sitio activo de la enzima no existe la presencia de algún ácido o de un
grupo de similares características¹¹’²³, el origen del protón requerido en esta etapa
del ciclo catalítico es desconocido.
Como una posible respuesta a esta interrogante, en la presente tesis se ha propuesto
un mecanismo para la formación del intermediario LThDP, el cual no requiere de
la presencia de un grupo con carácter ácido aledaño al sitio activo de la enzima.
Con esto se postula que el origen del hidrógeno requerido en esta etapa del ciclo
catalítico proviene del mismo cofactor ThDP, específicamente del grupo imino
cuaternario presente en el anillo de pirimidina cuando este se encuentra en la
forma de APH⁺, figura 7.
Figura 7. Mecanismo postulado para la formación del intermediario LThDP.

1.4 Hipótesis y objetivos del trabajo de tesis.
1.4.1 Hipótesis.
La protonación del oxígeno carbonílico de la molécula de piruvato en la
formación del intermediario LThDP, se lleva a cabo por el grupo 4’imino
del intermediario iluro, cuando este se encuentra con el anillo pirimidínico
bajo la forma de APH⁺.
1.4.2 Objetivos.
· Objetivo general: modelar teóricamente mediante métodos mecánico
cuánticos el mecanismo de reacción postulado para la formación del
intermediario LThDP desde el punto de vista de la cinética, reactividad y
termodinámica.
· Objetivos específicos:
1. Cinética: explorar el mecanismo de reacción y determinar la barrera
de activación para la formación del LThDP, considerando los
sustratos aislados en fase gas, mediante la construcción de una
superficie de energía potencial (SEP) con el anillo pirimidínico en la
forma de APH⁺ al momento de realizar la trasferencia protónica.
2. Reactividad: calcular las funciones de Fukui y los índices atómicos
de Fukui para los reactantes y estado de transición.
3. Termodinámica: calcular los DG° en fase gas y en solución para la
reacción acido base entre el residuo altamente conservado GLU139
y el intermediario iluro bajo las formas AP y APH⁺, utilizando
solventes con distintos valores de constante dieléctrica.

Capitulo 2: Metodología
Capitulo 2
Metodología
n este capítulo se presenta la metodología empleada para la construcción
de las SEP con los sustratos aislados en fase gas a nivel semiempírico y las
posteriores correcciones energéticas para las estructuras obtenidas
empleando la teoría de los funcionales de densidad (DFT), además se indica la
metodología utilizada para los cálculos termodinámicos tanto en fase gas como en
solución. También se presenta la metodología empleada para el cálculo de las
funciones de Fukui a las distintas moléculas de interés.
E

N
N
N
+
S
C

C H 3 CH 2
N
+
H
H
H CH 2
OH
C H 3
CH 3 COO

CO 2

CH 3 O R2
R1
C2a
C1
O2a
C2
H4`
.
..
.
2.1 Construcción de la SEP con los sustratos aislados.
Para la construcción y exploración de la superficie de energía potencial (SEP) en
fase gas y con los sustratos aislados, se consideraron dos coordenadas de reacción
tal como se observa en la figura 8. Una de las coordenadas corresponde al ataque
nucleofílico entre el carbono C2 y el carbono carbonilico C2α (R1) y la otra
corresponde a la transferencia protónica de uno de los hidrogeno enlazados al
grupo 4’amino cuaternario hacia el oxígeno carbonilico del piruvato (R2).
Figura 8. Coordenadas de reacción para exploración de SEP en la formación del
intermediario LThDP.
Con el propósito de considerar de una manera simple el ambiente apoenzimatico
en la construcción de la SEP se realizaron tres aproximaciones. En primer lugar, en
todos los cálculos se consideró al cofactor ThDP en la conformación tipo V con
valores para ΦP de 66° y ΦT de +96°, obtenidos de la estructura cristalina de la
AHAS¹⁴. En segundo lugar, en todos los cálculos realizados al intermediario L
ThDP, este siempre se consideró con la estructura del enantiómero S. Por último,
en todas las estructuras se incluyó al residuo altamente conservado glutamato,
debido a la importante interacción que posee con el átomo N1’ del anillo
pirimidínico¹⁷. Este aminoácido fue reemplazado por una molécula de acido
acético, con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxílato del acido
glutámico²⁵’²⁶. Lo mismo se hizo con el grupo hidróxidifosfato, el cual se
reemplazo con un grupo hidroxilo debido a que su rol solo consta en anclar el
ThDP al sitio activo, por lo que no tiene ninguna contribución en la actividad
catalítica del cofactor²³’²⁴’²⁷. Además, en ninguno de los cálculos se incluye el
metal divalente Mg²⁺ ya que su rol es coordinar el grupo difosfato del ThDP y
además no tiene participación directa en la catálisis¹⁴’¹⁷.

Posteriormente esta estructura se optimizó utilizando el hamiltoniano PM3
(Parameterized Model number 3) con el programa MOPAC 2009²⁸⁻³⁰. Una vez
optimizada la molécula se restringió la longitud de enlace C1C2α a una distancia
de 1.55 Å y se optimizó nuevamente. A continuación, con este resultado se
generaron 73 estructuras diferentes, las cuales se obtuvieron al cambiar la distancia
de la coordenada de reacción R1 desde 1.40 Å hasta 5.00 Å con intervalos de 0.05
Å. En cada una de estas estructuras se restringieron longitudes de enlaces, ángulos
de enlaces y ángulos diedros con la finalidad de resaltar solo lo cambios de energía
producidos únicamente por las coordenadas de reacción en estudio y además para
reproducir de cierta forma la rigidez del cofactor en el sitio activo de la enzima.
Luego, en cada una de estas estructuras la coordenada R2 fue variada entre 3.70 Å
y 0.9 Å con intervalos de 0.034 Å, asegurando de esta manera que ambas
coordenadas de reacción, tanto R1 como R2, tuviesen un total de 72 pasos cada
una. A continuación la energía de cada una de las 5300 estructuras se graficó en
función de la coordenadas R1 y R2 con el programa SigmaPlot 10.0³¹,
construyendo de esta manera la SEP a nivel semiempírico utilizando el
hamiltoniano PM3. Para encontrar los estados de transición en esta superficie se
seleccionaron estructuras representativas correspondientes a la región de los puntos
de silla de la superficie y se procedió a su optimización y posteriores cálculos de
frecuencia con el programa MOPAC 2009³².
Sin embargo, debido a las conocidas limitaciones que presenta el método
PM3³³’³⁴, la SEP PM3 fue corregida utilizando “Density Functional Theory”
(DFT)³⁵ a nivel B3LYP/631++g(d,p)³⁶’³⁷. Para esto con el software GAUSSIAN
03³⁸ se realizaron cálculos single points de las estructuras optimizadas a nivel PM3.
Posteriormente estas energías corregidas se graficaron versus las coordenadas de
reacción R1 y R2 para obtener la SEP corregida a nivel DFT. A las estructuras
optimizadas al nivel B3LYP/631++g(d,p) de los posibles estados de transición de la
SEP se les realizó un cálculo IRC³⁹ (Intrinsic Reaction Coordinate) al mismo nivel
de teoría, con la finalidad de confirmar el estado de transición correspondiente a la
reacción de interés. Este cálculo condujo hacia reactantes y producto, y sus
resultados fueron comparados con las estructuras optimizadas a nivel B3LYP/6
31++g(d,p) del sistema reactantes y del producto obtenidas a partir de la SEP DFT.

2.2 Cálculos de reactividad.
Para los estudios de reactividad se calcularon las funciones de Fukui y los índices
atómicos de Fukui y ⁴⁰⁻⁴². Estas funciones e índices atómicos permitieron
visualizar y cuantificar respectivamente, la reactividad de las distintas especies
involucradas en la reacción de formación del LThDP. La función (r) refleja la
reactividad global de la molécula respecto a un centro electrofílico. En tanto la
función (r) refleja la reactividad hacia un eventual ataque nucleofílico³³. Estas
funciones están definidas por las ecuaciones 1 y 2.
( ( ) ( )) / N N
f r rd
r r d+ +
= - (1)
( ( ) ( )) / N N
f r rd
r r d- -
= - (2)
Con estas ecuaciones las funciones de Fukui fueron calculadas mediante una
aproximación de diferencias finitas, donde N es el número de electrones, ρ es la
densidad electrónica de cierto átomo (r) y δ es una fracción de un electrón, donde
el valor utilizado fue de 0.01. En tanto para el análisis de los índices atómicos de
Fukui³³’⁴¹’⁴², estos se calcularon simultáneamente con los de las funciones de
Fukui mediante la metodología implementada en el paquete computacional Jaguar
7.7⁴³’⁴⁴ y con la ayuda de la interfaz grafica Maestro 9.1⁴⁵.
Los resultados de las funciones de Fukui fueron entregados y visualizados como
isosuperficies, mientras las funciones atómicas de Fukui, también conocidas como
las funciones condesadas de Fukui³³, se obtuvieron por el cálculo descrito en las
ecuaciones 1 y 2, correspondientes al cambio de densidad electrónica entre las
moléculas neutras y sus especies radicales, donde se registró la población
electrónica sobre los átomos de las moléculas analizadas⁴⁰’⁴²’⁴⁶. Para la obtención
de las poblaciones atómicas se realizaron cálculos del tipo MPA (Mulliken
Population Analysis)⁴⁷, análisis implementado en la metodología de Jaguar 7.7 para
el cálculo de funciones de Fukui²⁷’⁴⁸.
f +
f -
f -
f +

2.3 Cálculos termodinámicos.
2.3.1 Cálculos en fase gas.
Las estructuras que se muestran en la figura 9, fueron optimizadas en fase gas con
el software GAUSSIAN 03 y utilizando la teoría de los funcionales de densidad al
nivel B3LYP/631++G(d,p). Posteriormente sobre las estructuras optimizadas se
realizaron cálculos de frecuencia al nivel de teoría a B3LYP/6311G³³’³⁸.
Figura 9. Equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1= CH2CH2OH.
Los resultados de las funciones termodinámicas entregadas por los cálculos de
frecuencia fueron obtenidos de acuerdo a las ecuaciones 3, 4 y 5. Donde ESCF es la
energía potencial (SelfConsistent Field Energy), ZPE es la energía del punto cero
(Zero Point Energy), kB es la constante de boltzmann, T la temperatura y EInt es la
suma de las energías trasnacional, rotacional, vibracional⁴⁹. Con el valor de la
energía libre de las moléculas de la figura 9 se calculó el valor del DG° para
reacción acido base entre en residuo y los tautómeros APIluro y APH⁺Iluro.
tot SCF Int E E ZPE E= + + (3)
corr tot B H E k T= + (4)
corr corr tot G H TS= - (5)

2.3.2 Cálculos en solución.
Las estructuras de la figura 9 fueron optimizadas en fase gas. Los efectos de
solvatación implícita fueron modelados de acuerdo al modelo CPCM (Conductor
Polarizable Continuum Model)⁵⁰’⁵¹, tal como está implementado en Gaussian 03.
Las constantes dieléctricas de los medios considerados fueron 2.01 y 32.63³⁸’⁵²,
como paradigmas de medios apolares y polares respectivamente, con el fin de
resaltar el efecto del ambiente enzimático, tratando de simular en primer lugar las
estabilizaciones producidas por las fuerzas de Van der Waals que otorgan los
residuos cercanos al sitio activo y que generan un ambiente hidrofóbico de una
constante dieléctrica con valores entre 2 y 4¹⁸. Para el segundo caso se intento
simular el ambiente enzimático en el interior de la enzima, pero ahora
considerando las estabilizaciones de carácter electrostático por parte de
aminoácidos que presentan grupos ionizados²³’⁵³. Además todos los cálculos
fueron hechos considerando al residuo altamente conservado glutamato
interactuando con el átomo N1’ como una forma simple de considerar el ambiente
apoenzimatico. Este residuo fue reemplazado por una molécula de acido acético,
con el fin de simular de una forma simple el grupo carboxílato del acido glutámico.
Las energías libres en solución fueron calculadas a nivel B3LYP(CPCM)/6
311++G(d,p)//B3LYP/631++G(d,p), mediante el empleo del ciclo termodinámico,
que se muestra en la figura 10, tomando la diferencia entre el ΔG° del equilibrio en
fase gas y los valores de ΔG° de solvatación obtenidos de los cálculos single points
en solución de las moléculas involucradas (ecuación 6).
Figura 10. Ciclo termodinámico para calculo de ΔG° del equilibrio en solución.
0 0 0 0
solucion gas solvB solvA G G G GD = D + D - D (6)

Capitulo 3: resultados y discusión
Capitulo 3
Resultados y discusión
n este capítulo se presenta la SEP con los sustratos aislados en fase gas
realizada a nivel semiempírico PM3 y su posterior refinamiento con el
método DFT a nivel 631++G(d,p). También se presenta el resultado de
los índices de reactividades correspondientes a las funciones de Fukui para el iluro
con el anillo pirimidínico en la forma AP y APH⁺, para la molécula de piruvato y
para el estado de transición. Además, se presentan los valores del cambio de la
energía libre en condiciones estándar obtenido del análisis termodinámico
realizado para la reacción acido base entre el residuo altamente conservado
GLU139 y APIluro.
E

3.1 Exploración de la SEP con los sustratos aislados.
3.1.1 SEP a nivel semiempírico PM3.
La exploración de la SEP a nivel semiempírico con el hamiltoniano PM3, figuras
11 y 12, muestran que el mecanismo de reacción para la formación del LThDP
presenta la formación de un intermediario y la presencia de dos estados de
transición. La primera etapa del mecanismo consiste en el desplazamiento de la
molécula de piruvato hacia el cofactor ThDP, promoviendo el ataque nucleofílico
por parte del carbono C2 hacia el carbono carbonílico C2α de la molécula de
piruvato, alcanzando de esta forma el primer estado de transición ET1. Este estado
de transición está caracterizado con solo una frecuencia imaginaria de –407 cm⁻¹ y
que corresponde al stretching de la coordenada C2C2α. La barrera de activación
observada, calculada a nivel PM3, es aproximadamente de 29 Kcal/mol. Durante
esta etapa no se observa transferencia protónica. A continuación, el ataque
nucleofílico se completa formando el intermediario I, con una longitud de enlace
C2C2α de aproximadamente 1.55 Å, que corresponde a la longitud promedio de
un enlace simple carbonocarbono. Luego, una vez formado este intermediario, se
produce la transferencia protónica desde el grupo 4’NH2 al oxígeno carbonilico
O2α, formando finalmente el producto LThDP, vía el estado de transición ET2.
Este estado de transición también esta caracterizado con una sola frecuencia
imaginaria igual a –2004 cm⁻¹, correspondiente al stretching H4’O2α. La barrera
de activación observada, calculada a nivel PM3, para esta última etapa es
aproximadamente de 5 Kcal/mol.
Cabe destacar que estas barreras de activación se obtuvieron a partir de las
estructuras de los puntos críticos de la reacción que fueron optimizadas en fase gas
sin restricciones, una vez construida la SEP. Ya que no corresponden a las
estructuras con las que se construyo la superficie, las cuales fueron restringidas en
algunas variables tales como longitudes de enlaces, ángulos de enlaces y ángulos
diedros. Estas nuevas optimizaciones se realizaron utilizando el hamiltoniano PM3
en MOPAC 2009.

Figura 11. Representación 3D de la SEP a nivel semiempirico PM3.
Figura 12. Representación bidimensional de la SEP a nivel semiempirico PM3.
Los valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y de los ángulos diedros Φp y
ΦT para los diferentes puntos críticos de la SEP optimizados sin restricción de
variables se presentan en la tabla I. Para la región de los reactantes, del
intermediario y del producto se tomaron las estructuras de menor energía
encontradas en la SEP. Mientras que para los estados de transición se tomaron las
estructuras encontradas en las zonas de puntos de silla de la superficie.

En la figura 13 se muestran los resultados de las estructuras optimizadas en fase gas
de los puntos críticos de esta SEP. Además, para resaltar los cambios estructurales
ocurridos durante el transcurso de la reacción, en la tabla II se presentan los valores
de algunas longitudes y ángulos de enlace, pertenecientes principalmente a la
molécula de piruvato y al grupo imino del anillo pirimidínico. Por otro lado en la
tabla III, se presentan las cargas atómicas obtenidas del análisis poblacional de
Mulliken (MPA)³³’⁵⁵ para los átomos más relevantes involucrados en el ataque
nucleofílico y en la transferencia protónica. En esta última tabla y con el fin de
comparar la variación de la carga sobre los nitrógenos N4’, figura 14, también se
presentan las cargas atómicas del nitrógeno N3.
Figura 13. Estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel PM3 optimizados en fase gas:
(A) reactantes, (B) estado de transición ET1, (C) intermediario I, (D) estado de transición
ET2, (E) producto LThDP.

Figura 14. Estructura rotulada del cofactor ThDP, correspondiente al intermediario I.
En el sistema de reactantes la molécula de piruvato presenta una geometría trigonal
plana, con valores de algunos de enlaces cercanos a los 120°. En esta región de la
SEP, el piruvato se encuentra a una distancia de 4.05 Å del intermediario iluro,
orientando su grupo carbonilo hacia el grupo imino cuaternario del anillo
pirimidínico. Por su parte el nitrógeno N4’ en esta región registra la mayor
densidad de carga positiva, en comparación a los demás puntos críticos de la SEP,
ya que a medida que avanza la reacción la carga atómica del nitrógeno N4’ adopta
valores negativos, específicamente en el segundo estado de transición y en el
producto. Además, el enlace N4’C4’ muestra una longitud de enlace de 1.33 Å, la
cual es menor que el valor de longitud de enlace promedio para un enlace doble
carbononitrógeno, correspondiente a 1.38 Å⁵⁴. Así, el anillo pirimidínico se
encuentra bajo la forma de APH⁺, acorde a lo postulado en literatura²⁷ para otras
enzimas ThDP dependientes.

A medida que la reacción avanza y se sitúa en la región del primer estado de
transición ET1, los valores de los ángulos de enlaces de la molécula de piruvato
comienzan a sufrir modificaciones. Claro ejemplo de esto es la disminución del
valor del ángulo de enlace C1C2αO2α desde 122° a 114°. Esto da cuenta del
cambio de geometría que sufre el piruvato, pasando de una geometría trigonal plana
a una geometría tetraédrica, producto del ataque nucleofílico realizado por el
carbono C2. Además como consecuencia de lo ocurrido en esta etapa de la
reacción, la densidad de carga negativa sobre el carbono C2α disminuye,
produciendo una variación en la carga atómica de 0.220 a 0.359 desde los
reactantes hasta el intermediario I. En tanto la longitud del enlace C2αO2α
aumenta de 1.21 Å a 1.34 Å, aumentando también la carga negativa sobre el
oxígeno O2α.
Una vez en la región del intermediario I, la molécula de piruvato se encuentra
enlazada al cofactor ThDP, adoptando una geometría tetraédrica con ángulos de
enlace cercanos a los 109°. Sin embrago la orientación del oxígeno carbonilico O2α
de la molécula de piruvato no ha sufrido modificaciones con respecto a la que
presentaba en el sistema de reactantes. Esto se debe principalmente a que el
cofactor ThDP no ha perdido su conformación tipo V, la cual se mantiene durante
todo el transcurso de la reacción, al igual que el ángulo de enlace H4’N4’C4’.
Como consecuencia, la transferencia protónica desde el grupo imino cuaternario
del anillo pirimidínico hacia el oxígeno carbonilico O2α se encuentra favorecida,
quedando el oxígeno O2α a una distancia de 1.68 Å con respecto al hidrógeno
H4’. Finalmente, el aumento de la densidad de carga negativa sobre el nitrógeno
N4’ al atravesar la zona del segundo estado de transición ET2 y posteriormente al
llegar a la formación del intermediario LThDP, indica que el anillo pirimidínico
queda bajo la forma de IP, acorde a los postulado en bibliografía para otras
enzimas ThDP dependientes²⁰’²¹. Con un valor de 1.31 Å para la longitud del
enlace N4’C4’ y una carga atómica sobre el nitrógeno N4’ de 0.276.
En lo que respecta al anillo pirimidínico, tanto los valores de las longitudes de
enlace, tabla IV, como los valores de los órdenes de enlace, tabla V, ambos
obtenidos por MPA, muestran que desde el sistema de reactantes y hasta la zona
del intermediario I, los enlace π del anillo se encuentran deslocalizados.

A medida que la reacción avanza y pasa desde el intermediario I hasta la formación
del producto LThDP, las longitudes de los enlaces C4’C5’ y C4’N3’ aumentan,
disminuyendo sus ordenes de enlace y formando enlaces simple carbonocarbono y
carbononitrógeno, respectivamente. Esto provoca que la densidad de carga
negativa sobre el carbono C4’ disminuya, tabla VI. Lo mismo ocurre con los
enlaces C6’N1’ y N1’C2’, los cuales también sufren un aumento en sus longitudes
de enlaces en estas etapas de la reacción, disminuyendo sus ordenes de enlace y
provocando un aumento en la densidad de carga negativa sobre el nitrógeno N1’
(tabla III). A pesar de esto, el nitrógeno N1’ se mantiene con una carga parcial
positiva durante toda la reacción. En cuanto a los enlaces C5’C6’ y C2’N3’, estos
mantienen sus ordenes de enlaces constantes durante toda la reacción, con valores
correspondientes a órdenes de enlaces intermedios entre un enlace simple y un
enlace doble.

De acuerdo a los resultados obtenidos de la exploración de la SEP utilizando el
hamiltoniano PM3, se propone el siguiente mecanismo para la formación de
intermediario LThDP, figura 15.
Figura 15. Mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario LThDP
mediante cálculos a nivel PM3.
Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energía que se muestra
en la figura 16. La barrera de activación, en términos de energía electrónica, para
este mecanismo de reacción es de 32.65 Kcal/mol, considerando la barrera
energética del estado de transición ET2 con respecto al sistema de reactantes,
debido a que la etapa limitante de la reacción corresponde a la segunda etapa del
mecanismo⁵⁶.
Figura 16. Diagrama de energía para SEP a nivel semiempírico PM3.

3.1.2 Corrección DFT de la SEP a nivel B3LYP/631++G(d,p).
La corrección DFT de la SEP fue necesaria debido a las conocidas limitaciones del
método PM3, a causa de las simplificaciones en la descripción electrónica de este
método, como por ejemplo considerar solo a los electrones de valencia y la
utilización de un mínimo de funciones bases. Estas simplificaciones traen como
consecuencia valores erróneos de las cargas sobre los átomos de nitrógeno y una
sobre estimación de las barreras de activación²⁹’³³’³⁴. Sin embargo, los métodos
semiempíricos siguen siendo una buena alternativa para una exploración preliminar
de la superficie de energía potencial para un posterior refinamiento a nivel DFT ⁴⁰.
Figura 17. Representación 3D de la superficie de energía potencial a nivel DFT.
La corrección de la SEP se llevó a cabo de acuerdo a la metodología descrita en la
sección 2.1. Los resultados de esta corrección se muestran en las figuras 17 y 18.
Esta nueva superficie de energía potencial muestra diferencias importantes en su
topología con respecto a aquella obtenida a nivel PM3. La zona correspondiente al
intermediario I, ya no presenta la estabilidad energética descrita por el método
PM3. Como consecuencia, las zonas de los puntos de silla correspondientes a los
estados de transición ET1 y ET2 han desaparecido. Ahora en esta nueva SEP, es
posible observar que la reacción ocurre mediante un mecanismo concertado, vía un
estado de transición asíncrono⁵⁷, donde la coordenada de reacción R1,
correspondiente al ataque nucleofílico del carbono C2 sobre el carbono carbonilico

C2α, se adelanta a la coordenada de reacción R2. De esta manera, se observa que a
medida que se acerca la molécula de piruvato hacia el cofactor ThDP, se comienza
a producir el ataque nucleofílico. Mientras esto ocurre, la distancia entre el oxígeno
O2α y el hidrógeno H4’ disminuye paulatinamente. Ya en la zona del estado de
transición ET y hasta la formación del producto LThDP, se lleva a cabo la
transferencia protónica, rompiéndose el enlace entre el hidrógeno H4’ y el
nitrógeno N4’ y formándose el enlace O2αH4’, mientras el ataque nucleofílico se
completa.
Figura 18. Representación 2D de la superficie de energía potencial a nivel DFT.
Debido a que la metodología implementada para corregir la SEP a nivel DFT solo
consistió en realizar cálculos single points sobre estructuras optimizadas a nivel
PM3, fue necesario realizar optimizaciones al nivel B3LYP/631++G(d,p) para los
puntos críticos de la SEP DFT. Para las regiones correspondientes al sistema de
reactantes y al producto LThDP, se tomaron las estructuras de menor energía
encontradas en la superficie. En tanto, para la identificación del estado de
transición ET se tomaron varias estructuras aproximadas, pertenecientes a la región
de punto de silla de la SEP. A todas las estructuras optimizadas se les realizaron
cálculos de frecuencia, para cuantificar la barrera energética del mecanismo en
términos del cambio de energía libre.

3.1.3 Optimización de los puntos críticos de SEP DFT al nivel
B3LYP/631++G(d,p).
Los valores de las coordenadas de reacción R1, R2 y de los ángulos diedros Φp y
ΦT para los diferentes puntos críticos de la SEP DFT, optimizados al nivel
B3LYP/631++G(d,p), se presentan en la tabla VII. Además, en la figura 19 se
muestran los resultados de las estructuras optimizadas de los puntos críticos de la
SEP.
Figura 19. Estructuras de los puntos críticos de la SEP a nivel DFT optimizados en fase
gas: (A) reactantes, (B) estado de transición ET, (C) producto LThDP.

En las tablas VIII y IX, se presentan los valores de algunas longitudes y ángulos de
enlace de los puntos críticos, pertenecientes principalmente a las moléculas de
piruvato, acido acético y al grupo imino del anillo pirimidínico, figura 20. En tanto,
en la tabla X se muestran algunos órdenes de enlace, obtenidos del cálculo NBO
(Natural Bond Orbital). Cálculo que realiza un análisis de los órdenes de enlaces y
de las hibridaciones basado en la población electrónica obtenida del análisis NPA
(Natural Population Analysis), análisis incorporado en el cálculo NBO⁵⁸’⁵⁹.
Figura 20. Estructura rotulada del sistema de reactantes a nivel DFT.

La optimización y caracterización del estado de transición calculado al nivel
B3LYP/631++G(d,p) mostró como resultado una única frecuencia imaginaria de
222 cm⁻¹, correspondiente al stretching simultaneo de las coordenadas de reacción
C2C2α y H4’O2α, como se muestra en la figura 21.
Figura 21. Estructura del estado de transición ET con el stretching simultáneo de las
coordenadas de reacción C2C2α y H4’O2α.
Con la finalidad de corroborar que el estado de transición encontrado corresponde
a la reacción de interés, se llevó a cabo un cálculo IRC. El resultado condujo al
producto y al sistema de los reactantes previamente optimizados, tal como se
muestra en la figura 22.
Figura 22. Esquema de los cálculos IRC aplicados al estado de transición ET.

C H 3
O
O
H
N
N R
1
NH 2 C H 3
C H 3
O
O
H
N
N

R
1
NH 2
+
C H 3
1.57 Å
:
.. ..
:
1.33 Å
..
De acuerdo a los resultados, se observa que en la zona de los reactantes el piruvato
se encuentra a 4.96 Å de distancia de la molécula iluro y a 3.51 Å de distancia con
respecto a la coordenada de reacción R2, orientando su grupo carboxílato hacia el
grupo 4’NH2. A medida que la molécula de piruvato se acerca al carbono C2 del
iluro, ésta cambia su orientación y es el oxigeno O2α quien queda más próximo al
grupo 4’NH2, otorgando la configuración tipo S presente en el LThDP. Una vez
que la reacción cruza la zona del estado de transición y hasta la formación del L
ThDP, la longitud de enlace entre el carbono C4’ del anillo pirimidínico y el
nitrógeno N4’ del grupo imino disminuye, debido a la transferencia protónica
desde el grupo 4’NH2 hacia el oxigeno O2α. Como consecuencia, la densidad de
carga negativa sobre el N4’ aumenta en la formación del LThDP, tabla XI. De
igual forma, la distancia del enlace de hidrógeno formado entre el residuo y el
nitrógeno N1’, disminuye desde 1.57 Å a 1.43 Å, sin producirse transferencia
protónica, quedando el anillo de pirimidínico en la forma de 4’iminopirimidina.
Además, estructuralmente se observa que durante toda la reacción el sitio
preferencial de protonación del anillo de pirimidina, correspondiente al nitrógeno
N1’, se encuentra desprotonado, figura 23, al igual que en la estructura cristalina de
la AHAS⁶⁰. Mostrando que el grupo imino cuaternario puede formarse debido a la
estabilización de la carga negativa sobre el nitrógeno N1’ por parte del enlace de
hidrógeno formado con el residuo, el cual esta a una distancia de 1.57 Å del
nitrógeno N1’ en la zona de los reactantes y en el estado de transición ET.
Figura 23. Estabilización por enlace de hidrogeno del sitio preferencial de protonación del
anillo de aminopirimidina en la forma AP con R¹ igual a 5(2[hidroxidifosfato]etil)4metil
1,3tiazol3io.

Adicionalmente, el anillo pirimidínico durante la reacción se encuentra con sus
enlace π deslocalizados, según las longitudes y órdenes de enlace que muestra el
anillo, tablas XII y XIII, respectivamente. En tanto, las cargas parciales para los
átomos de anillo pirimidínico, obtenidas del análisis NBO, se presentan en la XIV.
Así, las principales diferencias que ha otorgado el refinamiento de la SEP a nivel
B3LYP/631++G(d,p) en comparación a la construida con el método PM3, recaen
principalmente en que el mecanismo de reacción ocurre de manera concertada y
no por etapas y que para la formación del grupo imino del anillo pirimidínico no
necesaria la protonación del nitrógeno N1’. De esta manera, según los resultados
obtenidos es posible que el anillo pirimidínico no se encuentre bajo la forma de
APH⁺ al momento de realizar tanto el ataque nucleofílico sobre el carbono
carbonílico C2α, como la transferencia protónica hacia el oxigeno carbonilico O2α.

En virtud de los resultados obtenidos de la SEP corregida a nivel DFT, se propone
el siguiente mecanismo, figura 24, para la formación del intermediario LThDP.
Figura 24. Mecanismo de reacción propuesto para la formación del intermediario LThDP
mediante cálculos a nivel B3LYP/631++G(d,p).
Los resultados de este estudio se resumen en el diagrama de energía que se muestra
en la figura 25. La barrera de activación observada para la formación del
intermediario LThDP es de aproximadamente 21 Kcal/mol. El valor de esta
barrera de activación está por debajo de la barrera de activación teórica informada
en otros estudios, la cual tiene un valor de 35.83 Kcal/mol según cálculos realizados
en fase gas y con los sustratos aislados a nivel DFT²⁴. La barrera de activación
experimental es de 16.21 Kcal/mol ²².
Figura 25. Diagrama de energía para la SEP a nivel B3LYP/631++g(d,p).

3.2 Estudio de reactividad.
Con el fin de complementar los resultados anteriores se realizó un estudio de
reactividad en términos de las funciones de Fukui y de las diferentes especies
participantes en la reacción. Las funciones y se calcularon de acuerdo a la
metodología implementada en Jaguar 7.7⁴⁴’⁴⁵ y los resultados se muestran en la
figura 26, en la cual las funciones se visualizan como isosuperficies. Para las
moléculas de APIluro, APH⁺Iluro y para el estado de transición ET obtenido de
la SEP DFT se calculó la función . En tanto, para la molécula de piruvato se
calcularon las funciones y . Las zonas azules de la función corresponden a
regiones que pierden densidad electrónica, cuando la molécula se somete a un
ataque electrofílico o cuando la molécula actúa como un nucleófilo. Por otro lado,
las zonas rojas de la función corresponden a regiones que ganan densidad
electrónica cuando la molécula sufre un ataque nucleofílico o cuando la molécula
actúa como un electrófilo⁴².
Figura 26. Funciones de Fukui para el (A) APH⁺Iluro, (B) APIluro, (C) estado de
transición ET y (D) piruvato. Función de Fukui para (E) piruvato.
f +
f -
f +
f -
f -
f +
f -
f -
f -
f +
f +

Los átomos que no poseen regiones coloreadas no presentan reactividad. En este
sentido, en la estructura del iluro en la forma APH⁺ se puede apreciar que los
centros nucleofílicos más importantes corresponden a los oxígenos carboxílicos del
residuo, en cambio el carácter nucleofílico del carbono C2 del anillo de tiazolio es
muy bajo. Sin embargo, en el caso del iluro bajo la forma AP se observa que el
átomo con mayor carácter nucleofílico corresponde al carbono C2, como es de
esperar para que se produzca el ataque nucleofílico a la molécula de piruvato. Por
otro lado, los índices atómicos de Fukui ⁴⁷’⁴⁸ calculados sobre el carbono C2,
resultan ser 0.34 y 0.00 para las formas AP y APH⁺, respectivamente, figura 27.
Estos resultados sugieren que el ataque nucleofílico del iluro sobre el piruvato
requiere al iluro en su forma AP (APIluro).
Figura 27. Índices atómicos de Fukui para APIluro y APH⁺Iluro. Con R1=
CH2CH2OH.
En lo que respecta al sustrato, la molécula de piruvato, muestra un importante
carácter nucleofílico sobre todos los átomos de oxígenos y el carbono C2α muestra
características de electrófilo. Los índices de Fukui atómicos para el carbono C2α y
el oxigeno carbonilico son = 0.51 y el oo = 0.24, figura 28. Estas características
complementarias entre APIluro y el piruvato sugieren que la reacción de
formación del LThDP ocurra mediante el mecanismo postulado a nivel DFT.
Figura 28. Índices atómicos de Fukui (A) y (B) para la molécula de piruvato.
2 C f -
2 C f a
+
2 O f a
-
f -
f -
f +

En el estado de transición ET se puede observar que las funciones de Fukui antes
mencionadas se mantienen y los lóbulos están dirigidos en la orientación correcta.
Es decir el lóbulo del átomo C2 está orientado hacia el carbono C2α y el lóbulo del
oxigeno carbonilico está orientado hacia el hidrógeno del grupo 4’NH2. En este
estado de transición postulado, el índice local de Fukui sobre el oxigeno carbonilico
de la molécula de piruvato alcanza el valor máximo de 0.27, figura 29, que
comparado con su respectivo valor en la molécula de piruvato aislada de 0.24,
indica el aumento en el carácter nucleofílico de este oxigeno como consecuencia
del ataque del iluro sobre el carbono C2α.
Figura 29. Índices atómicos de Fukui y , en paréntesis, para el estado de transición
ET de la SEP DFT. Con R1= CH2CH2OH.
En la figura 29, la función condensada de Fukui se muestra entre paréntesis.
Aquí se observa que otra de las variaciones presentes en el estado de transición ET,
es la disminución de los índices de Fukui para los nitrógenos N1’, N4’ y para el
carbono C2. La función condensada de Fukui para el carbono C2α también
disminuye en esta etapa de la reacción.
En definitiva, estos resultados complementan el mecanismo de reacción postulado
a nivel DFT. La nula reactividad del carbanion C2 cuando el anillo pirimidínico se
encuentra bajo la forma del APH⁺ deja en evidencia que al momento del ataque
nucleofílico el anillo pirimidínico se encuentra con la forma de AP.
f -
f +
f -
f +
f +

3.3 Análisis termodinámico.
Los resultados de la exploración de la SEP y de la optimización del estado de
transición a nivel DFT sugieren que durante el ataque nucleofílico del iluro, a la
molécula de piruvato, el anillo pirimidínico se encuentra con el nitrógeno N1’
desprotonado y el nitrógeno N4’ en su forma imino. Además, los cálculos IRC
indican que el producto LThDP se encuentra también con el nitrógeno N1’
desprotonado y el nitrógeno N4’ se encuentra en su forma imino, a diferencia de lo
reportado para enzimas ThDP dependientes²⁰’²⁷.
Con la finalidad de corroborar estos resultados y determinar el estado de
protonación del nitrógeno N1’ del anillo pirimidínico durante la reacción, desde el
punto de vista termodinámico se ha estudiado el equilibrio acido base entre el
residuo altamente conservado GLU139, simulado con una molécula de acido
acético y las formas AP y APH⁺ del iluro, figura 30, considerando medios de
diferente constante dieléctrica. En la tabla XV, se presentan los valores de los ΔG°
para cada uno de los medios y en la figura 30 se muestran algunas longitudes de
enlace (Å) y cargas parciales del tipo NBO para algunos de los átomos más
relevantes de la reacción.
Figura 30. Equilibrio termodinámico entre APIluro y APH⁺Iluro. Con R1= CH2CH2OH.

En este sentido, el equilibrio involucra directamente la estabilidad de las bases
conjugadas formadas, contrastando la factibilidad de la protonación del nitrógeno
N1’ del anillo pirimidínico por parte del residuo GLU139. Los resultados que se
muestran en la tabla XV indican que en los tres medios considerados la especie
termodinámicamente favorecida es el iluro con el nitrógeno N1’ desprotonado, la
forma APIluro. Este resultado está en concordancia con los resultados descritos en
las secciones anteriores, es decir, durante el ataque nucleofílico el anillo
pirimidínico se encuentra con el nitrógeno N1’ desprotonado al igual que el
producto LThDP formado. Una mayor estabilización de la base conjugada de la
forma APH⁺ debido a la deslocalización de la carga negativa del nitrógeno N1’ en
el anillo pirimidínico, permite que la forma AP sea energéticamente más estable.
En comparación, la base conjugada del acido acético posee una menor cantidad de
estructuras resonantes capaces de estabilizar la carga negativa sobre el oxigeno O1’.
Estos resultados además, presentan una concordancia con el estado de protonación
del residuo GLU139 encontrado en las diferentes estructuras cristalinas obtenidas
de la AHAS¹⁴’¹⁷’⁶⁰ y con los cálculos de los pKa experimentales del nitrógeno N1’
y del grupo carboxílato del residuo GLU139, que tiene valores de 7.0 y 9.1,
respectivamente, donde el rango de pH de mayor actividad catalítica que presenta
la AHAS es de 7.5, aproximadamente²¹. Sin embargo, también se observa una
fuerte dependencia del valor de DG° con el medio, lo que sugiere la posibilidad que
en el sitio activo de la enzima la forma APH⁺ pueda existir debido a
estabilizaciones producidas por los residuos aminoacídicos y que por ende es
posible que la forma APH⁺ pueda participar en otras etapas del ciclo catalítico de la
AHAS.

Capitulo 4: Conclusiones y proyecciones
Licenciatura en QuímicaQuímico Universidad de Concepción 41
Capitulo 4
Conclusiones y proyecciones
n este capítulo se presentan las conclusiones referentes a los resultados
obtenidos en la presente tesis. Entre ellas se encuentran la determinación
del mecanismo de reacción para la formación del intermediario LThDP,
la limitación del análisis energético de la reacción al trabajar en fase gas y con los
sustratos asilados y la disyuntiva existente entre cual es la forma del anillo de
pirimidina en el intermediario iluro a la hora de llevar a cabo el primer paso del
ciclo catalítico. Además se presentan las posibles proyecciones necesarias para
complementar las hipótesis investigadas.
E

4.1 Conclusiones
Los resultados de la presente tesis permiten concluir lo siguiente:
1. La reacción de formación del intermediario LThDP ocurre vía un
mecanismo concertado, es decir la carboligacion C2–C2α y la transferencia
protónica desde el grupo 4’NH2 hacia el oxigeno carbonilico O2α de la
molécula de piruvato ocurren de forma simultánea.
2. Durante la reacción el átomo N1’ del anillo pirimidínico esta desprotonado.
3. En todo momento el cofactor ThDP se encuentra estabilizado a través de
un fuerte enlace de hidrogeno formado entre el anillo pirimidínico y el
grupo carboxílico del residuo acido glutámico, a 1.57 Å, estabilizando la
eventual carga negativa sobre el átomo N1’.
4. La estructura optimizada del estado de transición muestra valores máximos
de los índices atómicos de Fukui sobre el oxigeno carbonilico de 0.27
comparado con el valor de 0.24 del piruvato aislado, indicando el aumento
de su carácter nucleofílico como consecuencia del ataque del átomo C2 del
iluro sobre el carbono C2α de la molécula de piruvato. También se observa
que la función de Fukui ⁻ sobre el átomo C2 está orientada hacia el átomo
C2α del piruvato evidenciando el ataque nucleofílico en curso.
5. La barrera de activación observada es de 21.87 Kcal/mol en
correspondencia al valor reportado en literatura de 16.21 Kcal/mol.
6. La estructura optimizada del producto LThDP muestra que el átomo N4’
está en su forma imino mientras que el nitrógeno N1’ esta desprotonado.
7. Los resultados además indican que en los tres medios considerados la
especie termodinámicamente favorecida es el iluro con el nitrógeno N1’
desprotonado.
8. La participación del anillo pirimidínico en la forma APH⁺ durante la
reacción entre el piruvato y el iluro no está avalada por los cálculos
químicos cuánticos de esta tesis.

4.2 Proyecciones
Con el fin de corroborar el mecanismo de reacción obtenido, cuantificar la
estabilización otorgada por el ambiente enzimático en la reacción y
principalmente para determinar cuál de las dos formas tautomericas del anillo
de pirimidina es la involucrada en la formación del intermediario LThDP, para
el presente trabajo de tesis se proponen como proyecciones:
· Realizar simulaciones de dinámica molecular, para encontrar una
estructura representativa del sitio activo de la enzima. Con los resultados
de las simulaciones determinar aquellos aminoácidos que aporten
mayor estabilidad al cofactor y a la molécula de piruvato, mediante
cálculos de energías de interacción²³.
· Con el resultado de la simulación de dinámica molecular realizar la
exploración de la superficie de energía potencial, mediante cálculos
híbridos QM/MM, con la finalidad de incorporar el ambiente
enzimático en la formación del LThDP y cuantificar su efecto sobre el
mecanismo de reacción propuesto.

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