1. La secuenciación del ADN consiste en determinar el orden de las bases A, C, G y T en un fragmento de ADN. 2. Existen varias técnicas para secuenciar ADN como la digestión química, el método de Sanger y las nuevas tecnologías de secuenciación (NGS). 3. La secuenciación del ADN tiene aplicaciones importantes como la identificación de genes mutados relacionados con enfermedades y el estudio del cáncer.

1. La secuenciación del ADN consiste en determinar el orden de las
bases A, C, G y T en un fragmento de ADN.
ATCGATCGATCGATCAGCTACGATCG
ATCGATCGATCGATCGATCAGCATCG
ATCGATCGATCGATCGATCGATCGAT
CGATCGATCGATCGATCGATCGATCG
ATCGATCGATCATTTATATTCTGCCGT
ACGACCTGACTGATCTGATCGAGTCG
ATCGACTACATATCGATCGATCGACG
ATCGTACGTATGCATGCGATCGTATCG
AGTCGTACTACGAGTCGACTGATCGT
AGTATATATGCAGCGATCGATGATCG
AGTCGATGTATTCTGACGCGATCTGA
GTCTGATGCCGTAGCAACGCTATGCT
ACTAGCTGACGTCATGCGTACGTAGT
CGTAGTACGTATCGATGCTGATGCAC
2

2. • Secuenciación es determinar el orden de los
nucleótidos de los ácidos nucleicos.
• Se basa en el sistema que usan las células para
replicar su propio DNA
3

3. 3
Secuenciación del genoma humano
• Genoma humano:
– 23 pares de cromosomas: 22 autosomas, X, Y
– 3.000.000.000bp
– 3.200 genes
• Consorcio Internacional: 20 centros de
investigación de EE.UU, Reino Unido, Francia,
Alemania, Japón y China
• Coste: $ 2.700.000.000 (2,7 x 109)
• Duración: 1.990-2.000 (1er borrador)- 2.003 (fin)

4. Secuenciación del genoma humano
4

5. Las bases de la
secuenciación de ADN
Principales tecnologías
de Secuenciación
Aplicaciones de la
secuenciación de ADN
5

6. Allan M. Maxam y Walter Gilbert establecieron el proceso de
digestión química del DNA para determinar la secuencia de
nucleótidos del ADN.
3´
3´
5´
5´
3´
5´
5´
3´
Isótopo radioactivo (32P)
A y G Dimetil sulfato (DMS)
C y T Hidracina y Piperidina
Metilan
6
Trata

7. Lectura de unas 100
bases de secuencias
Técnica de baja
resolución y en desuso
7

8. Método de terminación de cadena o método Sanger (Frederick
Sanger)
Se basa en hacer cuatro reacciones diferentes de síntesis de ADN
utilizando la función propia de la ADN polimerasa y utilizando un
didesoxinucleótido (ddNTP)
ddNTP
no tiene un
grupo hidroxilo
en el 3´
Un dNTP
marcado con
32P
8

9. Lectura de unas 300-500
nucleótidos
9
Una técnica mucho más eficiente en tiempo,
ejecución y sensibilidad de los resultados que
la de digestión enzimática

11. Conformado por equipos que emplean distintos métodos para la secuenciación con
un esquema de trabajo similar.
Tienen en común en que los amplicones de PCR derivados de cualquier molécula de
biblioteca única terminan agrupados espacialmente, ya sea en una única ubicación
en un sustrato plano o en la superficie de perlas de escala micrométrica.
Ventajas Desventajas
Construcción de librería y amplificación
in vitro sin el empleo de
microorganismos.
Longitudes de lectura más cortas que
en la secuenciación convencional.
Precisión en bruto diez veces menor al
convencional.
La secuenciación basada en matriz tiene
un grado mucho más alto de
paralelismo en la lectura que la
secuenciación convencional.
La inmovilización en una superficie
permite manipular enzimáticamente
con un único volumen de reactivo (Uso
de pL o fL).

12. Secuenciación de nueva
generación (NGS)
• Desde 2005 aparecen nuevas tecnologías de
secuenciación (NGS)
1
2

13. Tecnologías de NGS
10
454 sequencing SOLiD platform Illumina technology

14. Proceso de secuenciación de DNA
Biobanco
QC
Preparación
de librería
- DNA (WGS)
- RNA
- Exoma…
Secuenciación
Análisis
de datos
- Alineamiento
- Detección SNVs
- Cuantificación…
14

15. Costes de secuenciación
15

16. Centro Nacional de Análisis Genómico (CNAG)
Equipos
•
•
Barcelona SuperComputing Center:
10 x 10 Gb/s
• 9 Illumina HiSeq2000
• 2 Illumina HiSeq2500
• 1 Illumina MiSeq
• 4 Illumina cBots
• 1250 core cluster super computer
• 2.7 petabyte disc space

17. ¿Por qué secuenciar genomas?
Otros proyectos
Agentes infecciosos
Agrogenómica
Genes mutados y enfermedades
Genómica del cáncer
32%
25%
2%
29%
12%
Research Areas 2014
Cancer Genomics
Disease Gene
Identification
InfectiousDisease
Genomics
Model- and Agro-
Genomics
Others
CNAG: proyectos de secuenciación

18. Detección de SNPs/ mutaciones
THURSDAY
T-UESDAY
Inserción / deleción de un nucleótido
Sustitución de un nucleótido
18

19. Detección de SNPs/ mutaciones
19

20. 20
Ejemplo de aplicación de secuenciación:
medicina personalizada
• EGFR es un oncogén frecuentemente mutado
en cáncer de colon.
• También en otros cánceres: cáncer de mama,
glioblastoma, etc.
• Inhibidores de EGFR son terapias
habitualmente usadas para tratar cáncer de
colon, podrían administrarse a otros pacientes
de cáncer.

21. Muestra
ADN, ARN
Librería
Fragmentación
Ligación adaptadores
Librería Muestra
Single o paired-end
Secuenciación
Equipo Illumina,
Roche…
Reads NGS crudos
Formato fastQ o CS-FastQ
Informe experimento
Pasan/Fallan
Tasas error
Alineamiento
BWA, BFAST, Bowtie…
Secuencia de
referencia
Informe alineamiento
Reads y bases
alineados
Fichero BAM
Unir, ordenar y marcar
reads duplicados
Informeduplicados
Tasas duplicados y
únicos
Indexación fichero BAM
Reads alineados, no alineados
y duplicados
21

22. fichero BAM
Indexado y con duplicados
marcados
Alineados
Distancia/orientación
correctas
Aberrantes
Distancia/orientación
inesperadas
No alineados
No alineados a la secuencia
referencia
SNPs y pequeñas
indels
Cambios de
número de copia
Detección de
VE/indels grandes
Variantes
estructurales
Nuevas
inserciones
Identificación
22

23. 13
Preparación del template
Secuenciación e imágenes
Terminación reversible cíclica
(CRT)
Adición de un solo nucléotido
(SNA) o pirosecuenciación
Secuenciación por ligación
(SBL)
ADN polimerasa
ADN polimerasa
ADN ligasa
Template amplificados
clonalmente
• Emulsión PCR
• Amplificación en fase
sólida (PCR Puente)
Templates de una sola
molécula
• Primer inmovilizado
• Template inmovilizado

24. Pirosecuenciación
14
Primer inmovilizado
Emulsión PCR

25. 15
Preparación de la muestra
Extracción del ADN
Purificación del ADN
Fragmentación del ADN
La fragmentación se lleva a cabo mediante el proceso de tagmentación:
1. Combinación del transposoma con adaptador parcial y el ADN.
2. Fragmentación y adición del adaptador parcial por el transposoma.
3. PCR de ciclo limitado para añadir cebadores e indexes.

26. 16
Generación de clusters: Amplificación en fase sólida
D
F
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sres

27. 17
Secuenciación: Terminación reversible cíclica
7. Continuación en Paso 3
1. Hibridación de cebador a secuencia universal del
tamplate
2. Adición de los 4 nucléotidos con marcadores
fluorescentes de diferente color.
3. Incorporación de nucleótidos por la polimerasa.
4. Lavado y obtención de imagen de colores según el
nucleótido ensamblado
5. Eliminación del marcador fluorescente de los
nucleótidos incorporados (regenera 3’-OH) con TCEP*
6. Lavado y adición de los 4 nucleótidos modificados
*TCEP: tris (2-carboxietil) fosfina (agente reductor)

29. 19
Tratamiento de datos
Alineamiento
o
ensamblado
Análisis de
los
resultados
De novo Resecuenciación

30. Características
Costo por Megabase: 2 dólares
Costo de equipo: 430,000 – 540,000 dólares
Longitud de lectura: 36 – 100 pb
Tiempo de corrida: 4 – 9 días
Tasa de error: 1 – 1.5% hasta <0.1%

31. Ventajas
• Plataforma más empleada actualmente
• Requiere de poca muestra (aprox. 1 ng)
• Bajo costo de secuenciación
• Numerosas aplicaciones
• Pocos requisitos de infraestructura
Desventajas
• Lento
• Multiplexación (combinación de señales)
• Capacidad de muestras
• Equipo costoso
• Laborioso
• Personal capacitado
• Mutaciones durante la amplificación
• Reducida eficiencia en la secuenciación dirigida a
regiones de interés
• Longitudes de lectura limitadas por factores que
causan la desintegración de señal y el desfasado

32. 32

33. 33

34. • La detección por citometría de secuenciación de ADN rápida basada en
la detección de moléculas simples: se basa en la detección de los fotones
emitidos por moléculas simples en un flujo laminar a su paso a través de
un haz concentrado de rayos laser. El espectro de emisión de los cuatro
marcadores fluorescentes, permite identificar a las cuatro bases.
• Lectura directa de secuencia de bases en la cadena de ADN mediante
microscopios de túnel de barrido.
• Análisis de la secuencia de ADN mediante espectrometría de masas.
• La secuenciación por hibridación sobre paneles de oligonucleótidos de
secuencia conocida

35. Secuenciación de moléculas de ADN individuales
nucleótido a nucleótido (Tecnología en desarrollo)

36. • El primer secuenciador de tercera generación lo
vende Helicos BioSciences
• Permite generar de forma fiable fragmentos de
entre 25 y 45 bases.
• Dada la pequeñez de las lecturas generadas, esta
resecuenciación de genomas y no
tecnología está recomendada para la
para la
secuenciación de novo.
30

37. Equipo Compañía Método de
secuenciación
DNA
molde
Longitud
lecturas (pb)
Tiemp
o
carrera
Nt/carrera
(Gb)
Helicos
tSMS
Helicos
BioSciences
Polimerasa Molécula
única
25-45 192 37
Pacific
Bioscien
ces
Pacific
Biosciences
Polimerasa Molécula
única
1000 NA NA
ZX
Genetics
ZX Genetics Microscopia
electrónica
Molécula
única
NA NA NA

38. Mide el efecto a nivel iónico y eléctrico del
paso de una hebra de ADN a través de un
nanoporo
Ventajas
38
• Secuenciación individualizada
• Secuenciación de forma directa
• Lectura ultralarga (lectura de la longitud total)
• Económico
• Rápido
Desventajas
Oxford Nanopore´s MinION
• Requiere gran cantidad de ADN
• Necesita secuenciar muchas moléculas únicas para
un consenso aceptable

40. El Genetista, El Químico y El Biólogo 3
George Church
Unidad de Venómica Estructural y Fun
David Deamer Daniel Branton

41. UN POCO DE HISTORIA
(Deamer,et al. 2015 Nature Biotchnology, Volumen 34, pag 519)
4
Unidad de Venómica Estructural y Funcional

42. Hitos de la secuenciación nanopore
(Deamer,et al. 2015 Nature Biotchnology, Volumen 34, pag 519)
5
Unidad de Venómica Estructural y Funcional

43. ¿CÓMO FUNCIONA?
6
(Deamer, et al. 2015 Nature Biotchnology, Volumen 34, pag 519)
Unidad de Venómica Estructural y Fun

44. CONSTRUCCIÓN DE
LA LIBRERÍA
7
(Jain et al. Nature Methods 2015.)
Unidad de Venómica Estructural y Fun

45. TECNOLOGÍA EN
DESARROLLO
MinION(2015)
MinION
MkIB(2016)
8
α-Hemolisina
(Exp)
MspA (R7) HOLEY GRAIL(R9)
MinION
MAP(2014)
Unidad de Venómica Estructural y Fun
(Deamer, et al. 2015 Nature Biotchnology, Volumen 34, pag 519)

46. OUTPUT
.fast5
.fasta
.fastq
https://www.hdfgroup.org/
9
Unidad de Venómica Estructural y Fun

47. HERRAMIENTAS PARA FORMATO FAST5
10
(Hengyun Lu, et al Oxford Nanopore MinION Sequencing and Genome Assembly, 2016)
Unidad de Venómica Estructural y Funcional

48. • Rodríguez, J. Secuenciación de genomas. Arbor. 2004, 698, 287-289.
• Maxam, A.; Gilbert, A. A new method for sequencing DNA. PNAS, 1977, 74, 2, 560-
564.
• Rodríguez, B.; Armengol, L. Tecnologías de secuenciación de nueva generación en
diagnóstico genético pre- y postnatal. Diagn. Prenat. 2012, 23, 2, 56 – 66.
• Shendure, J.; Ji, Hanlee. Next-generation DNA sequencing. Nature biotechnology.
2008, 26, 10, 1135 – 1145.
• Metzker, M. Sequencing technologies – the next generation. Nature Reviews. 2010,
11, 31 – 46.
48
• Technical Support Note: Sequencing. Illumina.
https://support.illumina.com/content/dam/illumina-
support/documents/documentation/chemistry_documentation/samplepreps_nexter
a/nextera-xt/nextera-xt-troubleshooting-guide.pdf (consultado junio 2017).
• Applied Biological Materials. https://www.abmgood.com (consultado junio 2017).
• Genética Médica Blog. http://revistageneticamedica.com/blog/secuenciacion-
tercera-generacion/ (consultado junio 2017).
• Romero, C. Genética Humana, 1 ed.; Bilvao: España, 1995; 47-49.
• Bautista, R. Las tres generaciones de la secuenciación. Universidad de Málaga. 2010,
3, 128