1. Alejandro Gugliucci , Eriko Kinugasa, Hiroaki Ogata ,
Russell Caccavello , Satoshi Kimura
Jorge Ferreira & Sydney Goldfeder
molecular biology
Medicine Student
III Semester
UPB

2. INTRODUCTION
Millions of patients around the world depends on
replacement therapy, 80% recieve HD, the problem
resides
on
cardiovascular
effects.
dyslipoproteinemia of ESRD is caused by
triglycerides and IDL accumulation.
Other fact on vascular Affects is HDL, it has
antioxidative and anti inflammatory properties.
PON-1 is essential for the function of HDL.
show PON -1 activity is an important determinant of
the endpoints in renal failure cardiovascular

4. HDL
25% of total cholesterol in blood
Formed in the liver and intestine as
discoidal, (pre-β HDL) .
Density:
Main component: Protein
Apoproteins: AI, AII (C, E)
Diameter: 5-12 μ
3 types: HDLn,HDL2,HDL3
Reverse cholesterol transport
Exchange with other lipoproteins.
steroidogenic tissues

6. Esterase activity
hydrolyzed derivatives
of OP compounds
Substrates: triphosphates (paraoxon
and diazoxon)
1946
Mazur
insecticide metabolites
(toxic), parathion
Hydrolyze aromatic
esters, phenylacetate
and naphthylacetate

7. PARAOXONASE
•
•
•
•
Glycoprotein composed of 354 aa.
Weight 43 kDa
β-helix, 6 blades and 4 strands
Free sulfhydryl group at position 284 is essential for both activities, blocking,
or replacement of this cysteine ​by Ala or Ser mutants for PON 1 affects
recombination activity
Ca 2+
7.4 A°
Ca 2+

8. PARAOXONASE
PON 1
PON 2
PON3

9. RELATION
HDL
VLDL
PARAOXONASE
HEMODIALYSIS

10. GENERAL
OBJECTIVE
• Demonstrate the mechanism of
PON-1
activation
during
hemodialysis, by identifying PON-1
on HDL subclasses and put forth the
HDL remodeling and shift of PON 1
among HDL particle.

11. MATERIALES Y MÈTODOS
SUJETOS A ESTUDIAR
ESRD
Escuela universitaria de medicina Showa
Universidad del norte de yokohama- hospital
Tsuzuki-ku
Yokohama, Japón
42 pacientes (18 mujeres-24
hombres 63±12 años) HD 6.4
años(1-19 años)- regular
2meses, 3 veces por semana
3-4 horas
1
4
7.4°C
15min
.Citrato
de sodio o
EDTA 5mmol/l
8
6.800
9.
xg
80°C
5
2
Población saludable
de trabajadores del
hospital, no diabetes
ni enfermedad renal
3. 3-4hrs

12. MATERIALES Y MÈTODOS
Colesterol + HDL+ TG= métodos
enzimáticos.
Pruebas en general
Albumina, urea, creatinina
Concentración de proteínas:
Método “Bradford” (BioRad)
465-595nm

13. MATERIALES Y MÈTODOS
20hrs. Lipoproteína con
Apo B
ULTRACENTRIFUGACIÓN
HDL
24hrs. HDL-2
HDL-3
Ultracentrífuga: 1923,Sueco Svedberg, velocidades 100.000rpm,
velocidad dependiente de masa.
por gradiente de densidades, en el cual es posible la separación de las lipoproteínas a partir de sus
diferentes densidades, incluso sus fracciones (HDL-2 Y HDL3)

14. MATERIALES Y MÈTODOS
Actividad PON 1
Lactona natural que
deriva de la ciclización
de un derivado de ac.
cinámico
Actividad
Lactonasa
DHC
anión p-nitrofenol
PON-3
paraoxón  pnitrofenol + dietilfosfato
405nm

15. MATERIALES Y MÈTODOS
Detección de la actividad
de PON1 in situ
Zimograma
PAGE
Nativa
tris-glicina (rango de pH 8.3 a 9.5)
Geles se corrieron célula de electroforesis XCell Sure Lock (Novex ®,
Invitrogen), se apilan durante 30 min a 65 V y a continuación, se
ejecutan durante 16 horas a 100 V a 4 º C.

16. MATERIALES Y MÈTODOS
Detección HDL Y LDL En el mismo gel,
luego del Zimograma
HDL
Detecta
proteínas por
interacción
antígenoAnticuerpo
Western Blot
Transfieren proteínas de gel
a membrana, Bloqueo de
unión proteínas membrana,
detección proteínas con
anticuerpos –enzimas.
Electrotransferencia
SEMISECA
•
•
•
•
Rápida, poco calor, varios geles
Aparato con superficie de grafito, genera campo uniforme
“Sándwich”: papel filtro: humedece con tris-glicina, gel, Membrana.
Membrana PVDF: más utilizadas, varias coloraciones, estables, hidrofóbicas.
HÚMEDA
Electroforesis
Difusión simple

17. MATERIALES Y MÈTODOS
pr- se
Las
detectan por:
Colorante de
PVDF: Azul de
croomasie
Anticuerpos secundarios conjugados
Con enzimas. HRP.
Inmunodetección:
anticuerpos
monoclonaes o
policlonales
Quimioluminescenica

18. Pacientes en comparación con los sujetos
control.
↑Creatinina y urea
↓ de HDL plasmático
↓ Las 3 actividades de la PON1
↑ HDL (4,6%) ↑ LDL (13%) ↓VLDL (30%)
Lipólisis aumentada de la VLDL que es
transformada en LDL
Ningún cambio de las subclases de HDL fue
significante.

19. HDL2b
HDL2a
HDL3a
HDL3b
HDL3c

21. HDL2b
HDL2a
HDL3a
HDL3b
HDL3c

22. ApoE
• Cambios en apoE junto con activación de PON1 y
traslado entre partículas.
↑apoE
notable en
HDL2
No hay
cambios
significativos
para apoA-I ni
apoA-II

23. 30% dialysis
25% shifts to HDL
and VLDL
PON1 lact.
and aryl.
activation in
short time (4h)
Increase
of
PON1 in large
HDL2, reflects
maturation of
smaller HDL2

24. WHAT HAPPENS TO VLDL?
What happens to apoE?

25. Author
What they said
Yes or No
Orsoni(27), et al
Precisely we have recently reported that a Yes
similar PON1 activation and transffer can be
reproduced ex vivo in a few hours.
Ribeiro S, et al
PON1 status predicts cardiovascular outcome Yes
in CRF.

26. Author
What they said
Yes or No
Gugliucci A(29), et al
This reinforces the concept that a process Yes
of remodeling
with shifts in peripheral HDL proteins is
enhanced by dialysis, as we
have also recently shown ex vivo.
Deakin S, Manning PJ(30-32), VLDL has been suggested as a vehicle for Yes
et al
PON1 secretion from hepatocytes and it
may well also be a PON1 reservoir.

27. PON1 activation offers protection
against
cardiovascular
diseases,
atherosclerosis and reduces oxidative
stress.
PON1 can be a potential target for both
molecular and pharmacological impacts.

28. Hemodialysis gives a big benefit in a
short time frame of 4h by the activation
of PON1.
The mechanism of PON1 is not totally
understood yet; it needs further
research to complete this gap in our
knowledge.