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- 1. Aplicaciones de las nucleasas recombinantes más allá de la edición genómica Trabajo realizado por: Alejandra Magariño Martín Marta Romero Sedeño Clara González-Sandoval Royo
- 2. ● Introducción ● Aspectos importantes de los sistemas TAL y CRISPR/Cas 1. Aplicaciones de TAL y CRISPR/Cas a la regulación transcripcional específica del locus - Activación transcripcional - Activación transcripcional por sistemas de ARN andamio - Activación transcripcional por sistemas de regulación sinérgica - Represión transcripcional - Modificación epigenética - Actividad fuera del objeto (mutaciones no deseadas) - Sistemas inducibles para la regulación transcripcional específica de locus - Influencia de las estructuras de cromatina de los sitios objetivo - Manipulación de resultados de procesos biológicos 2. Visualización del lugar para imágenes in vivo 3. Análisis bioquímico del RNA 4. Aislamiento de regiones genómicas de interés para el análisis de las funciones del genoma ● Conclusiones ÍNDICE
- 3. INTRODUCCIÓN Nucleasas recombinantes = “Tijeras moleculares” de actuación en secuencias específicas de DNA NUCLEASAS RECOMBINANTES DE INTERÉS - ZFN ( Zinc Finger Nucleases ) - TALEN ( Transcription Activator-Like Effector Nucleases ) - CRISPR/Cas ( Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats ) Constituyen herramientas muy valiosas en edición genómica. Gran contribución a medicina, ingeniería genética, agricultura, investigación biológica, terapia génica. - Localización/función de genes - Corrección mutaciones - Tratamiento/modelado enfermedades CORTE MANIPULACIÓN EN PUNTOS DE INTERÉS
- 4. ASPECTOS IMPORTANTES DE TAL Y CRISPR/CAS Proteínas TAL - Nucleasas recombinantes originarias de bacterias fitopatógenos (Xanthomonas). - Reconocimiento de secuencias de 20 bases: Dominio de reconocimiento→ensamblaje de módulos de unión a DNA = región repetitiva conservada 33-35 aminoácidos - Amplio repertorio de proteínas TAL: combinación de diferentes módulos de unión al DNA. - TAL + endonucleasa Fok I → proteínas TALEN: herramienta de edición específica en un locus.
- 5. ASPECTOS IMPORTANTES DE TAL Y CRISPR/CAS Sistema CRISPR/Cas9 HISTORIA Mecanismo de defensa Streptococcus pyogenes Descubrimiento: mapeo genético arqueas Secuencias CRISPR Operón cas Detección RNA viral en la célula → RESPUESTA EN LA EDICIÓN GENÓMICA… Sistema CRISPR/Cas9 formado por: - Cas9: capacidad de dirigirse a secuencia específica. - RNA guía: 1. RNA CRISPR 2. RNA CRISPR transactivador Complejo reconoce PAM + 20 bases aguas arriba Actividad nucleasa intrínseca → escisión secuencia Variantes: sgRNA y mutante Cas9 (D10A y H840A)
- 6. 1. APLICACIONES DE TAL Y CRISPR/Cas EN LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL ESPECÍFICA DE LOCUS Activación transcripcional Creación de activadores transcripcionales artificiales usando TAL Y CRISPR/Cas. TAL+VP16 (TALa) dCas9+VP64 (CRISPRa) Producción altos niveles de transcripción y proteína NTF3 Expresión de genes reporteros exógenos Activación transcripcional por sistemas de ARN andamio Activación transcripcional por sistemas de regulación sinérgica Tanto los sistemas TALa como CRISPRa muestran efectos sinérgicos cuando se dirigen simultáneamente a múltiples sitios en un gen
- 7. 1. APLICACIONES DE TAL Y CRISPR/Cas EN LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL ESPECÍFICA DE LOCUS Represión Transcripcional La represión es un mecanismo biológico mediante el cual la expresión de genes específicos es inhibida o reducida. -Knockout TALEN y CRISPR/Cas -Knockdown TAL o CRISPR/Cas Modificación epigenética Las modificaciones epigenéticas son cambios que activan o inactivan los genes sin cambiar la secuencia de ADN a causa de la edad y la exposición a factores ambientales. Actividad fuera del objeto Los efectos off-target son cortes que produce la enzima Cas en lugares del ADN diferentes a la diana específica, generando la introducción de otras mutaciones distintas a las previstas.
- 8. 1. APLICACIONES DE TAL Y CRISPR/Cas EN LA REGULACIÓN TRANSCRIPCIONAL ESPECÍFICA DE LOCUS Sistemas inducibles para la regulación transcripcional específica del locus Sistema inducible: activación/desactivación expresión genética por estímulos externos Influencia de las estructuras de cromatina de los sitios objetivo Actuación de activadores transcripcionales → Estado conformacional cromatina Manipulación de resultados biológicos Manipulación de resultados biológicos: flujos metabólicos/diferenciación celular/reprogramación del destino celular
- 9. 2. VISUALIZACIÓN DEL LUGAR PARA IMÁGENES IN VIVO Necesaria para la observación de la dinámica de la organización cromosómica y de la segregación in vivo Técnicas: •MARCAJE DEL LOCUS (proteína exógena de unión al ADN + proteína fluorescente). Desventaja: tiempo •MOLÉCULAS UNIÓN AL ADN MODIFICADAS •VISUALIZACIÓN DEL GENOMA MEDIADA POR TAL •SISTEMA DE VISUALIZACIÓN BASADO EN CRISPR/Cas
- 10. 3. ANÁLISIS BIOQUÍMICO DE RNA CRISPR/Cas: reconoce como sustratos Coexisten ADNbc con ARNmc diana con la secuencia correspondiente a RNAmc → CRISPR/cas también reconoce DNAbc como sustrato Para evitarlo → O´Conell y colaboradores mejoraron del diseño de PAMer Utilidades del sistema: escisión, aislamiento, modificación, obtención de imágenes ADNbc que contiene secuencia PAM ARNmc que contiene secuencia PAM en forma trans (PAMmer)
- 11. 4. AISLAMIENTO DE REGIONES GENÓMICAS DE INTERÉS PARA EL ANÁLISIS DE LAS FUNCIONES DEL GENOMA Para entender los mecanismos moleculares de regulación de las funciones genómicas es necesario la identificación de moléculas asociadas con las regiones genómicas específicas de interés. iChIP Inmunoprecipitación de cromatina específica para el locus (ChIP) enChIP
- 12. Procedimiento de la inmunoprecipitación de cromatina específica para el locus: •Diseño de las moléculas de unión de ADN •Etiquetado del locus •Fragmentación del ADN •Purificación por afinidad Conclusión del experimento Los hallazgos hasta la fecha demuestran que enChIP utilizando tal o CRISPR/cas es una herramienta factible para identificar moléculas que interactúan con el genoma de manera específica para el locus y para analizar los mecanismos moleculares subyacentes a las funciones genómicas.
- 13. CONCLUSIONES •Aunque las aplicaciones de las proteínas TAL precedieron a las de CRISPR/cas, se espera que CRISPR/cas emerja como la tecnología predominante para futuras aplicaciones.