Material pdf complementario para referencia de aprendizaje.

1. TEMA 1
INTERFERENCIA DE LA EXPRESIÓN GÉNICA CON RNA
Genómica y Proteómica (BIO-341)
Contenidos
1. Silenciamiento con siRNA.
2. Silenciamiento con shRNA.
3. Silenciamiento adaptado con miRNA.
4. Screening y técnicas de detección de iRNA.
Introducción
La velocidad de desarrollo de la genómica condujo de alguna manera a una evolución
postgenómica, basada principalmente en el descubrimiento de técnicas genómicas en el
transcriptoma humano que derivan de las secuencias de RNA no mensajero, ni RNA de
transcripción, denominados RNA de interferencia (iRNA).
Los iRNAs son fragmentos de RNA (Ácido Ribonucleico) que se adhieren a regiones
específicas de RNA mensajero (RNAm), interrumpiendo su traducción, cumpliendo así, una
función de regulación de la expresión genética a un nivel postranscripcional
(silenciamiento) y por tanto, en una regulación de la expresión génica.
El silenciamiento postranscripcional fue descubierto en C. elegans y en plantas, en éstas,
los iRNA cumplen roles de protección y resistencia a parásitos y virus. Convirtiéndose
entonces en una herramienta poderosa para la investigación, en campos medicinales,
farmacéuticos, genéticos y moleculares.
Desarrollo
Proceso de formación de iRNA
Dos son los mecanismos importantes por los cuales los iRNA se forman y se activan:
1. Generación del iRNA.
2. Efector iRNA: Interrupción y degradación del RNAm target.

2. Generación del iRNA
La generación de un iRNA inicia con la formación de los fragmentos de iRNA a partir de
una doble cadena de RNA (dsRNA). Esta doble cadena es clivada (dividida) por la acción de
la proteína DICER intermediado por una molécula de ATP. Al tener el fragmento de iRNA
de interés por la intermediación de una quinasa y la acción de otro ATP, la proteína RISC
en su dominio RdRP amplifica la secuencia de iRNA.
La DICER es una enzima RNAasa III, procesa dsRNA en siRNA de 25 pares de bases (pb),
con dominio helicasa, dominio catalítico y de unión a dsRNA.
Efector iRNA: Interrupción y degradación del RNAm target
Los iRNAs se unen al RNAm target (blanco) por efecto de la RISC (endonucleasa que cliva
secuencia target). Ésta separa la cadena sense del iRNA y la libera, mientras que la
proteína RISC se une a la cadena de anti-sense del iRNA con la que se une al RNAm que
posee la cadena “sense” correspondiente. Generalmente los iRNA tienen una longitud
promedio entre los 25 a 45 pb que se unen al RNAm target.
RISC.- Dos proteínas de unión al RNA, RNA/DNA helicasa, Factor de iniciación de
traducción RdRP (Proteína transmembránica).
Funciones naturales de los iRNAs
En procariotas y plantas generan iRNA para protección y defensa contra genes y
transcriptos externos (virus y parásitos), en eucariotas no son muy útiles por el efecto de
los Interferones (IFN).
Tipos de iRNAs
Tres son los tipos más importantes de iRNAs caracterizados principalmente por su
longitud, forma de empaquetamiento y vector para efector:
1. siRNA (RNA silenciador). Tienen una longitud de 19-22 pb. Se sintetizan por PCR,
casetes de expresiones, transcripción in vitro. Transmisión por transfección (a).
2. shRNA (RNA short hairpin “horquilla”). Se construyen en plásmidos que transfectan las
células receptoras que contienen el RNAm (b).

3. 3. miRNA (RNA micro short hairpin). ssRNA de 22 pb nucleótidos generados por enzimas
tipo RNAasa DROSHA y DICER a partir de transcripto endógeno que contiene una
estructura local de horquilla (hairpin). Importante en las células para regulación de
desarrollo y diferenciación. Los transcriptos de miRNA se empaquetan en plásmidos, que
son empaquetados a su vez en una partícula viral se transfecta así en al RNAm target, la
integración con este tipo de iRNA es más estable (c).
Generación de siRNAs, shRNA y miRNA
La generación de siRNAs, shRNA y miRNA por síntesis química se produce por:
→ Vectores de expresión de iRNAs.
→ Plásmidos o vectores virales.
Los vectores basados en plásmidos transitorios, dependen de la eficiencia de transfección
que es variable y puede ser baja.
Los vectores basados en virus, son más eficientes que los basados en plásmidos
transitorios, pero son más peligrosos.
El ingreso de siRNA, shRNA y miRNA in vitro hacia la célula que contiene el RNAm target se
da por transfección química por lipofectamina u oligofectamina o por electroporación. El
ingreso de siRNA in vivo se realiza por inyección intramuscular y transfección a células de
mamífero.
Ventajas y desventajas de siRNAs
Ventajas:
→ Método rápido.
→ Síntesis escaladas.
→ Capacidad de marcaje de siRNA.
→ Fácil transfección.
→ Control de cantidad de iRNA por factores.
Desventajas:
→ Poco efectivo, no específico.
→ No buena transfección (a veces).

4. → Expresión no inducible.
→ Corto tiempo de vida siRNA.
→ No útil en tiempo.
→ Eficacia baja en proteínas muy expresadas.
→ Costoso.
Ventajas y desventajas de shRNAs
Ventajas:
→ No se trabaja con RNA.
→ Expresión estable y transitoria.
→ Costo efectivo.
→ Expresión inducible.
→ Screenings en pools.
Desventajas:
→ Requiere clonación y verificación de inserto.
→ Sitios de integración al genoma.
Ventajas y desventajas de miRNA
Ventajas:
→ No se trabaja con RNA.
→ Expresión estable o transitoria.
→ Costo-efectiva para experimentos largos.
→ Vía de llegada directa para células difíciles de transfectar.
→ Screening por pools.
Desventajas:
→ Requiere clonación y verificación de inserto.
→ Sitios de integración al genoma inciertos en muchas ocasiones.
shRNA adaptados a miRNA

5. Se construyen librerías de constructos de shRNA dentro de precursores endógenos de
secuencia de miRNA. En animales, los miRNAs se transcriben por RNA pol II generando
largos RNAs poliadenilados (pri-miRNAs).
El pri-RNA es clivado en el núcleo para dar un miRNA precursor con horquilla (pre-miRNA)
de 70 a 90 nucleótidos. Los pre-miRNAs se transportan al citoplasma y la DICER lo cliva
para producir miRNA maduro. Los shRNAs artificiales se insertan en la secuencia
endógena mir-30 y luego de la maduración inhiben la expresión de miRNAs que contienen
el sitio target.
Aplicaciones.- La búsqueda de nuevos targets a drogas por screening del genoma con
librerías de shRNA. Identificación de oncogenes. Librerías Hannon lentivirales y
retrovirales: micro RNA -30 para humanos (61600 constructos para 28000 genes). 35000
constructos de shRNAs para 5300 genes humanos.
Estudio de función génica de iRNA (siRNA, shRNA y miRNA)
Screening shRNA en plásmidos.- Se utilizan 7000 shRNAs clonados en plásmidos. Se
transfecta por reporteros:
1. Reportero GFP (Green Flourescent Protein Zs-Green) con dominio Pest de enzima
ornitina descarboxilasa.
2. Zs-green es degradada por proteosoma y cuando no hay mucha flourescencia la
coinfección ha sido bien hecha, si hay más fluorescencia verde hay menos probabilidad de
buen diseño.
Screen de miRNA.- Casi lo mismo descrito en el párrafo anterior, pero con resultados más
claros.
Screen de virus – shRNA.- Transducción de células con virus con casete de shRNA.
También shRNA se pueden empaquetarse en cápsulas virales. Si el RNA ya está
diferenciado se usan pools de retrovirus para la infección de distintos shRNA con dirección
a genes de humano.
Screen alternativo iRNA.- Utiliza iRNA con enzimas que expresan casetes de iRNA.
1. Señalización
2. Validación del target. Bioinformática.

6. 3. Hipótesis y epistasis a nivel de sistema de genes.
Aplicaciones
Screen en pools.- Marcaje de secuencias únicas Bar Code de gen perturbado,
recuperación por PCR. Hibridación por Arrays de librerías: Arrays celulares y encima iRNA
o Arrays con iRNA y encima las células.
Screening en placas multipozos.- Cada pozo contiene un diferente reactivo al iRNA
(shRNA, miRNA, siRNA) dirigido a un target específico (RNAm). Posteriormente se realiza
la transfección o infección celular. Se identifica posteriormente los elementos pro o anti
sobrevivencia de genes que fueron sensibilizados por iRNAs.
Microarrays de células.- Un Microarray es un slide de vidrio pequeño cubierto con células
por puntos que han tomado al iRNA (siRNA, shRNA y miRNA), estos iRNA se imprimen al
vidrio como un Microarray y posterior a ello, las células son cultivadas sobre éstos arrays
que contienen a los iRNA. La detección se realiza por fluorescencia específica, un color
(generalmente verde) para verificar efecto positivo (en este caso unión iRNA-target), un
color (generalmente rojo) para verificar efecto negativo (iRNA-target no se adhirieron) y
un color (generalmente amarillo) para verificar errores o múltiples resultados en el
proceso.
Detección de redes genéticas.- Los iRNA son una buena herramienta para el análisis de
interacciones genéticas binarias para establecer redes génicas. Estas redes permiten
observar o determinar la asociación positiva, negativa o intransigente de genes que
participan en un determinado fenotipo (epistasis, redundancias, etc.).
Validación.- Es costoso, pero importante. Se debe validar el control (blanco). Presencia y
efecto de iRNA. Respuesta al interferón. Perfil transcripcional del iRNA/target.
→ Controles con DNAc para ver gen perturbado.
→ Complementación en hairpin
→ Blanco de UTR y no proteica.
→ La biología celular promueve marcadores de rutas y vías celulares de cada caso.
→ Reporteros importantes para ver estudios múltiples de vías de afección de shRNAs.
Aplicaciones de iRNA

7. Desarrollo del cerebro (miR-430). Patrones de sistema nervioso (miR-273). Diferenciación
de Adipocitos (miR-143). Desarrollo del corazón (miR-1). Apoptosis (miR-14). Algunos virus
llevan su propio miRNA, CMV).
Kaucsár et al. (2010). Se utilizó miRNAs para verificar su relación con diferentes
enfermedades, como la diabetes y la isquemia relacionada con la nefropatía. Los miRNA
pueden estar asociados en la inhibición de la “antisense” de oligonucleótidos, silenciados
in vivo. La modificación de los mismos puede representar una alternativa para terapia
génica para una influencia de regulación postranscripcional de múltiples genes. La
transfección fue realizada por plásmidos contenidos en partículas virales y la detección de
los mismos por microarrays de tejido vivo con validaciones previas, durante y posteriores
a los análisis.
Izquierdo (2005). Utilizó los iRNAs para la interferencia de genes de sobreexpresión de
oncogenes, bloqueo de la división celular interfiriendo la Ciclina E y promoviendo genes de
apoptosis suprimiendo los genes antiapoptóticos.
Rossi (2006). iRNA logró interferir el VIH-1 primate usando siRNAs, shRNAs. Los iRNA
interfirieron los RNAm target codificadores los receptores requeridos para la entrada viral
a la célula. Los experimentos se llevaron a cabo in vitro, si bien los otros mutantes virales
de VIH lograron proliferar, la técnica de iRNA puede ser aplicada para muchos RNAm
target del VIH.
Futuros Ensayos
iRNA in vivo a través del estudio de inactivación génica en animales modelo. Inyección
local iRNA a órganos blanco.
Ratones transgénicos con knockdown por iRNA por inyección de plásmidos de shRNAs
linearizados al pronúcleo del huevo fertilizado. Electroporación en células madre. shRNAs
lentivirales transducidos en células madre embrionicas. Sistemas inducibles, sistemas de
iRNA inducibles y condicionales.
Bibliografía
Izquierdo, M., 2005. Review: Short interfering RNAs as a tool for cancer gene therapy.
Cancer Gene Therapy - Nature. 12: 217-227.

8. Kaucsár, T., Z. Rácz y P. Hamar, 2010. Post-transcripcional gene-expression regulation by
micro RNA (miRNA) network in renal disease. Advanced Drug Delivery Reviews 62: 1390-
1401.
Paddison, P., A. Caudy, E. Bernstein, G. Hannon y D. Conklin, 2002. Short hairpin RNAs
(shRNAs) induce sequence-specific silencing in mammalian cells. Genes & Development
16: 948-958.
Pardridge, W., 2007. shRNA and siRNA delivery to the brain. Advanced Drug Delivery
Reviews 59: 141-152.
Rossi, J., 2006. Review: RNAi as a treatment for HIV-1 infection. BioTechniques. 40: S25-
S29.