Presentación para ser usada en clase y online

1. INTERFERENCIA DE LA
EXPRESIÓN GÉNICA CON RNA
Tema 1

2. RNA Interferencia (iRNA)
Fragmentos de RNA que se unen al RNAm
interrumpiendo su traducción silenciando el
transcripto.

3. Formación iRNA
1. Generación del iRNA.
2. Efector iRNA: Interrupción del RNAm.

4. Generación de iRNAs
– Componentes:
Proteina Descripción Función
DICER Enzima RNAasa III, procesa
dsRNA en siRNA de 25 pares de
bases (pb), con dominio helicasa,
dominio catalítico y de unión a
dsRNA.
Clivar la cadena de RNA
formadora de iRNAs.
RISC Dos proteínas de unión al RNA,
RNA/DNA helicasa, Factor de
iniciación de traducción RdRP
(Proteína transmembránica).
Amplificar las secuencias de
iRNA formadas.
Transportador del iRNA hasta
target RNAm.
DROSHA Enzima RNAasa III clase II. Corta la molécula de miRNA.
Regulariza los genes de
interacción RISC/iRNA.
Inducción de la clivación del
target RNAm.

5. Generación de iRNA por acción de la DICER y amplificación de los fragmentos por RISC.

6. Interrupción de la expresión de RNAm por siRNA transportada por RISC.

7. Interrupción de la expresión de RNAm por siRNA transportada por RISC.

8. Tipos de iRNA
1. siRNA.
2. shRNA.
3. miRNA.

9. 1. siRNA
• Longitud: 19-22 pb.
• Síntesis por PCR.
• Transcripción in vitro.

10. 2. shRNA
– Interference RNA Short Hairpin (shRNA).
• Longitud: hasta 25 pb.
• Transfección vía plásmidos.
• Síntesis in vitro.

11. 3. miRNA
• Longitud: 22 pb.
• Dos tipos de RNAasa: DROSHA y DICER.
• Transfección por plásmido y vector.

12. TIPO DE iRNA VENTAJAS DESVENTAJAS
siRNA Método rápido.
Síntesis escaladas.
Capacidad de marcaje de
siRNA.
Fácil transfección.
Control de cantidad de iRNA
por factores.
Poco efectivo, no específico.
No buena transfección (a
veces).
Expresión no inducible.
Corto tiempo de vida siRNA.
No útil en tiempo.
Eficacia baja en proteínas muy
expresadas.
Costoso.
shRNA
No se trabaja con RNA.
Expresión estable y transitoria.
Costo efectivo.
Expresión inducible.
Screenings en pools.
Requiere clonación y
verificación de inserto.
Sitios de integración al
genoma.
miRNA
No se trabaja con RNA.
Expresión estable o transitoria.
Costo-efectiva para
experimentos largos.
Vía de llegada directa para
células difíciles de transfectar.
Screening por pools.
Requiere clonación y
verificación de inserto.
Sitios de integración al genoma
inciertos en muchas ocasiones.

13. Transfección de iRNA
– Vectores:
• Plásmidos
• Virus

14. Estudio de la Función Génica de los iRNAs:
– Screening en pool
– Screening en placas multipozos
– Microarrays
– Detección de redes genéticas

15. Screening en pool
– Screening en placas multipozos

16. Microarrays

17. Detección de redes genéticas