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- 1. Gonza Escobar, Josue Jonas Roman Zela, Bryam Alberto Zárate Carpio, Antonella Alexandra Electroforesis SEMINARIO 10/11/23 UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAR MARCOS INGENIERIA BIOMÉDICA
- 2. ÍNDICE ¿QUÉ ES LA ELECTROFORESIS? ¿CÚALES SON SUS COMPONENTES? ELECTROFORESIS DE PROTEINAS Y DE ÁCIDOS NUCLEICOS INTRODUCCIÓN PROCEDIMIENTO TIPOS DE ELECTROFORESIS APLICACIONES VENTAJAS Y LIMITACIONES RESULTADOS 1 2 3 4 5 6 7 8 9 CONCLUSIONES 10
- 3. INTRODUCCIÓN Fuente de alimentación Generamos un campo eléctrico: Las biomoléculas que presenten carga eléctrica se desplazarán hacia el polo de carga opuesta al de la molécula. Estas migraciones se dan a través de un gel o matriz porosa. Las moléculas de diferentes tamaños o pesos moleculares migrarán a diferentes velocidades: las más livianas se moverán más rápido que las pesadas. polo positivo polo negativo
- 4. ¿QUE ES LA ELECTROFORESIS? ETIMOLOGÍA ELECTRO - Electricidad FORESIS - Transporte Técnica que nos permite separar y analizar biomoléculas (generalmente proteínas y ácidos nucleicos) en función de su peso molecular (tamaño) y mediante una campo eléctrico. (en función de su movilidad) biomoléculas separadas
- 5. MIGRACIÓN DE LAS BIOMOLÉCULAS pb (Pares de bases) kDa (Kilo Dalton) MEDICIONES
- 6. ELECTROFORESIS LIBRE Y DE ZONA La muestra se desplaza sobre un soporte sólido. La muestra se desplaza sobre disoluciones o suspensiones. Poco poder de resolución.
- 7. ELEMENTOS NECESARIOS Peine para pocillos Gel EQUIPO ELECTROFORÉTICO
- 8. BUFFER O TAMPÓN pH básico pH ácido La mayoría de las biomoléculas poseen una carga eléctrica cuya magnitud depende del pH del medio en el que se encuentran Durante la electroforesis se produce la electrolisis del agua, generándose protones en el ánodo e iones hidroxilo en el cátodo. Esto afectaría mucho a la acidez o basicidad del entorno, lo que podría afectar a la muestra. El pH influye en la carga neta de las biomoléculas. El pH se ajusta de acuerdo a lo que se quiera lograr en la separación.
- 9. SOPORTE ELECTROFORÉTICO Gel poroso Permite el paso de moléculas Material inerte: sin carga y no produce adsorción a la muestra acetato de celulosa / papel / agar / almidón NO RESTRICTIVO Tamaño poro >>> Tamaño moléculas Separación solo por cargas. Electroforesis de proteínas agarosa / poliacrilamida RESTRICTIVO Tamaño poro : Tamaño moléculas Separación por cargas y tamaño. Electroforesis de proteínas (CARGA Y TAMAÑO) poliacrilamida Electroforesis de ácidos nucleicos (TAMAÑO)
- 10. ELECTROFORESIS DE ÁCIDOS NUCLEICOS ELECTROFORESIS DE PROTEINAS Los ácidos nucleicos solo poseen carga negativa (debido a sus grupos fosfato) , por lo cual, en una electroforesis, estos migrarán hacia el polo positivo (ÁNODO). Los geles más utilizados son los de agarosa y poliacrilamida. Útil para la separación de fragmentos de distinto tamaño de ADN. Las proteínas poseen carga positiva y carga negativa. En este caso, se realiza pretratamiento con detergentes, como el dodecilsulfato de sodio (SDS), que les confiere carga negativa; con ello se homogenizan las proteínas de la muestra y todas migrarán hacia el polo positivo, y sólo se separarán por tamaño. Separación por carga y tamaño.
- 11. [agarosa] tamaño de las moléculas Método estándar cuando no se requiere de un alto poder de resolución. Alto rango de tamaño de separación. Poder de resolución bajo. Se corren de forma horizontal. (50 pb hasta unas 40 kb) Electroforesis en gel de agarosa Bajo rango de tamaño de los fragmentos que podemos separar. Poder de resolución alto. Se corren de forma vertical. Son más complicados en su elaboración y manipulación. (5-600 pb) (permite separación de moléculas que difieren en solo 1pb) Electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE) gel + resistente, no se desliza
- 12. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA ELECTROFORESIS NATIVA (NO DISOCIANTE) Las muestras se separan sin alterar su estructura nativa: mantienen su estructura tridimensional. Las proteinas siguen siendo funcionales y mantienen las interacciones entre subunidades. Es útil para estudiar interacciones proteína- proteína, proteína-ADN, entre otros, en su estado natural. Migran en función de su carga, tamaño y de su forma. ELECTROFORESIS DESNATURANTE (DISOCIANTE) Implica la desnaturalización de las muestras antes de cargarlas en el gel. Este proceso altera la estructura tridimensional de las moléculas. Las moléculas se separan en el gel según su tamaño, ya que la carga y la forma no son factores predominantes debido a la desnaturalización. Se pueden comparar tamaños sin que la estructura secundaria interfiera. agente
- 13. SELECCIÓN DEL TAMAÑO DE LOS POROS identificacion de moleculas específicas cálculo del porcentaje de acrilamida
- 14. TINCION DE PROTEINAS BANDAS Representa una población de moléculas con propiedades similares, ya sea en términos de tamaño molecular o de carga. AZUL DE COOMASSIE ácidos nucleicos luz ultravioleta BROMURO DE ETIDIO identificación de bandas de interés proteinas entre cuántos pares de bases
- 15. MARCADORES DE PESO MOLECULAR Sustancias con PM conocidos : Estándares de referencia. Por comparación podemos averiguar el PM aparente de nuestra proteína. estimar el tamaño de las moléculas desconocidas en función de la distancia migratoria de sus bandas en el gel.
- 16. TIPOS DE TAMPÓN DE CORRIDA Son aquellos en el cual todos los compuestos tienen el mismo pH Diferencia en composición y en pH - Concentrador y Separador
- 17. PROCEDIMIENTO El procedimiento para realizar una electroforesis puede variar según el tipo de electroforesis que estés realizando y del tipo de moléculas que estés separando.
- 19. Preparación del gel y muestras 1 2 Construcción de la cámara de electroforesis Conexión de electrodos y aplicación de corriente eléctrica 3 PROCEDIMIENTO Tampón de carga Glicerol Azul de bromofenol Dodecilsulfato de sodio Tampón electrolítico TBE TAE Tris glicina
- 20. 4 Migración y separación Detención y visualización 5 Análisis de resultados 6 PROCEDIMIENTO Azul de Coomassie: proteínas Xileno-cianol y verde cianol Bromuro de etidio Colorantes
- 22. TIPOS DE ELECTROFORESIS Existen varios tipos de electroforesis, cada uno diseñado para separar un tipo particular de molécula. Algunos de los tipos de electroforesis más comunes incluyen: Electroforesis Vertical Electroforesis Horizontal Isoelectroenfoque Electroforesis de Capilaridad Electroforesis de Campo Pulsado Electroforesis Bidimensional
- 23. 1 TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS VERTICAL Se utiliza para separar moléculas en función de su tamaño y carga en un plano vertical, generalmente en un gel. GEL AGAROSA POLIACRILAMIDA
- 24. * SDS-PAGE Separación de proteínas en masas moleculares por los efectos de filtración por geles. Tipo de electroforesis en gel de poliacrilamida que se encuentra en presencia de dodecilsulfato sódico. SDS Gel acumulador Gel separador DISCONTINUA:
- 25. 2 TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS HORIZONTAL Generalmente se trabaja con ADN, ARN y proteínas en gel de almidón o agarosa. El tampón es continuo, evita la gradiente de pH y funciona como refrigerante. E. submarina
- 26. TIPOS DE ELECTROFORESIS 3 ISOELECTROENFOQUE Separar proteínas y otros biomoléculas en función de sus puntos isoeléctricos (pI). Las proteínas en la muestra se mueven hacia el punto del gel donde el pH coincide con su pI. UREA
- 27. 4 TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS BIDIMENSIONAL Separar y analizar una gran cantidad de proteínas en una muestra biológica en función de sus puntos isoeléctricos (pI) y sus tamaños moleculares. E. Bidimensional IEF SDS-PAGE
- 28. 5 TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS DE CAPILARIDAD Se basa en la diferente velocidad de desplazamiento de las distintas biomoléculas a través de un medio líquido, al someterlas a la acción de un alto campo eléctrico. Alta rapidez de análisis Alta eficiencia de separación Corto tiempo Características Variedad
- 29. 6 TIPOS DE ELECTROFORESIS ELECTROFORESIS DE CAMPO PULSADO Separación de ADN de alto peso molecular (hasta 10 kpb) por medio de la alternación de campos eléctricos (homogéneo y no homogéneo). Variaciones OFAGE FIGE TAFE CHEF PACE RGE CFGE ZIFE ST/RIDE Subtificación
- 30. APLICACIONES DE LA ELECTROFORESIS La electroforesis tiene una amplia variedad de aplicaciones en la investigación científica, la medicina y la industria. MEDICINA Y ANÁLISIS CLÍNICO BIOLOGÍA MOLECULAR DETECCIÓN DE FARMACOS ANÁLISIS FORENSE
- 31. PRUEBA DE PATERNIDAD MEDICINA FORENSE Ejemplo de un caso de criminalística resuelto utilizando electroforesis en gel vertical de acrilamida. Cada pico corresponde a un alelo, el hijo (H) debe poseer un alelo de la madre (M) y otro del padre (P) para que la paternidad sea compatible
- 32. ANÁLISIS EN LA MUTACIÓN GÉNICA
- 33. ANÁLISIS EN LA MUTACIÓN GÉNICA El cambio de un nucleótido en el genoma puede ser indicativo de alguna patología, existen muchas mutaciones puntuales implicadas en el desarrollo de enfermedades (Tabla 3); y una forma de identificarlas es a través de la secuenciación del ADN mediante el método de Sanger.
- 34. ANÁLISIS EN LA MUTACIÓN GÉNICA La EC permite el análisis de la expansión de repeticiones de nucleótidos en el genoma (STRs), constituyéndose como la herramienta ideal para el diagnóstico de algunas enfermedades.
- 35. ANÁLISIS DE ORINA Detección de la concentración de proteínas monoclonales en la orina de pacientes
- 36. EC DEL LÍQUIDO CEFALORRAQUÍDEO El banda de Bence Jones de doble banda que cuantificó en 7,0 g/L, se mostró mediante la inmunofijación es causada por cadenas ligeras κ libres. Condiciones electroforéticas como en la figura 1
- 37. DETECCIÓN DE COMPUESTOS QUIM, Fenotiazinas Quinolonas Triazinas Usos: Medicina: Algunas fenotiazinas se utilizan como fármacos, especialmente en psiquiatría. Biología y Investigación: Utilizadas para estudiar propiedades de memb. celular y en inv. relacionadas con la fluorescencia. Medicina: Son un grupo importante de antibióticos de amplio espectro. Utilizados para tratar infecciones bacterianas. Agricultura: Algunas quinolonas se utilizan en la agricultura como agentes antibacterianos en veterinaria. Usos: Agricultura: Las triazinas, como la atrazina, han sido utilizadas como herbicidas. Investigación y Análisis: En entornos de laboratorio, las triazinas se utilizan en análisis y estudios medioambientales. Usos:
- 38. RESULTADOS VISUALES DETECCIÓN Y CUANTIFICACIÓN RAPIDEZ Y EFICIENCIA VENTAJAS DE LA ELECTROFORESIS SEPARACIÓN MOLECULAR AMPLIA APLICACIÓN EN DIVERSOS CAMPOS
- 39. LIMITACIONES DE LA ELECTROFORESIS CUANTIFICACIÓN ABSOLUTA RESOLUCION A SIMPLE VISTA LIMITADA SENSIBILIDAD A CONDICIONES EXTERNAS
- 40. CONCLUSIONES La electroforesis demuestra su papel esencial en la investigación biomolecular y su impacto significativo en la comprensión de la biología, el diagnóstico médico y el desarrollo de terapias avanzadas. Desde la electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida para la separación de ácidos nucleicos, hasta la electroforesis de proteínas para el análisis de perfiles proteicos, el estudio detallado de cada variante revela sus ventajas y desventajas. La diversidad de sus aplicaciones y su continua evolución la posicionan como una herramienta fundamental en la vanguardia de la ciencia y la investigación.
- 43. ¡Muchas gracias! Por su atención UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAR MARCOS INGENIERIA BIOMÉDICA SEMINARIO 10/11/23