microbiologia ambiental

1. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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2013-1
OBJETIVOS
 Determinar la importancia de Enterococos respecto a la calidad Higiene
Sanitaria de los productos.
 Útiles para medir la eficacia de las técnicas de limpieza y desinfección.
 Evidenciar la presencia de Enterococos como microorganismo indicador
de contaminación ambiental.
 Conocer la metodología que se va a utilizar.
FUNDAMENTO TEORICO
STREPTOCOCCUS
El género Streptococcus es un grupo de bacterias formado por cocos
grampositivos pertenecientes al filo firmicutes1 y al grupo de las bacterias ácido
lácticas. Estas bacterias crecen en cadenas o pares, donde cada división celular
ocurre a lo largo de un eje. De allí que su nombre, del Griego στρεπτος streptos,
significa que se dobla o retuerce con facilidad, como una cadena. Los
Streptococci son oxidasa– y catalasa–negativos.
Las especies de estreptococus que producen enfermedades son:
Estreptococos del grupo A: Streptococcus pyogenes producen amigdalitis e
impétigo.
Estreptococos del grupo B: Streptococcus agalactiae producen meningitis en
neonatos y trastornos del embarazo en la mujer.
Neumococo: Streptococcus pneumoniae es la principal causa de neumonía
adquirida en la comunidad.
Streptococcus viridans es una causa importante de endocarditis y de abscesos
dentales.
Streptococcus mutans causa importante de caries dental. Pertenece al grupo de
estreptococos viridans.
Algunas especies de los grupos C y G tienen en su pared la proteína G, que, por
su capacidad de unión a anticuerpos, tiene importantes aplicaciones en
biotecnología.
ESTREPTOCOCOS BETA-HEMOLÍTICOS
Grupo A

2. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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S. pyogenes (también conocido como GAS) es el agente causal en las
infecciones estreptocócicas del Grupo A, (GAS) incluyendo faringitis
estreptocócica ("amigdalitis"), fiebre reumática aguda, fiebre escarlata,
glomerulonefritis aguda y fascitis necrotizante. Si la amigdalitis no es tratada,
puede desarrollarse fiebre reumática, una enfermedad que afecta las
articulaciones y las válvulas cardiacas. Otras especies de Streptococcus también
pueden poseer el antígeno del Grupo A, pero las infecciones en humanos por
cepas no-S. pyogenes GAS (algunas cepas S. dysgalactiae subsp. equisimilis y del
Grupo S. anginosus) parecen no ser comunes.
La infección por Estreptococo Grupo A es diagnosticada generalmente con una
Prueba Rápida de Estreptococos o mediante Cultivo.
El método más comúmente empleado en los laboratorios clínicos para la
identificación presuntiva en cultivos de Streptococcus Beta-hemolítico del grupo
A (Streptococcuss pyogenes) es la prueba de susceptibiidad a la bacitracina o
Taxo A. Otra manera es detectar el antígeno A mediante enzimoinmunoanálisis o
inmunoaglutinación.
Grupo B
S. agalactiae, o GBS, causa neumonía y meningitis en neonatos y en las personas
más jóvenes, con bacteremia sistémica ocasional. Estos también pueden
colonizar los intestinos y el tracto reproductor femenino, incrementando el riesgo
de ruptura prematura de membranas y la transmisión al infante. El Colegio
Americano de Obstétras y Ginecólogos, la Academia Americana de Pediatras y
los Centros para el Control de las Enfermedades recomiendan a todas las mujeres
embarazadas entre 35 y 37 semanas de gestación la evaluación para GBS. Las
mujeres que obtengan un examen positivo debería recibir antibióticos
profilácticos durante la labor, con lo cual usualmente prevendrá la transmisión al
infante.
Grupo C
Incluye S. equi, el cual causa enfermedad en caballos,8 y S. zooepidemicus, el
cual causa infecciones en varias especies de mamíferos incluyendo al ganado y
caballos. Este también puede ocasionar muerte en gallinas y alces. Muchos
habitantes de las montañas en Canadá han encontrado cadáveres de alces
yaciendo en la mitad del camino; las pruebas post mórtem han establecido la
presencia de estreptococos del grupo C en su sangre.
Grupo D
(Enterococos) *hemolísis de tipo variable
Muchos estreptococos del Grupo D han sido reclasificados y ubicados en el
Género Enterococcus (incluyendo S. faecalis, S. faciem, S. durans, y S. avium).9
Por ejemplo, Streptococcus faecalis se conoce en la actualidad como
Enterococcus faecalis.

3. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Las cadenas remanentes no-enterocócicas del Grupo D incluyen Streptococcus
bovis y Streptococcus equinus.
Características generales del grupo
•Cocos, Gram +, pares de cadena
•Anaerobios facultativos algunos anaerobios obligados
•No formadores de espora
•Catalasa (–) •Inmóviles
•División en un plano
•Existen más 30 especies.
ENTEROCOCCUS
Enterococcus es un género de bacterias del ácido láctico del división Firmicutes.
Los miembros de este Gro. fueron clasificados como Grupo D Streptococcus hasta
1984 cuando los análisis de ADN genómicos indicaron que un Gro. separado era
más apropiado.[1]
Los enterococos son cocos Gram-positivos que se presentan apareados como
diplococos; siendo difícil distinguirlosde Streptococcus con solo las características
físicas. Dos especies son organismos comensales en el intestino de humanos: E.
faecalis y E. faecium. El enterococo es un organismo facultativo anaeróbico, i.e.
prefieren usar oxígeno, pero sobreviven bien en su ausencia.[2] Típicamente
exhiben gamma-hemolisis en sangre de cordero agar.
PATOLOGÍA
Importantes infectiones clínicas causadas por Enterococcus incluye a vejiga,
bacteremia, endocarditis, diverticulitis, y meningitis. Razas sensibles de estas
bacterias pueden tratarse con ampicilina y vancomicina.[3]
Desde un punto de vista médico, la acción más importante de estos géneros es su
alto nivel de resistencia antibiótica. Algunos enterococos son intrínsecamente
resistantes a β-lactam (algunas penicilinas y todas las cefalosporinas) y también
muchos aminoglicósidos.[4] Desde 1980, particularlmente razas virulentas de
Enterococcus resistentes a vancomicina han aparecido en infecciones
hospitalarias de pacientes hospitalizados. En países desarrollados como UK han
parado la epidemia, y en 2005, Singapur también manejó para detener una
epidemia de VRE. VRE puede tratarse con Quinupristina/dalfopristina (Synercid)
con respuestas favorables del 70 %.[5] Copy
La meningitis a enterococos es una rara complicación de neurocirugía. Suelen
requerir tratamiento intravenoso de vancomicina intratecal. La vancomicina es
usada y hay debate si tiene impacto en el sistema nervioso. La remoción de
cualquier asunto neurológico es parte crucial del manejo de estas infecciones.
CALDO AZIDA GLUCOSA

4. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Medio utilizado para el enriquecimiento selectivo de enterococos en aguas,
alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.
Fundamento
El medio permite un enriquecimiento selectivo de Enterococcus spp.
La tripteína, el extracto de carne y la glucosa constituyen la fuente nutritiva,
mientras que la azida sódica es inhibidora de la flora Gram negativa. El cloruro de
sodio se usa para mantener el equilibrio osmótico del medio
Fórmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Tripteína 15.0 Suspender 35 g del polvo por litro de
agua destilada. Reposar 5 minutos y
mezclar hasta uniformar. Calentar
agitando frecuentemente y hervir 1
minuto hasta disolver. Distribuir y
esterilizar 15 minutos a 121 ºC.
Extracto de carne 4.8
Glucosa 7.5
Cloruro de sodio 7.5
Azida sódica 0.2
pH final: 7.2 ± 0.2
Siembra
Por inoculación directa: cinco tubos por cada dilución.
Caldo simple concentración: 10 mililitros.
Caldo doble concentración: 1 mililitro.
Incubación
Aeróbica, a 35-37 ºC durante 48 horas.
Características del medio:
Medio preparado: ámbar claro
CALDO BHI
USO
El medio de Infusión Cerebro Corazón es utilizado para el cultivo de
microorganismos fastidiosos como estreptococos, neumococos y meningococos.
Este medio también es conocido como BHI por sus siglas en inglés.
EXPLICACION:
El medio de Infusión Cerebro Corazón es una modificación de las formulaciones
desarrolladas por Rosenow y Hayden en las que se adicionó infusión de cerebro
de ternera y difosfato de sodio.
El medio de Infusión Cerebro Corazón está especificado en varios procedimientos
estándares para la industria alimenticia y el análisis de aguas. También es
recomendado por la NCCLS para preparar el inóculo para las pruebas de
susceptibilidad antimicrobiana.
En este medio la infusión de carne de corazón y de cerebro de ternera así como
la peptona proveen la fuente de carbono, nitrógeno sulfuro y vitaminas. La
dextrosa actúa como fuente de energía. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmótico del medio. El fosfato disódico actúa como buffer.

5. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Fórmula (en gramos por litro)
Instrucciones
Infusión de Cerebro de
Ternera
200.0 Suspender 37g del medio en un litro
de agua purificada. Calentar con
agitación suave hasta su completa
disolución y hervir durante un minuto.
Dispensar en tubos de vidrio, tapar y
esterilizar en autoclave a 121°C (15
libras de presión) durante 15minutos.
Cloruro de Sodio 5.0
Infusión de Corazón de Res 250
Fosfato Disódico 2.5
Peptona de Gelatina 10.0
Dextrosa 2.
pH 7.4 ± 0.2
PRUEBA DE CATALASA
Se utiliza para comprobar la presencia del enzima catalasa que se encuentra en
la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas que contienen
citocromo. La principal excepción es Streptococcus.
Originariamente, esta prueba era utilizada para diferenciar entre los siguientes
géneros:
o Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+).
o Bacillus (+) de Clostridium (-).
o Lysteria monocytogenes (+) y/o Corynebacterium (+, con las excepciones
de C.pyogenes y C.haemolyticum, ambos -) deErysipelothrix (-)

6. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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METODOLOGÍA
Materialesa usarse en los experimentos
Placas Petri Tubos de
ensayo
Mechero Bunsen Balanza analítica

7. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Asa de Siembra Tripode
Malla de Asbesto Baño María
Pipeta Erlemeyer

8. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Reactivosusados en los experimento
Nombre del reactivo
Agar m-enterococos
Caldo BHI
Peróxidos de hidrogeno al 3%
𝐻 2 𝑂2
Caldo Azida glucosa(Medio
Selectivo)
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
 Preparación y dilución de la muestra
1. Pesar 10 g de la muestra ambiental en este caso una muestra de
pescado.
2. Colocar la muestra en la licuadora y diluir con 90 ml de agua
peptonada, preparada previamente, de licua por dos minutos.
3. Verter la solución en un tubo de ensayo y luego realizar diluciones
sucesivas en los tubos que contienen 9ml de agua peptonada.
10−1
10−2
10−3
10−4
10−5

9. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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 Siembra por triplicado en caldo Azida Glucosa
1. Un mililitro de cada dilución se siembra en tres tubos de caldo Azida
Glucosa que contienen 10ml del medio. Con una pipeta diferente por
cada dilución.
2. Se coloca en un rejilla los tubos de ensayo con los caldos sembrados y se los
lleva a incubar a 35-370C por un tiempo de 24 a 48 horas.
 Siembra en placa de Agar Enterococos
1. Se seleccionan los tubos positivosobtenidos en la siembra en caldo Azida
glucosa.
2. Los organismos de los tubos seleccionados se siembran por estriado en agar
Enterococosen placa.
3. Se colocan las placas en la incubadora a 370C por 48 horas.
 Siembra de colonias características en Caldo BHI
1. Se toma un asa de siembra y se la coloca al fuego hasta su coloración al
rojo vivo.
2. Cerca del mechero, se toma el tubo de ensayo que contiene el caldo
estéril y se flamea la boca del tubo para esterilizar.
3. Se transfiere el inóculo hacia el caldo, descargando el inóculo mediante
agitación del asa de siembra en aquél.
4. Una vez sembrado el inóculo se vuelve a flamear la boca del tubo antes
de colocar el tapón.
5. Este procedimiento se repite para cada colonias seleccionada, se siembra
en distintos tubos. Terminado el proceso se coloca la rejilla de los tubos de
caldo sembrados en la incubadora a 370C por 24 horas.
 Tinción Gram.(Para confirmar Estreptococos fecales)
1. Se tendrá como muestra problema a los organismos que hayan crecido en
los tubos de caldo BHI (medio de enriquecimiento).
2. Se realiza el frotis con dos asadas de la muestra, y la fijación con el
mechero de alcohol.
3. Se hace la coloración con cristal violeta, dejar durante 1 minuto.
4. Se lava con agua para eliminar el exceso de colorante.
5. Se añade el lugol, aplicándose durante un minuto
6. Lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de lugol.

10. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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7. Decolorar con alcohol acetona durante 15 a 20 segundos
8. Lavar abundantemente con agua para eliminar el exceso de alcohol.
9. Cubrir el portaobjetos con safranina por 20 a 30 segundos.
10. Lavar, con con agua para eliminar el exceso de safranina.
11. Secar al calor del mechero de alcohol.
12. Colocar con capilar aceite de inmersión al portaobjetos.
13. Observar al microoscopio con una resolución de 1000X e identificar
estreptococos fecales.
 Prueba de Catalasa (prueba confirmativa de estreptococos fecales)
1. Se toma un tubo de ensayo pequeño.
2. Con una pipeta se coloca 0.5 ml de peróxido de hidrogeno al 3% en el
tubo.
3. Se agrega al tubo 3 ml del cultivo BHI.
4. Se procede a observar la reacción catalasa que se espera que se
produzca.
5. La reacción catalasa positiva se evidencia por la formación de burbujas de
lo contrario es una reacción catalasa negativa.
6. Para la determinación de Estreptococos fecales el resultado de la prueba
catalasa tiene que ser negativo.
7. Los resultados se comparan con la tabla del número más probable Y se
reporta como NMP/gramo de estreptococos fecales.
 Siembra en Caldo BHI (al baño maría) y Caldo BHI con 6.5% de NaCl
1. Si con la prueba catalasa y tinción gram se identificó NMP por gramo de
estreptococos fecales, entoncesrecien se procedea realizar estas pruebas
para identificar también dentro de los estreptococos fecales, la presencia
de enterococos.
2. De los cultivo del caldo BHI de los cuales se realizó las prueba de catalasa y
tinción Gram; y salieron positivos de estreptococos fecales se va ser una
resiembra en otros tubos de caldo BHI estéril de cada uno.
3. Se esteriliza el asa de siembra calentándolo hasta el rojo vivo.
4. Se toma el tubo del cultivo de con microorganismos y se agita para
dispersarlos.
5. Se destapa el tubo y se flamea la boca.
6. Con el asa de siembra esterilizada se retira los microorganismos del tubo.
7. Se retira el asa de siembra con cuidado y se vuelve a flamear la boca del
tubo antes de taparlo.

11. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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8. Cerca del fuego se toma un tubo de caldo BHI estéril, se lo destapa, se
flamea la boca y allí se siembra la primera asada del inoculo extraído. Se
sembraran dos asadas en cada tubo.
9. El procedimiento se repite pero con caldos BHI con cloruro de sodio NaCl al
6.5%.
10. Los tubos de caldo BHI sembrados de llevaran a Baño maría a 460C por 48
horas.
11. Los tubos con caldos BHI con cloruro de sodio NaCl al 6.5% se llevarán a la
incubadora a 35-370C por 72 horas.
12. Si luego del tiempo transcurrido para ambos casos hay crecimiento o
turbidez en ambos entonces será una prueba positiva de enterococos y se
reportará NMP/ gramo de enterococos utilizando la tabla del número más
probable.
OBSERVACIONES/RESULTADOS
Tubos positivosde BHI incubados
Dilución 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Tubos
positivos
No se hizo 3 1 1 0
Prueba Catalasa
Negativos:
- 10-4
- 10-3 C
- 10-2 B
- 10-1 C
Positivos:
- 10-2A
BHI (baño maria)
En todos hay turbidez:
- 10-4
- 10-3 C
- 10-2 B
- 10-1 C
-

12. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Dilución 10-2 10-3 10-4
Tubos
positivos
2 1 1
BHI + NaCl
En todos hay turbidez:
- 10-4
- 10-3 C
- 10-2 B
- 10-1 C
Dilución 10-2 10-3 10-4
Tubos
positivos
2 1 1
DISCUSION Y CONCLUSIONES
 Se concluye que el color rojo cereza de la interfase se produce
debido a que el indol reacciona con él para-dimetil-
aminobenzaldehido
 El alfa Naftol actúa como catalizador y la sosa o potasa hace al
medio alcalino y reacciona con la Acetoìna formando un
precipitado
 Se concluye que la producción del acido tiene que ser suficiente
para producir el viraje del indicador (rojo de metilo) y que el
microorganismo fermenta la glucosa por via acido mixto
 Tal y como se esperaba se pudo lograr esta vez un buen resultado
en el NMP debido a que esta vez si se realizo un buen trabajo
 Debido a la confirmación realizada en el caldo BHI bajo el
microscopio y con la prueba de catalasa pudimos llegar a la
conclusión de que obtuvimos estreptococos fecales con una
cantidad mayor de1100 NMP /gr
 La prueba para enterococos resulto negativa pues todas las
siembras realizadas en caldo BHI con NaCl al 6.5% resultaron
negativas pues no presentaban turbidez para lo cual llegamos a la

13. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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conclusión de que se había realizado una mala práctica pues ya se
tenía indicios de que esto fuese así.
RECOMENDACIONES
 A la hora de sembrar es preferible estar cerca del mechero de
bunsen para así poder evitar alguna contaminación a la muestra.
 En la prueba de la catalasa mirar que el peróxido de hidrogeno a
utilizar sea reciente y que no se hay cencido.
 Manejar con cuidado el microscopio ya que se puede dañar los
lentes ópticos.
 Realizar de forma correcta las inoculaciones, para evitar errores en
los resultados.
 Seguir las indicaciones del profesor encargado del curso para que el
experimento sea un éxito.
 A la hora de la tinción no tener mucho tiempo el alcohol acetona
en el portaobjetos ya que dañaría a las bacterias y se obtendría
otros resultados inesperados.
BIBLIOGRAFIA
 Raquel Granados Pérez, Bacteriología. Medios de cultivo y pruebas
bioquímicas. Micología General. Parasitología General Tomo ll,
Segunda Edición, Paraninfo, Madrid, 2003.
 Alonso Urmeneta y otros. Manual Práctico de Microbiología.
 Raquel Granados Pérez, Bacteriología. Medios de cultivo y pruebas
bioquímicas. Micología General. Parasitología General Tomo l,
Segunda Edición, Paraninfo, Madrid, 2003.
ANEXOS
Galería

14. PRÁCTICA DE LABORATORIO N 8
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Se muentra el Caldo BHI, Se muestra la prueba de la Catalasa.
Se muestra una placa petri con Agar m-enterocos. Las placas petri con Agar m-enterococos se lleva a la incubadora.