Incidencias y mantenimiento_en_hplc

Traducción Grupo Biomaster 2009 © Crawford Scientific 2007
Incidencias y Mantenimiento en HPLC

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1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................... - 4 -
2 EL CROMATÓGRAFO LÍQUIDO BÁSICO....................................................................... - 6 -
2.1 VOLUMEN EXTRA EN COLUMNA(V0)..........................................................................................- 9 -
2.2 CRITERIOS PARA UN MANTENIMIENTO LÓGICO ....................................................................- 11 -
2.3 REGLAS DE ORO EN EL DIAGNÓSTICO DE AVERÍAS...............................................................- 12 -
2.4 PROBLEMAS TÍPICOS EN HPLC.............................................................................................- 12 -
3 LA FASE MÓVIL.................................................................................................................. - 14 -
3.1 COMPATIBILIDAD DEL DISOLVENTE Y EQUILIBRADO DEL SISTEMA......................................- 14 -
3.2 PREPARACION DE LA FASE MOVIL.............................................................................................-19
3.3 DESGASIFICACIÓN DE LA FASE MÓVIL..................................................................................- 33 -
3.4 FILTRACIÓN DE LA FASE MÓVIL ...........................................................................................- 40 -
4 SISTEMAS DE BOMBEO.................................................................................................... - 46 -
4.1 FUNCIONES DE LA BOMBA ....................................................................................................- 46 -
4.2 BOMBA RECÍPROCA DE PISTÓN SIMPLE ................................................................................- 47 -
4.3 LA BOMBA RECÍPROCA DE DOBLE PISTÓN ...........................................................................- 49 -
4.4 LA BOMBA BINARIA DE GRADIENTE.....................................................................................- 50 -
4.5 LA BOMBA CUATERNARIA DE GRADIENTE ...........................................................................- 51 -
4.6 FORMACIÓN DE GRADIENTES Y TIEMPO MUERTO (“DWELL-TIME”)....................................- 52 -
4.7 INCIDENCIAS DE LA BOMBA..................................................................................................- 55 -
TUTORIAL 1................................................................................................................................... - 61 -
5 INYECTORES............................................................................................................................. - 65 -
5.1 COMPONENTES DEL SISTEMA DE INYECCIÓN ........................................................................- 65 -
5.2 AUTOMUESTREADORES.........................................................................................................- 71 -
5.3 INCIDENCIAS DEL AUTOMUESTREADOR ................................................................................- 76 -
6 COLUMNAS................................................................................................................................ - 86 -
6.1 LIMPIEZA, PURGA Y ALMACENAMIENTO DE LA COLUMNA ...................................................- 86 -
6.2 INCIDENCIAS DE LA COLUMNA........................................................................................................................-90-
7. PICOS CON COLA .................................................................................................................... - 96 -
8. PICOS CON FRENTE.............................................................................................................. - 101 -
TUTORIAL 2................................................................................................................................. - 102 -
9 DETECTORES .................................................................................................................... - 104 -
9.1 EL DETECTOR IDEAL...........................................................................................................- 104 -
9.2 EL DETECTOR UV/VISIBLE.................................................................................................- 107 -
9.3 INCIDENCIAS Y MANTENIMIENTO DEL DETECTOR UV/VISIBLE ..........................................- 109 -
9.4 PICOS NEGATIVOS............................................................................................................................................-114-
9.5 EL DETECTOR DE LIGHT SCATTERING EVAPORATIVO .........................................................- 116 -
9.6 EL DETECTOR ESPECTROMÉTRICO DE MASAS.....................................................................- 118 -
TUTORIAL 3................................................................................................................................. - 125 -
10.1 LÍNEAS DE BASE ................................................................................................................- 128 -
10.1.1 LÍNEAS DE BASE ERRÁTICAS .............................................................................................- 128 -
10.1.2 LÍNEA DE BASE CÍCLICA (CORTA FRECUENCIA)........................................................- 130 -
10.1.3 LÍNEA DE BASE CÍCLICA (LARGA FRECUENCIA)........................................................- 133 -
10.1.4 LINEAS DE BASES CON DERIVA .................................................................................- 136 -
10.1.5 LÍNEAS DE BASE CON RUIDO.....................................................................................- 138 -
10.2 FORMAS DE PICO ..............................................................................................................- 140 -
10.2.1 ENSANCHAMIENTO DE LOS PICOS..............................................................................- 140 -
10.2.2 DESDOBLAMIENTO DE PICOS Y HOMBROS.................................................................- 143 -
10.2.4 PICOS CON FRENTE....................................................................................................- 151 -
10.2.5 EFECTO MEMORIA Y PICOS FANTASMA.....................................................................- 152 -
10.2.6 PICOS NEGATIVOS .....................................................................................................- 154 -
10.3 TIEMPO DE RETENCIÓN.....................................................................................................- 156 -

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10.3.1 TIEMPOS DE RETENCIÓN FLUCTUANTES....................................................................- 156 -
10.3.2 DECRECIMIENTO DEL TIEMPO DE RETENCIÓN ...........................................................- 160 -
10.3.3 AUMENTO DEL TIEMPO DE RETENCIÓN .....................................................................- 162 -
10.4 INCIDENCIAS CON LA PRESIÓN ..................................................................................- 162 -
10.5 SENSIBILIDAD............................................................................................................- 166 -

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1 Introducción
El objetivo de esta sección es:
• Proporcionar una visión general del curso de incidencias y
mantenimiento en HPLC.
• Detallar el contenido del curso.
Contenidos del curso
• El Cromatógrafo Líquido Básico
• Criterios para un mantenimiento lógico
• Incidencias y Mantenimiento
Buenas prácticas de mantenimiento para;
Fase Móvil
Bomba
Sistemas de Inyección
Columnas
Detectores
• Diagnóstico desde una perspectiva sintomática
Diagnósticos empleando el cromatograma y observando los
parámetros de operación del sistema;
Apariencia de la línea de base Cromatográfica.
Apariencia de la forma de los picos
Variación de los Tiempos de Retención.
Alteraciones de la presión.
Sensibilidad.
Recuperación.

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2 El Cromatógrafo Líquido Básico
El objetivo de esta sección está destinado a:
• Ilustrar y describir los fundamentos en cromatografía líquida.
• Describir los enfoques para resolver de forma lógica las incidencias en
cromatografía líquida.
• Enumerar las "Reglas de Oro" en la resolución de problemas en HPLC.
• Describir los problemas típicos en HPLC.
La figura anterior muestra los componentes modulares y el recorrido típico
del flujo en un cromatógrafo líquido. Los módulos del sistema HPLC están
conectados a través de tubos capilares fabricados en material polimérico,
Polieter-eter-cetona (PEEK), o en acero inoxidable. Para eliminar
volúmenes extra en columna que generen picos cromatográficos anchos, los
módulos deben conectarse entre sí empleando la mínima longitud de tubo
posible.
Botellas de Disolvente
Los disolventes que conforman la fase móvil están contenidos en botellas
que generalmente se encuentran en la parte superior del sistema HPLC.
Dicha disposición mejora su suministro, ya que se consigue un descenso
natural de la fase líquida por efecto sifón bajo influencia de la gravedad.
Las botellas de los disolventes deben estar cerradas herméticamente a fin
de prevenir la pérdida de solventes orgánicos por evaporación, aunque
siempre debe existir una pequeña abertura para evitar la formación de vacío

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que dificulte el cebado de la línea. En un análisis de larga duración, la
pérdida de solventes orgánicos por evaporación en el espacio en cabeza
disminuirá la fuerza efectiva de elución de la fase móvil, lo que provocará
cambios en la retención del analito. Por tanto, debido a efectos por
gradientes en la concentración y evaporación parcial de la fase móvil, se
pueden producir cambios a lo largo del tiempo, que provocarán que las
características de la fase móvil varíen de las inicialmente preparadas. Una
buena práctica consiste en cambiar el disolvente usado por disolvente
fresco, en lugar de extremar su consumo a largos periodos que tiempo hasta
casi agotarlos.
Se debe evitar el empleo de film de laboratorio (Parafilm, etc...) para
cubrir las botellas de los disolventes. El material del film contiene ftalatos
y polímeros, que pueden migrar por extracción con el solvente en el espacio
en cabeza, incrementando el ruido en la línea de base del cromatograma. El
Espectrómetro de Masas es especialmente sensible a este tipo de
contaminantes que generan picos en la línea de base de un espectro de
masas obtenido por LC-MS.
La filtración de los disolventes antes de su uso, especialmente si
estos contienen aditivos como sales tampón y/o reactivos de pares de
iones, asegura la eliminación de material particulado que puede
dañar los componentes del sistema. Además, es recomendable
instalar en las líneas de disolvente un sistema de filtración que
prevenga la entrada de partículas al sistema HPLC. Estos filtros están
hechos a menudo de vidrio; cuando se deba eliminar contaminación
se lavará primero con ácido nítrico concentrado (6M), después se hará
un lavado con H2O, el siguiente lavado se hará con MeOH y después se
hará pasar H2O de nuevo, antes de volver a reinstalar el sistema. Los
filtros no deben sonicarse pues el vidrio sinterizado se podría romper
y astillar, bloqueando los filtros y disminuyendo la eficacia del
sistema.
El reciclado de la fase móvil está limitado únicamente a las separaciones
que trabajen en isocrático, y es más útil en los métodos empleados para
análisis de rutina que contengan bajas concentraciones de muestra, como es
el caso de laboratorios de Control de Calidad (CQ). Los componentes de la
muestra se diluyen en la fase móvil de forma que se requieren largos
periodos de tiempo para apreciar trazas significativas de los compuestos en
el cromatograma. Generalmente esto se evidencia como un aumento en la
Línea de Base y/o Fondo, lo que se traduce en pérdida de sensibilidad para
el analito.

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Desgasificador
La eliminación de gases disueltos en la fase móvil ayuda a prevenir la
formación de burbujas en el sistema HPLC. Burbujas de aire en la bomba
pueden provocar pérdida de eficacia en el cebado de ésta, errores en la
formación de gradientes de disolventes y ruido en la línea de base debido a
fluctuaciones en la presión. Las columnas del HPLC pueden perder
rendimiento si circulan burbujas de aire a través de estas debido a la
formación de “canales” por presión, estos se saturarán rápidamente con
moléculas de analito lo que hará perder capacidad de retención de la
columna por perdida de superficie activa. Las burbujas de aire formadas por
desgasificación en la celda del detector pueden contribuir al ruido de la
línea de base, lo que reduce los límites de detección esperados y/o los
límites de cuantificación.
La figura anterior muestra los efectos por “canalización” de la columna en
la retención del analito.
Los disolventes pueden ser desgasificados fuera de línea antes de su uso, o
como suele ser más frecuente, mediante incorporación de un desgasificador
en línea que permite la desgasificación in situ de los disolventes.
Bomba HPLC
La bomba del HPLC, o sistema de suministro de disolvente, es la responsable
de conseguir una composición exacta de la fase móvil a velocidades de flujo
constantes y proporcionar la fuerza necesaria para el transporte de dicha
fase a través del relleno de la columna. Lo ideal sería que la bomba no
produjese impulsos impredecibles en la presión, por ello la mayoría de los
sistemas acostumbran a estar dotados de un mecanismo integrado de
amortiguación para la presión (Damper) que ayuda a corregir dicho efecto.

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Automuestreador
Es necesario un sistema automatizado que inyecte la muestra en cabeza de
columna del HPLC, sin detener o distorsionar el flujo de la fase móvil.
El muestreador automático debe minimizar el efecto memoria del analito
entre inyecciones, e incrementar la productividad gracias a funciones
adicionales tales como la capacidad de derivatizar la muestra antes de la
columna, adición de soluciones de estándar interno, etc…
Columna
La separación cromatográfica de los componentes de la muestra tiene lugar
a través de la interacción específica entre el analito y la fase estacionaria
de la columna. Para largos periodos de tiempo entre usos, la columna del
HPLC debe almacenarse en condiciones correctas. Las columnas no deben
ser sometidas a excesivo estrés físico, así como a golpes o caídas, que
pueden alterar el relleno de la fase estacionaria empobreciendo su
rendimiento. Para minimizar variaciones en los tiempos de retención
absolutos es habitual termostatizar la columna a fin de evitar los efectos
fluctuantes de la temperatura ambiente.
Detector
Existe una gran variedad de detectores, aunque debido a su costo, robustez,
límites de detección y facilidad de uso, el detector más utilizado es el de
absorbancia UV. Los detectores UV están disponibles en una sola longitud de
onda, múltiples longitudes de onda o en configuración de diodo array, que
por su capacidad de analizar la de pureza de picos y de realizar búsquedas
frente a bibliotecas de espectros UV ha llegado a ser muy popular.
Para análisis que requieran alta sensibilidad y selectividad es preferible el
uso de detectores de fluorescencia, electroquímicos o espectrómetros de
masas. Los detectores de índice de refracción son solo aconsejables si el
resto de detectores no son aplicables o si la concentración del analito es
alta.
2.1 Volumen Extra en Columna(V0)
Una consideración importante en el diseño de un sistema HPLC es el
volumen extra en columna. El volumen extra en columna representa el
volumen total de todos los componentes del sistema y conducciones
capilares que no están directamente involucrados en el proceso de
separación, desde el punto de inyección de la muestra hasta la detección.
Este volumen extra debe ser minimizado a fin de evitar la formación de
picos anchos y una disminución en la eficacia de la columna además de
perder resolución cromatográfica. Por lo tanto;

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• Cada módulo debe ser conectado con la mínima longitud de tubo
capilar y el mínimo diámetro interno posible.
• Los sistemas de inyección y los detectores deben ser diseñados para
tener el volumen interno más pequeño posible.
• La columna debe tener un relleno lo más uniforme posible con la
distribución de tamaños de partícula más estrecha permisible.
Ancho de Pico provocado por un incremento de Volumen-Extra en
Columna

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2.2 Criterios para un Mantenimiento Lógico
Hay dos enfoques que pueden ser utilizados para identificar problemas en
cromatografía líquida:
Perspectiva desde los Componentes
Tras identificar el problema, cada componente que pueda contribuir a ello o
ser la causa del fallo, se examina de nuevo. Cada componente examinado
se limpia o se reemplaza según convenga y mediante el sistema de chequeo
del HPLC en cada etapa se identifica si el problema ha sido corregido o no.
Este enfoque en la resolución de problemas permite conseguir una
familiarización del analista con el equipamiento del HPLC, aún así, puede
perderse mucho tiempo en localizar y corregir componentes defectuosos.
Este enfoque puede orientarse hacia la búsqueda de pistas visualmente
como fugas o altas presiones y así poder localizar problemas en los
componentes “físicos” del sistema.
Perspectiva Sintomática
Este enfoque en la identificación de problemas se refiere específicamente a
los efectos que el analista puede ver. Generalmente incluye un examen
visual de la línea de base o de la forma y/o apariencia de los picos
cromatográficos a fin de encontrar indicios de problemas en la selectividad
de la separación o en los componentes del sistema.
Variaciones en los tiempos de retención, cambios en la presión del sistema,
perdidas de sensibilidad o en las recuperaciones del analito, se pueden
estudiar a través de ambas perspectivas.

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2.3 Reglas de Oro en el Diagnóstico de Averías
La combinación de ambos diagnósticos, a partir de los componentes y a
partir de los síntomas, nos permite formular una serie de “Reglas de Oro en
el Diagnóstico de Averías” con un carácter empírico:
1. Hacer sólo un cambio por operación.
2. Asegurarse de que el problema realmente existe.
Confirmarlo como mínimo dos veces.
3. Colocar correctamente de nuevo los componentes.
Si no se encontró ningún fallo reinstalar correctamente las partes
reemplazadas durante la sustitución de los componentes,
4. Desechar los componentes defectuosos.
No almacenar componentes que se sabe son defectuosos; desecharlos
para eliminar toda posibilidad de utilización posterior.
5. Anotar siempre los componentes reemplazados.
Generar un registro de históricos de reparación y mantenimiento del
sistema HPLC. Esto permite una acción realmente preventiva al
realizar un mantenimiento programado de todo el sistema que
elimina la necesidad de responder sólo ante posibles situaciones de
fallo. Dicho registro, además, ayudará al ingeniero de servicio
técnico cuando tenga que diagnosticar un problema en el sistema.
2.4 Problemas Típicos en HPLC
Existen tres enfoques principales para localizar e identificar problemas en
HPLC, incluyendo:
1. Examen de los parámetros operativos del sistema. Uno de los
parámetros que más información aporta y que puede ser observado a
través del monitor es la Presión del sistema.
Según varíe la lectura de la presión se puede deducir que:
• Es demasiado alta debido a un bloqueo en el sistema
• Es demasiado baja debido a fugas en el sistema
• Hay fluctuaciones.
2. Examen visual del sistema HPLC que especificará que componentes
son susceptibles de fallo. Las fugas en las conexiones de accesorios,
al final de la columna, en la celda del detector, en el
automuestreador, en el cabezal de la bomba, etc… pueden ser
debidas a sobrepresión del sistema y ser la causa de una pérdida de
presión del mismo.

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3. Examen del Cromatograma resultante.
Línea de Base
• ¿La línea de base cromatográfica es plana, o fluctúa
cíclicamente?
• ¿La línea de base cromatográfica muestra ruido en exceso?
• Examinando la línea de base se puede obtener gran cantidad de
información del estado del sistema HPLC siendo de gran ayuda
en el diagnóstico problemas.
Picos
• ¿La forma de los picos cromatográficos es simétrica, o
presentan colas y/o desdoblamientos apreciables?
• ¿Los Tiempos de Retención Absolutos de los picos
cromatográficos varían entre inyecciones?
• ¿La sensibilidad frente al analito ha disminuido?
• Monitorizando los cambios en la forma de los picos
cromatográficos y en los tiempos de retención se puede
obtener una considerable información sobre el estado del
sistema HPLC.

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3 La Fase Móvil
El objetivo de esta sección es;
• Explicar la importancia de asegurar la compatibilidad del disolvente.
• Describir un protocolo genérico para la preparación de las fases
móviles.
• Explicar la importancia de la desgasificación de la fase móvil.
• Enumerar y describir los modos en los que la desgasificación de la
fase móvil pueden realizarse.
• Explicar la importancia en la filtración de la fase móvil.
3.1 Compatibilidad del Disolvente y Equilibrado
del Sistema
Es importante tener en cuenta la miscibilidad de un disolvente con otro. Los
disolventes que no son miscibles se particionarán en dos fases, dando como
resultado una eliminación incompleta del disolvente original del sistema
HPLC. Componentes del sistema como la válvula de proporción, las cámaras
del pistón del cabezal de la bomba, los poros del relleno de la columna y la
celda del detector continuarán liberando pequeñas gotas del disolvente
anterior incluso después del proceso de purga, lo que hará que éstas migren
a través del sistema creando perturbaciones en la línea de base
cromatográfica, así como burbujas del disolvente que se comportarán de
manera análoga a burbujas de aire que pasan a través de la celda del
detector. El ruido en la línea de base afectará a la sensibilidad del analito,
así como a los límites de cuantificación o detección que se verán
incrementados dando como resultado:
Ruido en la línea de base causado por la presencia de aire
en la célula de flujo.
.
Una línea de base ruidosa afectará a la sensibilidad frente a los analitos, y
se aumentarán los límites de detección y de cuantificación.

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La tabla siguiente muestra la compatibilidad de disolventes. Se debe tener
en cuenta la fuerza de los disolventes que están siendo usados: si hay
grandes desajustes en la fuerza de los disolventes, las sales de las soluciones
tampón o incluso las muestras podrían precipitar en el inyector o en la
columna, provocando un incremento de contrapresión operativa en el
sistema.
La tabla muestra la miscibilidad de los disolventes más comunes en HPLC
El estudio de compatibilidad de varios disolventes para HPLC muestra una
gran variedad de solventes “universales”, como el tetrahidrofurano (THF)
que es miscible con la mayoría del resto de disolventes. El disolvente de uso
más frecuente en limpiezas es con diferencia el isopropanol (IPA) debido a
su miscibilidad con el resto de solventes en todos los rangos de
concentraciones. Ello hace del isopropanol una elección muy popular como
solvente intermedio cuando hay cambio de eluyentes de fase reversa a fase
normal y viceversa.
Un cambio entre solventes que son inmiscibles, o una mala sustitución de la
fase móvil previamente usada por sistema HPLC, hacen que la composición
del eluyente en la columna no sea uniforme. Esto puede provocar
variaciones en los Tiempos de Retención, especialmente durante las
primeras inyecciones de muestras.

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Fluctuaciones en los Tiempos de Retención debido a un pobre
equilibrado de la fase móvil o al uso de solventes inmiscibles
También se pueden observar derivas o ruido en la línea de base debido a
variaciones en el detector entre una fase móvil nueva y la anterior:
Ejemplo de una línea de base con deriva (figura superior) y una línea de
base errática (figura inferior) que pueden verse en un sistema no
equilibrado

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Cada vez que se cambie el disolvente es necesario hacer pasar por
todo el sistema un volumen del solvente nuevo equivalente a 10 veces
el volumen de la columna. Para calcular este volumen
empíricamente hay que determinar antes el volumen vacío efectivo
de la columna. Si las dimensiones de la columna fueran 150 x 4,6 mm
de diámetro interno (DI), el volumen interno se puede calcular
multiplicando el área por la longitud. Como regla general el volumen
vacío de la columna será aproximadamente el 68% del total de esta,
siendo el resto el ocupado por el material de relleno.
Aplicando la siguiente ecuación y estando todas las dimensiones en
milímetros, se obtiene el volumen vacío efectivo de la columna en
microlitros;
Volumen Vacío Columna = πr2
x L x 0.68
Volumen Vacío Columna = π (2.3)2
x 150 x 0.68
Volumen Vacío Columna ≈ 1,700µL (1.7mL)
Por tanto, si el flujo fuera 1.0mL/min, serían necesarios aproximadamente
17 min para haber pasado 10 volúmenes de la columna en el cambio.
Use siempre gradientes para pasar de un disolvente al siguiente. La
siguiente secuencia de intercambio entre solventes es necesaria para
realizar la conversión entre fase reversa y fase normal a fin de eliminar la
posibilidad de inmiscibilidades entre los disolventes, o precipitaciones de la
muestra o las sales tampón;
• Fase móvil
Elimina de la columna todos los analitos retenidos.
• H2O
Cualquier tampón usado debe ser reemplazado solo con agua, por
ejemplo, en una separación isocrática con 50:50 MeOH:50mM de
KH2PO4, entonces los 50mM de KH2PO4 deben ser intercambiados por
H2O y el sistema deberá ser purgado adecuadamente.
• H2O
Retirar la columna del sistema y purgar solo con H2O al 100% para
eliminar todas las posibles trazas de sales tampón.
• Isopropanol
• Isopropanol:Hexano (u otros disolventes “no localizadores”(*)) 50:50
• Elución en Fase Normal
Nota: ¡El Acetonitrilo y el Hexano son INMISCIBLES!
(*) que no tengan la capacidad de interactuar con grupos específicos de la
fase estacionaria)

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Nota: Los métodos que usan reactivos formadores de pares de iones
requieren normalmente tiempos largos de equilibrado. Suele ser necesario
purgar con un mínimo de 20 volúmenes equivalentes al volumen de la
columna.
Protocolo genérico de Arranque para un sistema HPLC
Para evitar los problemas asociados a un mal equilibrado del sistema se
sugiere el protocolo de arranque descrito a continuación:
1. Encender los módulos del equipo.
2. Preparar los disolventes, incluyendo filtración y desgasificación.
3. Cebar las líneas de los solventes y la bomba.
Establecer la composición de la fase móvil y el flujo tal y como lo
especifique el método.
4. Purgar el sistema sin la columna durante 5 min, chequeando si hay
fugas.
5. Detener el flujo e instalar la columna.
Purgar el sistema con la columna en su sitio durante un tiempo para
dicho flujo que sea equivalente a mínimo 10 volúmenes de la
columna, chequeando si hay fugas.
6. Equilibrar el sistema durante 10 min, controlando contrapresiones en
el sistema.
7. Si procede, purgar el automuestreador y volver a equilibrar durante
10 min
8. Inyectar la/s muestra/s de chequeo si el sistema está estabilizado
Evaluar para confirmar si el sistema HPLC es “apto para la finalidad
prevista”

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3.2 Preparación de la Fase Móvil
Influencia del pH
El pH de la fase móvil influye directamente sobre el estado de ionización y
en consecuencia sobre el tiempo de retención del analito.
El pH y la capacidad tamponadora de cualquier fase móvil requieren de una
medición y una preparación exacta respectivamente, de lo contrario la
selectividad en la separación variará dando como resultado tiempos de
retención irreproducibles y formas de pico variables.
El cromatograma siguiente muestra la separación de seis analitos de ácido
débil en una fase móvil de pH 5.10. A ese pH los seis componentes quedan
resueltos adecuadamente, con una resolución de 1.50 para el par de picos
críticos 1 y 2 – separación mínima de pico recomendada en análisis
cuantitativos

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Sin embargo, si el pH de la fase móvil se ajusta incorrectamente, o el error
de medida en la calibración del pH es del orden de 0.10 unidades, la
separación cromatográfica de los seis analitos anteriores presentaría el
siguiente cromatograma;
A un pH de 5.20 los seis analitos no se resuelven correctamente, con una
resolución de tan solo 0.58 en la separación de los picos 5 y 6. Dicho valor
es considerablemente menor a 1.50 y por consiguiente el área de cada pico
no puede ser integrada correctamente para la cuantificación.

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Cuando se cromatografían compuestos ionizables es una ventaja mantener
los compuestos en su forma no ionizada. Los compuestos ionizados
representan analitos altamente polares, que en condiciones de fase reversa
eluyen rápidamente de la columna, lo que reduce las posibilidades de
separarlos del resto de analitos ionizados.
Usando soluciones tampón y ajustando el pH para forzar que los compuestos
estén en forma no ionizada, los ácidos y bases débiles pueden separarse
eficientemente en condiciones de fase reversa.
El pKa de una molécula puede usarse para determinar a que pH debe
tamponarse la fase móvil para asegurar una buena reproducibilidad en los
tiempos de retención:
• Para ácidos orgánicos el pH se ajusta 2 unidades por debajo de su pKa
• Para bases orgánicas el pH se ajusta 2 unidades por encima de su pKa.
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
pH
k’
2 4 86
Weakly Basic
Weakly Acidic
pH = pK
O
R C O
H
O
R C
O

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Fuerza Tamponadora
El cromatograma siguiente muestra el efecto de un cambio en la fuerza
tamponadora durante una separación isocrática de seis aditivos
alimentarios; ácido ascórbico, sorbato potásico, benzoato sódico, vainillina,
cumarina y etil-vainillina, picos del 1 al 6 respectivamente.
El primer cromatograma muestra la separación de seis analitos mediante un
tampón de concentración 60mM. La pareja de picos 4 y 5 se separa con una
resolución de 1.65, separación suficiente para poder cuantificarlos.
El segundo cromatograma muestra la separación de los mismos seis analitos
con un tampón de concentración 57 mM. Con tan solo una ligera reducción
en la concentración del tampón, la resolución en la separación de la pareja
de picos 4 y 5 pasa a ser de solo 0.97, separación insuficiente para una
correcta cuantificación.
Un cambio de 3mM en la concentración del tampón tiene efectos notables
en la selectividad del sistema de separación. El resultado es una pareja de
picos inadecuadamente separados y la imposibilidad de su análisis
cuantitativo lo que nos demuestra la importancia de una pesada exacta.

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Determinación del Peso y Pesada
Cualquier pesada estará sujeta a errores que deben ser minimizados para
asegurar la menor desviación posible en la cuantificación final obtenida. Se
conseguirán mínimos errores siguiendo los siguientes criterios:

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Uso del equipo de medición adecuado:
• El equipo de medición funciona correctamente, es decir, “es
adecuado para el fin previsto” y está calibrado correctamente de
manera que la fiabilidad de la medida obtenida es alta.
• El procedimiento de medida y de registro utilizado es correcto.
El “Límite Funcional de Exactitud” (FAL, del inglés “Functional Accuracy
Limit”) de cualquier balanza utilizada en el pesaje de sales para la solución
tampón u otros aditivos, está aceptado generalmente como un 0.1%, siendo
este el % de error permitido en la medida.
Es necesario determinar de antemano que tipo de lectura tendrá la balanza
que va a ser utilizada, y por tanto “La Cantidad Mínima Permisible” que
puede ser pesada (MAQ, del inglés “Minimum Allowable Quantity”). La MAQ
para una balanza puede ser determinada del siguiente modo:
MAQ = 100% / FAL (%) x lectura de la balanza.
Es decir, para una balanza de cuatro cifras (de lectura 0.0001g) se tendrá
una MAQ igual a:
MAQ = 100% / 0.1% x 0.0001 = 0.1g (100mg)
Por lo tanto, para determinaciones de peso con precisión para el ejemplo
anterior, el límite inferior serían 100mg para una balanza de cuatro dígitos.
Balanza de 6 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1mg
Balanza de 4 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 100mg Balanza de 3 decimales
MAQ (FAL = 0.1%) = 1g

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Las tolerancias típicas en el pesaje para los tres modelos de balanzas
descritos son:
Tolerancias Típicas en el Pesaje para los modelos de Balanzas descritos
Modelo de Balanza Peso Máximo
(g)
Tolerancia
(mg)
Plato de Carga Superior 3,200 ±10
5,200 ±10
8,200 ±100
Semi-micro analítica 60 ±0.015
230 ±0.025
Micro analítica 2.1 ±0.00025
5.1 ±0.0010
21 ±0.0020
Los sólidos ya pesados deben ser transferidos al vidrio adecuado - matraz
aforado o probeta - y ser disueltos en un agitador magnético y/o
ultrasonidos sin llegar a enrasar. Se deben evitar calentamientos pues
pueden afectar la composición del disolvente.
Elección del Recipiente para el Pesaje
• Es muy importante que el recipiente usado para pesar sea el
apropiado a la muestra o material que están siendo pesados, es decir,
sería inapropiado pesar 0.01g en un recipiente de 1Litro.
• Utilizar siempre vidrios limpios y secos – esto es especialmente
importante para los vidrios de reloj, donde las contaminaciones del
material y la adsorción de la muestra por el vidrio pueden causar
errores.
Fuentes de Deriva
La precisión en la medida del peso con la balanza analítica puede sufrir
deriva. Las fuentes de deriva incluyen:
• Avería en el plato de la balanza analítica o en su sensor.
• Cambios en los sensores mecánicos o de presión de la balanza debidos
a averías y cambios en la temperatura.
• Exposición del mecanismo de la balanza a un exceso de carga estática
• Cambios en el calibrado interno del aparato.
• Cambios en la presión y temperatura ambiente.

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Debido a esta inherente susceptibilidad a la deriva es necesario calibrar
regularmente las balanzas.
Efectos Estáticos
El mecanismo por el que la balanza percibe el peso mediante sensores de
presión y sus sistemas electrónicos internos, pueden alterarse
sustancialmente por la electricidad estática de los envases o recipientes, así
como la carga de las muestras o las sustancias que están siendo pesadas. Los
contenedores de vidrio ó plástico son particularmente susceptibles a este
efecto ya que la densidad de la carga no se elimina fácilmente debido a su
baja conductividad. El látex y los guantes de plástico son también conocidos
transmisores de carga electrostática al plato de las balanzas.
Las balanzas afectadas por electricidad estática presentan generalmente
problemas de lecturas muy inestables o derivas continuas.
Hay varias recomendaciones a seguir para contrarrestar este efecto:
• Se pueden adquirir balanzas con plato recubierto anti-estáticamente.
• Se puede poner un vaso de agua en el compartimento de la balanza
para aumentar la humedad ambiente (Nota: Este método NO es
recomendable si el aumento de la humedad afecta a la muestra por
ser higroscópica (ver sección siguiente).
• Se puede adquirir una “pistola ionizante” y colocarla cerca del
compartimento de la balanza a fin de neutralizar mediante iones con
carga opuesta.
• Manipular los envases con pinzas o tenazas – usar solo los guantes de
látex cuando se manipulen muestras tóxicas.
Muestras Higroscópicas
• Algunas muestras son particularmente susceptibles atraer o absorber
humedad. El acetato de amonio, un tampón muy usado en LC-MS, es
extremadamente higroscópico.
• Un síntoma de muestras higroscópicas es un constante aumento del
peso debido a la absorción de humedad.
• Cualquier muestra que se sepa que es higroscópica puede pesarse en
una balanza usando un vaso de precipitados con un tamiz molecular
para reducir la humedad presente o procurando minimizar su
exposición ambiental.
• Las huellas dactilares en los envases de las muestras pueden
favorecer la adsorción de la humedad. Por ello es importante que los
envases o los recipientes no se manipulen directamente, sino que se
usen espátulas o pinzas para manipularlos.
• Si las muestras o los recipientes requieren enfriamiento previo para
ser pesados, estos deben ser enfriados en un desecador para evitar la
absorción de humedad.

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Muestras Volátiles
• Esta situación es la opuesta a tener muestras higroscópicas. Las
muestras volátiles tienden a perder peso, obteniéndose una
disminución constante en la lectura del peso. Muchos tampones y
aditivos usados en LC-MS son volátiles, dicha volatilidad ayuda a
prevenir contaminación o suciedad en la fuente de iones.
• Es posible pesar muestras en recipientes cerrados con tapa, si esta se
manipula con precaución. Cualquier líquido que condense en la tapa
puede crear alteraciones en pesadas sucesivas. Se deben usar siempre
recipientes tapados cuando se pesen líquidos.
• Para todos los pesajes es mejor minimizar el área superficial de la
muestra que está siendo pesada. Este enfoque minimiza la exposición
atmosférica de la muestra, reduciendo la volatilización potencial.

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Efectos de la Temperatura
• Como regla general, la muestra a pesar debe acondicionarse a la
temperatura de la balanza. Es el único modo de evitar errores por
ascensión del aire y desviaciones causadas por corrientes en la
superficie de la muestra. Dado que estos efectos aumentan
proporcionalmente al volumen y a la superficie de la muestra, se
debe asegurar que el tamaño del recipiente seleccionado esté en
proporción adecuada al tamaño de la muestra a pesar, ello ayudará a
minimizar dicho efecto.
En todos los casos las medidas fundamentales son:
• Obtener tanta información como sea posible de la muestra a pesar.
• Evitar potenciales efectos electrostáticos mencionados
anteriormente.
• Equilibrar la temperatura del envase y la muestra con el ambiente de
la balanza.
• Minimizar el área superficial de la muestra expuesta a la atmósfera.
El pH Metro y el Ajuste de pH
El pH es uno de los parámetros más comúnmente determinados en
soluciones tanto acuosas como no acuosas. Variaciones en el pH pueden
provocar cambios significativos en la velocidad de reacción así como
cambios en la solubilidad y biodisponibilidad de muchos principios activos
con fines farmacéuticos. Como se ha descrito anteriormente, las
características en la retención de muchas especies de analitos pueden
cambiar por variaciones en el pH de la fase móvil y por tanto contribuir a
formas de picos anormales, es decir, desdoblamientos y colas.
El pH es un parámetro que indica la acidez o alcalinidad de una solución, se
mide en una escala de 0 a 14, donde un valor de pH igual a 0 es muy “ácido”
y un valor de 14 es muy “básico”. El pH mide la concentración, o más
exactamente la actividad del Ion oxonio – H3O+
, aunque en la solución el Ion
oxonio está representado como un protón o Ion hidrógeno, H+
.
Generalmente se ajusta primero el pH del disolvente de la fase móvil antes
de añadir el volumen de disolvente orgánico necesario. Este enfoque
sistemático asegura exactitud en la concentración del Ion oxonio. Para
asegurar homogeneidad mientras se adiciona el reactivo en el ajuste del pH,
la solución puede ser agitada en una placa magnética, aunque se debe
evitar calentamientos que puedan afectar la composición del disolvente.
El reactivo para ajustar el pH puede añadirse gota a gota usando material
plástico, vidrio o pipetas dispensadoras automáticas.
El empleo de vidrio propicia la introducción de iones metálicos. Los iones
Al3+
y Fe2+
inducirán actividad en los grupos silanol residuales de la columna
analítica. La consecuencia de esto es la observación de colas en los picos

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cromatográficos, especialmente para aquellas especies de analitos que
tienen grupos funcionales básicos. Los iones aducto Na+
y K+
pueden
predominar en LC-MS, llegando a ser los picos base y más abundantes incluso
que el ion protonado pseudo-molecular. Esto puede influir de manera
considerable en la cuantificación.
Determinación del pH
El sistema de medición del pH consta de tres componentes:
• Un electrodo de pH.
• Un electrodo de referencia.
• Un pH metro de alta impedancia.
En la mayoría de los sistemas para medir el pH los electrodos de pH y de
referencia están montados en el mismo dispositivo, conocido como
“electrodo combinado”.
Electrodo de Referencia
El electrodo de referencia consiste en un cable de plata recubierto en
cloruro de plata, una solución de relleno y una junta permeable
(generalmente fritas de cerámica o membranas), a través del cual la
solución de relleno migra lentamente dentro de la muestra que está siendo
medida. En algunas partes de la frita apenas hay flujo neto de la solución de
relleno, dicha región se llama junta de difusión.
Electrodo de pH
El electrodo de pH está hecho de un vidrio de composición especial, que es
sensible a la concentración de iones hidrógeno. Dicho vidrio está compuesto
generalmente por un metal alcalino que sostiene una reacción de
intercambio de iones con los Iones hidrógeno de la solución test para
generar una diferencia de potencial.
Electrodos de pH Combinados
Los electrodos combinados contienen los dos electrodos descritos
anteriormente en un único cuerpo de vidrio. El potencial generado en la
zona de unión se debe a los iones libres de hidrógeno presentes en la
muestra. El potencial de referencia es generado por un elemento interno
de Ag/AgCl que está en contacto con la solución relleno de referencia. El
electrodo de medida emite un voltaje variable y el electrodo de referencia
un voltaje constante para el medidor.
El sistema funciona de manera análoga a la medida del voltaje de una
batería por un voltímetro. El cable interior del electrodo de pH tiene la
misma finalidad que el primer cable que va desde la batería hasta el

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voltímetro. El electrodo de referencia equivale al segundo cable que
completa el circuito y permite medir el voltaje. La solución de relleno fluye
del electrodo de referencia hasta la solución test, completándose el
“circuito” con el electrodo de pH.
Para que el electrodo de pH combinado trabaje correctamente es
importante que el bulbo detector se guarde limpio y sin restos de tampones,
de lo contrario los iones libres que fluyan a través del bulbo serán inhibidos
y por tanto las medidas de pH serán incorrectas. Debe asegurarse que la
solución relleno de KCl está en el nivel correcto y que el agujero del relleno
no está tapado mientras se mide el pH.
El pH-metro
El electrodo de pH tiene una resistencia interna muy alta, haciendo muy
difícil la medida de los pocos milivoltios de salida que provocan los cambios
de pH. Un pH-metro es básicamente un amplificador de alta impedancia que
mide con precisión los diminutos cambios de voltaje del electrodo,
mostrando el resultado directamente en unidades de pH o en milivoltios.
Agujero de Relleno: Solución
relleno de KCl
Electrodo de pH
Combinado ROSS®
Electrodo de referencia Ag/AgCl
Unión de frita cerámica referencia
Bulbo detector de pH

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Soluciones Tampón y Características del Electrodo de pH
Soluciones Tampón
Los tampones son soluciones que mantienen un valor constante de pH con
capacidad de resistir a los cambios de éste. Se utilizan para calibrar el
electrodo de pH y el pH-metro. Se emplean para compensar las pequeñas
diferencias que se observan entre la señal de producida por diferentes
electrodos, así como los cambios producidos en los electrodos con el paso
del tiempo.
En consecuencia, el sistema debe ser calibrado periódicamente. Los
tampones disponen de un amplio rango de valores del pH, viniendo estos en
forma líquida premezclada o como polvo seco encapsulado según sea
necesaria su preparación. Generalmente una solución tampón específica
calibrará con una tolerancia menor a ±0.02 unidades de pH medido a 20ºC.
La mayoría de los pH-metros requieren calibraciones a varios valores
específicos de pH. Generalmente se realiza una calibración cerca del punto
isopotencial – la señal emitida por un electrodo a pH 7 y a 25ºC son 0mV – y
típicamente se hace una segunda medida a pH 4 o a pH 10. Es bueno elegir
un tampón con un pH tan próximo como sea posible al valor del pH de la
muestra a determinar, pues se asegura la mayor exactitud posible.

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Adición del Disolvente
Cuando se prepare una fase móvil mezcla de disolventes acuosos y
orgánicos, el procedimiento correcto será adicionar el volumen de solvente
orgánico necesario al volumen de solvente acuoso necesario.
Si el volumen necesario de la fase móvil se prepara simplemente por adición
de la fase acuosa con el solvente orgánico o viceversa, entonces los errores
en la composición pueden deberse a contracción o expansión del volumen de
la mezcla respecto a los volúmenes individuales de los disolventes. Este
efecto se traducirá en cambios crecientes en los tiempos de retención de la
muestra y en los factores de capacidad.
La tabla siguiente muestra el efecto anterior sobre las características de
retención del tolueno. Muestra que hay una variación significativa en el
tiempo de retención del tolueno entre una fase móvil 60:40 MeOH:H2O
preparada por adición de cada disolvente según haya:
• Suficiente MeOH para 40mL de H2O
o
• Suficiente H2O para 60mL de MeOH
en comparación al procedimiento correcto de adición de 60mL MeOH a 40mL
H2O.
En el procedimiento correcto se obtiene una fase móvil de composición y
fuerza de elución intermedia, prueba de ello es el cambio en el tiempo de
retención y el factor de capacidad del tolueno al preparar la fase móvil de
este modo y los otros dos anteriores.
Resultado según la Técnica de Preparación de la Fase Móvil sobre la
Retención del Tolueno
Fracción Volumétrica del
MeOH
(%)
Tiempo de Retención
(min)
Factor de Capacidad
k'
60 5.40 2.72
62* 4.82 2.32
58** 5.87 3.05
* 40mL de H2O llevados hasta 100mL con 60mL MeOH, Calculado el k'
** 60mL de MeOH llevados hasta 100mL con 40mL H2O, Calculado el k'

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3.3 Desgasificación de la Fase Móvil
La eliminación de gases, o desgasificación, es un fenómeno al que se
someten todos los disolventes tanto orgánicos como acuosos usados en
cromatografía. Cuando el HPLC está sometido a altas presiones la
solubilidad de los gases atmosféricos O2 y N2 aumenta. Cuando los
disolventes experimentan una brusca caída de presión, generalmente
durante la mezcla en una válvula de proporción cuaternaria, un mezclador
estático de un sistema binario, o al entrar en la celda del detector, los gases
disueltos se desprenden de la solución formando burbujas.
La generación de dichas burbujas puede ser perjudicial tanto para la
columna como para el proceso cromatográfico.
Los sistemas de bombeo más modernos están centrados en el diseño de
doble pistón. Las burbujas de aire pueden retenerse en las válvulas
antirretorno o en las cámaras de los pistones del cabezal de la bomba. Se
observará una línea de base sinusoidal como resultado de aire retenido en el
cabezal de la bomba:
Línea de Base Sinusoidal generada por aire retenido
en el cabezal de la bomba.
En estos casos es importante eliminar las burbujas de aire antes de que
estas pasen a la columna. La bomba debe purgarse inmediatamente y el
flujo incrementarse a 5ml/min para eliminar el aire del cabezal de la
bomba.

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Una burbuja que entra en la columna forzará su recorrido a través del lecho
de relleno de la fase estacionaria, provocando la formación de “canales”.
Dicha canalización disminuye rápidamente el rendimiento de la columna ya
que los analitos son capaces de atravesar la columna por dichos canales, lo
que se traduce en un menor tiempo de retención sobre la fase estacionaria,
saturándose rápidamente dichos huecos por moléculas de analito.
Tal efecto conduce generalmente a la formación de frentes en la forma de
los picos cromatográficos.
Frentes y picos anchos observados en una columna dañada

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El paso de burbujas de gas al HPLC afectará a la línea de base
cromatográfica generando ruido que se traduce en la presencia de picos
fantasma.
Además, si una burbuja de gas queda atrapada en la celda del detector, se
generará ruido de forma aleatoria en forma de picos en el registro de la
línea de base. El efecto neto será una disminución en la relación señal-ruido
(S/N), con su correspondiente aumento en los límites de detección (LoD) y
los límites de cuantificación (LoQ) del método.
En cuanto la fase móvil entra en la celda de flujo del detector se produce
una caída en la presión. Como resultado de esta caída en la presión, una
pequeña cantidad del aire retenido en la fase móvil puede liberarse en la
celda del detector. Dicha liberación de gas se traduce en un incremento del
ruido en la línea de base:
Incremento del ruido en la línea de base (figura superior) y “Spikes”
(figura inferior) causados por burbujas de aire retenido y liberado en la
celda del detector

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Es una práctica muy común ajustar la contrapresión mediante reguladores a
la salida de la celda del detector a fin de mantener valores altos en la
presión que minimicen la desgasificación hasta que el flujo de la fase móvil
está suficientemente a distancia para prevenir el atrapamiento de las
burbujas de aire formadas. Si el regulador de la presión no es un accesorio
integrado del detector, suele ser suficiente la conexión de un tubo PEEK de
50cm de longitud y 0.17mm de diámetro interno antes del tubo de salida de
desechos.
Además, una pobre desgasificación de la fase móvil se traducirá en un mal
cebado de la bomba y una pobre reproducibilidad de gradientes, lo que
llevará a variaciones en los tiempos de retención del analito.

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Métodos de Desgasificación
Hay cuatro modos aceptados para desgasificar la fase móvil:
• Borboteo por Helio
• Desgasificación por Vacío
• Ultrasonidos
• Reflujo
El filtrado de la fase móvil a vacío es el procedimiento que se emplea
generalmente cuando se elimina materia particulada de una solución antes
de su uso, dicho proceso desgasifica la fase móvil de manera indirecta.
Aunque es una medida necesaria, especialmente cuando se usan soluciones
tampón o fases móviles que contienen reactivos de par de iónico, se debe
tener cuidado en evitar pérdidas selectivas de cualquier solvente orgánico
que pueda conducir a variaciones en el tiempo de retención del analito.
Borboteo por Helio
El Borboteo por Helio elimina aproximadamente el 80% de los gases
disueltos. El mecanismo de borboteo puede construirse simplemente
conectando a un cilindro de helio un tubo de PTFE con una frita al final.
Hay que sumergir la frita dentro de la fase móvil y ajustar el regulador para
liberar una suave corriente de burbujas.
En general, un litro de fase móvil se desgasificará por completo con un litro
de helio. Una excesiva desgasificación con helio puede provocar la pérdida
de la mayoría de los componentes volátiles de la fase móvil, generando
variaciones en los tiempos de retención.
La principal finalidad del borboteo por helio es disolver el N2 y el O2 que se
extraen de la fase móvil gracias a su elevada solubilidad en helio. El helio
tiene una solubilidad muy baja en la mayoría de las fases lo que permite la
disolución de N2 y O2 en el gas borboteado, dando como resultado una
solución relativamente libre de gases.
Cuando se está usando el borboteo por helio hay que ser consciente de los
potenciales cambios que pueden tener lugar en la composición de la fase
móvil debido a la volatilidad selectiva de cualquier aditivo de la fase móvil,
p.ej., ácido Trifluoroacético (TFA).
Se debe evitar un borboteo por helio “vigoroso” ya que puede provocar
perturbaciones excesivas en la superficie de la fase móvil, dando como
resultado la introducción de más aire que el que es eliminado.

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Desgasificación por Vacío.
La desgasificación por vacío se puede llevar a cabo de tres maneras:
• En discontinuo
• Incidental
• Desgasificación en línea
La desgasificación en discontinuo tiene lugar en un matraz a vacío que
contendrá la fase móvil a la que se someterá un proceso continuo de vacío,
bien generado por aspiración con agua, o simplemente con una bomba de
vacío.
La desgasificación incidental se lleva a cabo haciendo pasar la fase móvil a
través de un filtro de membrana. Puesto que el líquido se microdispersa
mientras está expuesto a un ligero proceso de vacío, se produce la
desgasificación. La desgasificación incidental es más bien un tratamiento
secundario cuando se necesite eliminar materia particulada de la fase móvil
por vacío antes de su uso.

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La desgasificación en línea es el método más empleado actualmente. La
fase móvil está encerrada en un tubo permeable a los gases mientras
atraviesa la unidad de desgasificación. El gradiente de vacío generado hace
expulsar los gases retenidos en la fase móvil, atravesando éstos la
membrana del tubo.
Ultrasonidos
Este es el menos eficiente de todos los mecanismos de desgasificación ya
que solo elimina aproximadamente el 30% de los gases disueltos. La fase
móvil se desgasifica por sonicación de forma que los gases disueltos se
aglomeran formando burbujas con el suficiente tamaño para flotar hasta la
superficie del líquido. Dicha técnica es limitada, pues se lleva a cabo fuera
del sistema y el calor generado en el proceso de sonicación puede provocar
la pérdida de los compuestos más volátiles de la fase móvil por evaporación
selectiva. Sus limitaciones se compensan generalmente por sus ventajas en
simplicidad y bajo coste.
En consecuencia el ultrasonidos no es muy recomendable y si es usado debe
serlo durante el mínimo tiempo posible y preferiblemente con un baño de
agua que controle la temperatura.
La figura anterior muestra la eficacia relativa de los diferentes métodos
de desgasificación, tomando como criterio el porcentaje de oxígeno
eliminado de un volumen de metanol determinado en función del
tiempo.

- 40 -
3.4 Filtración de la Fase Móvil
La filtración elimina el polvo además de otras partículas y contaminantes,
siendo por tanto una etapa fundamental en la preparación de cualquier fase
móvil tampón. Las partículas pueden alojarse en el sistema de aporte de
disolvente, provocando desgaste en los componentes del cabezal de la
bomba, generando fugas, flujos irregulares y cambios en la composición de
la fase móvil. Las partículas pueden también alojarse en la válvula de
inyección generando fugas cruzadas entre los puertos de la válvula que dan
como resultado áreas y/o alturas de picos irreproducibles y causan una
disminución de la vida útil de ésta.
La filtración de la fase móvil también ayuda a prevenir la obstrucción de la
línea, o de la guarda columna si la hubiere, evitando los cambios continuos
de éstas y reduciendo pérdidas de tiempo y costes. El filtro en línea debe
instalarse después del sistema de inyección pero antes de la columna
analítica. De este modo cualquier partícula generada por el desgaste de los
componentes del asiento del rotor procedentes de la válvula de
conmutación del inyector será retenida de modo eficaz.
Sin filtración de la fase móvil y sin añadir un sistema protector de filtro en
línea, las partículas que entran en el HPLC pueden acumularse en cabeza de
columna traduciéndose en una amplia variedad de problemas
cromatográficos.
Un bloqueo parcial en la entrada de la columna se traduce en un aumento
de la presión y por tanto en deterioro de la forma de los picos
cromatográficos, efecto que queda patente en desdoblamientos, frentes o
colas en los picos. La figura siguiente muestra el efecto de una frita
parcialmente bloqueada a la introducción de muestra en la columna. Sin
bloqueo, la muestra sale de los tubos de conexión, distribuyéndose
uniformemente dentro de la frita de entrada y después en cabeza de
columna.
Cuando hay un bloqueo parcial se impide la distribución homogénea de la
muestra en cabeza de columna, obteniéndose anomalías en las formas de
pico.

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En ocasiones también puede haber cambios en los tiempos de retención del
analito (TR), el factor de capacidad del analito (k’), disminución en la
selectividad de la separación, presencia de picos falsos o adsorción
irreversible del analito en la columna con la consecuente reducción de la
vida útil de esta.
Usar filtros mezcla de éster celulosa − acetato y nitrato de celulosa −
(0.22µm de tamaño de poro) para disolventes acuosos tamponados, p.ej.
Whatman Membra-Fil®
.
Usar Teflon (Polytetrafluoroetileno − PTFE) (0.22µm de tamaño de poro)
para solventes orgánicos. Es frecuente que la membrana de PTFE esté
laminada sobre una trama de polipropileno como soporte para aumentar su
durabilidad.
Es muy recomendable reservar material de vidrio específico que solo se
utilice para el proceso de filtración de la fase móvil y así prevenir
contaminación imprevista.
Un conjunto de vidrio debe dejarse solo para solventes acuosos tamponados
y otro distinto para solventes orgánicos.
Cualquier vidrio debe ser inspeccionado ante la posible presencia de
material particulado para prevenir contaminación accidental de las fases
móviles pre-filtradas

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Es una buena práctica el filtrar cualquier disolvente que no sea de grado
para HPLC antes de mezclarlo y emplearlo en la preparación de fase móvil.
Cuando se filtran mezclas de disolventes, las diferencias entre las presiones
parciales de cada solvente pueden ser causa de cambios en la composición.
En consecuencia, el usuario debe ser consciente de los cambios en la
concentración de los solventes - y ser consecuente con los PNT
(Procedimientos Normalizados de Trabajo).
Generalmente no es aconsejable filtrar los disolventes de calidad HPLC
suministrados por el fabricante. Estos disolventes se suministran ya
eficazmente filtrados a 0.22µm y posteriormente embotellados bajo
condiciones de “sala-limpia”. En consecuencia, el riesgo de introducción de
materia particulada o contaminantes aumenta considerablemente cuando se
realiza de nuevo la filtración en el laboratorio.
Los filtros pueden estar revestidos o contener materiales como tensioactivos
o glicerina, que podrían arrastrarse como contaminación a la fase móvil. Por
tanto, es una buena práctica pre-lavar los filtros y desechar los primeros
lavados.

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Filtros de Disolventes en línea
El uso de disolventes de alta calidad para HPLC suele eliminar la necesidad
de filtración manual. Sin embargo, la mayoría de fabricantes recomiendan el
uso de filtros para disolventes en línea:
Generalmente los filtros están hechos de vidrio sinterizado o acero
inoxidable, que deben ser limpiados o reemplazados mensualmente. El
bloqueo de uno de los filtros causará pequeños cambios en la composición
de la fase móvil, provocando fluctuaciones en los tiempos de retención:
Fluctuaciones en los tiempos de retención debido
al bloqueo de un filtro en línea.
El mejor método de limpieza para los filtros de acero inoxidable es por
ultrasonidos en isopropanol (IPA). Los filtros de vidrio sinterizado nunca
deben ser lavados por ultrasonidos, siendo el mejor método la inmersión en
IPA durante 24 horas.

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Rango del pH
Rango del pH del equipo 2.3 – 9.5
Rango del pH extendido 2.3 – 12.5
Corrosivos para el acero inoxidable
Ácido clorhídrico
Ácidos inorgánicos y ácidos fuertes
Haluros Básicos (Cloruro de Sodio, Ioduro de Litio)
Tetracloruro de Carbono con 2-propanol o THF
Agentes acomplejantes (EDTA, ácido cítrico, ácido acético)
Ataque al cuarzo y vespel
Soluciones alcalinas, pH>11
Si se usan los compuestos anteriores será necesario un mantenimiento más frecuente del HPLC.
Cuando se usen, al finalizar el análisis la bomba u otros componentes del HPLC deben ser purgados a
fondo.
Crecimiento microbiológico
Los disolventes contaminados o el crecimiento microbiano en las botellas de
disolvente, pueden taponar los filtros y perjudicar al funcionamiento de la
bomba. El crecimiento microbiano también puede bloquear el
automuestreador, provocando variaciones en los volúmenes inyectados o
recubriendo las ventanas de la celda de flujo provocando así líneas de base
erráticas y reduciendo la sensibilidad.
Una línea de base errática causada por crecimiento
microbiano en la fase móvil
Es recomendable tomar las siguientes precauciones:
• Si es posible usar botellas estériles para los disolventes.
• Reemplazar disolventes acuosos y tamponados cada dos días.
• Evitar la exposición directa al sol o usar botellas de vidrio ámbar.
Otras Consideraciones para la Fase Móvil:

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Otra cuestión relativa al uso de filtros es la filtración de las muestras antes
de inyectarlas. Aunque filtrar la muestra permite eliminar partículas, existe
la posibilidad de perder analitos por ser absorbidos irreversiblemente en la
membrana de los filtros. El efecto inmediato sería la obtención de áreas y/o
alturas de picos irreproducibles.
Por tanto, es aconsejable realizar de una serie de pruebas previas que
controlen la recuperación de los analitos a los niveles de concentración
esperados cuantificando a partir de soluciones “fortificadas”, a fin de
determinar si el filtro es compatible y no retiene los compuestos en
cuestión. Dicho proceso se ilustra a continuación:

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4 Sistemas de bombeo
El objetivo de esta sección es:
• Describir la función de la bomba
• Describir los principios de funcionamiento del sistema de bombeo
• Describir los dos procesos por los cuales se forma el gradiente de
fase móvil
• Enumerar y describirlas incidencias y los procesos de mantenimiento
más comunes
4.1 Funciones de la Bomba
La misión de la bomba es enviar continuamente un flujo fase móvil libre de
pulsos al inyector, columna y detector, independientemente de la
contrapresión del sistema.
Cada sistema de bombeo debe cumplir los siguientes requisitos:
• Todas las partes de la bomba en contacto con fluidos han de ser de
materiales inertes
• El rango normal de presiones en HPLC es de 100 – 6000 psi (14.2 psi =
1 Bar) dependiendo del equipo utilizado. Esto correspondería a unos
flujos de rango 0.5 - 10mL/min, dependiendo de la geometría y
relleno de la columna, etc. La mayoría de las bombas están
preparadas para alta presión, pero se utiliza un sistema limitador de
presión (“Cut-off”) para evitar daños en otros componentes del
sistema como la celda de flujo del detector.
• Algunas bombas de tipo flujo constante pueden producir un perfil de
presión pulsado. Si el detector usado es sensible al flujo se puede
producir ruido u ondulaciones de la línea de base. Tales variaciones
de flujo son normalmente “amortiguadas” usando un volumen muerto
comprimible situado entre la bomba y el inyector (“Damper”). El
fabricante normalmente incorpora el “dámper” en el propio módulo
de bombeo.
• El volumen interno de la bomba debería ser lo más pequeño posible.
Esto garantiza que los cambios en la composición de la fase móvil
puedan ser rápidos durante el gradiente de elución. Se evita de esta
forma que los tiempos de re-equilibrio resulten el paso limitante en
cualquier análisis.
• Los sellos de las bombas, arandelas, juntas y ocasionalmente los
pistones del cabezal de la bomba necesitan ser reemplazados, por lo
que deben ser de fácil acceso. Los asientos de las válvulas
antirretorno tienen tendencia a desgastarse y necesitarán sustituirse
si se bloquean o quedan pegados. La forma más efectiva de prolongar
el tiempo entre mantenimientos es filtrar la fase móvil y usar unos
procedimientos correctos de puesta en marcha y apagado

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4.2 Bomba Recíproca de Pistón Simple
El mayor reto de cualquier fabricante de bombas de HPLC es proporcionar
un flujo de fase móvil libre de pulsaciones. La simplicidad del cabezal de la
bomba de pistón simple es ideal para separaciones isocráticas, que
requieren un flujo fijo de un único solvente durante todo el análisis. La
incorporación de un amortiguador de pulsos (“damper”) de bajo volumen
permite obtener un flujo libre de pulsaciones.
Además de minimizar las pulsaciones de flujo gracias a la incorporación de
un amortiguador de pulsos, los equipos de HPLC modernos pueden variar la
velocidad del pistón del cabezal de la bomba, de forma que su velocidad sea
menor en la etapa de dispensación que en la etapa de llenado del pistón,
minimizando de esta forma los efectos de la pulsación.
Principio de Operación
Las válvulas antirretorno (“Check-Valves”) ó válvulas de “Bola y Asiento”
están diseñadas para permitir únicamente un flujo unidireccional de fase
móvil. La “bola”, hecha de un material químicamente inerte como el rubí,
se asienta en un asiento de zafiro sintético.
En función de la posición del pistón en un determinado momento la bola se
encuentra situada directamente contra el asiento, deteniendo de forma
efectiva el flujo de la fase estacionaria, o suspendida en el cuerpo principal
de la válvula, donde ofrece poca resistencia al flujo de la fase móvil,
permitiendo su paso al sistema de HPLC.

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Las imágenes ilustran el funcionamiento de las válvulas de entrada y
salida durante los periodos de llenado y dispensación de una bomba
recíproca de pistón simple.
Aunque las válvulas antirretorno proporcionan miles de horas de
funcionamiento ininterrumpido, son componentes consumibles, y como
tales requerirán de limpieza o sustitución después de un uso prolongado. Las
fases móviles sin filtrar, corrosivas o altamente tamponadas reducirán
considerablemente el tiempo de vida de las válvulas antirretorno.

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4.3 La Bomba Recíproca de Doble Pistón
Comparándola con la bomba de pistón simple, el diseño de la bomba
recíproca de doble pistón ofrece flujos más reproducibles con la
correspondiente reducción de las fluctuaciones de presión. Sin embargo, la
mayor complejidad del diseño de la bomba de doble pistón aumenta
también sus requerimientos de mantenimiento, puesto que el pistón
adicional y los sellos del mismo están sometidos también a desgaste y
requieren sustitución.
Principio de Operación
Este diseño de la bomba es muy eficiente, porque mientras un pistón se está
llenando con fase móvil, el segundo pistón está entregando fase móvil al
sistema de HPLC. Este desfase de 180º en el funcionamiento del pistón
produce un flujo de fase móvil virtualmente libre de picos, y permite gran
reproducibilidad en gradientes de fase móvil. Este diseño se utiliza a
menudo junto con un amortiguador de pulsos, para obtener la menor
fluctuación de presión posible durante la dispensación de la fase móvil.
La imagen ilustra el principio de funcionamiento de la bomba recíproca
de doble pistón.

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4.4 La Bomba Binaria de Gradiente
Las bombas isocráticas sirven para atender las necesidades básicas del
cromatografista moderno. Sin embargo, cuando se requiere un gradiente de
fase móvil, durante el cual se introduce gradualmente en la fase móvil un
solvente más fuerte para eluir de la columna los analitos fuertemente
retenidos, se requiere un diseño de bomba más sofisticado.
Hay dos formas básicas de conseguir un gradiente en la fase móvil. La
primera es emplear dos bombas reciprocas trabajando al unísono –esto se
denomina bomba binaria de gradiente. Las bombas binarias consisten en dos
“canales” de solvente, donde cada canal está conectado a una bomba
recíproca idéntica y el flujo de disolvente procedente de cada bomba se
combina en una cámara de mezcla de bajo volumen, un amortiguador de
pulsos, y finalmente una segunda cámara de mezcla.
Los flujos individuales de bombeo –o ratio volumen/flujo- de cada una de
estas bombas recíprocas están controlados electrónicamente, permitiendo
mezclar proporcionalmente el solvente de los dos canales. Por lo tanto, si se
necesita un gradiente con la composición de 50% del solvente A y 50% del
solvente B, las bombas trabajarán a flujos iguales, y si el flujo total deseado
es de 1mL/min, cada bomba entregará el solvente a 0.5mL/min.
Puesto que la mezcla de solventes se produce después de las bombas, se
denomina “mezcla a alta presión”.
La imagen ilustra el principio de operación de la bomba de gradientes de
doble pistón recíproco

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4.5 La Bomba Cuaternaria de Gradiente
Una solución alternativa para la formación de un gradiente de fase móvil es
usar solamente una bomba de doble pistón conectada a una válvula
proporcional de cuatro canales controlada por el software. La válvula
proporcional se encuentra entre el desgasificador y la bomba, y permite
introducir volúmenes exactos de cada solvente en una cámara de mezcla,
suministrando después la mezcla de solventes formada al sistema de HPLC.
Cada puerto de la válvula solenoide permanece abierto sólo una fracción de
lo que se denomina “ciclo de trabajo” de la bomba. El gradiente de elución
se consigue alternando la fracción de este ciclo en que cada solenoide
permanece abierto, permitiendo que la fuerza de elución efectiva de la fase
móvil cambie en función del tiempo. Por lo tanto, si el ciclo de la bomba es
de un segundo y la composición del gradiente deseada es del 25% de
solvente A, 25% del solvente B, 25% del solvente C y 25% del solvente D,
cada solenoide permanecerá abierto un cuarto de segundo, permitiendo a
las alícuotas de cada uno de los cuatro solventes mezclarse en igual
proporción.
Las características individuales de viscosidad y compresibilidad de cada
solvente afectarán al funcionamiento de la válvula de proporción, y pueden
ajustarse convenientemente desde el software del instrumento.
En comparación con la bomba de gradiente binario, donde la mezcla del
solvente ocurre después de la bomba y se denomina “mezcla a alta
presión”, la bomba de gradiente cuaternario mezcla el solvente antes de la
bomba y se denomina “mezcla a baja presión”. Esta mezcla no es tan
efectiva como la producida a alta presión, y muestra:
• Menor reproducibilidad del gradiente
Cuando se trabaja a flujos menores de 1.0mL/min p.ej., las bombas
de gradiente binario ofrecen mayor precisión y reproducibilidad que
las bombas cuaternarias. Además, si existe una diferencia apreciable
en la proporción relativa de los solventes mezclados, por ejemplo del
98% de solvente A y 2% del solvente B, de nuevo se obtendrá mayor
reproducibilidad con un sistema de mezcla a alta presión que con uno
que emplee válvula de mezcla a baja presión.
• Efectos de Cavitación
Durante la mezcla de disolventes en la válvula proporcional pueden
generarse burbujas. Esto es debido a que los gases disueltos tienen
menor solubilidad en la mezcla final que en los solventes iniciales.
• Líneas de base ruidosas y erráticas
Durante la mezcla a baja presión podría producirse inmiscibilidad
entre los disolventes y formación de burbujas. Estos efectos
producen caídas de presión en la mezcla, variación de los flujos, y
contribuyen a líneas de base erráticas y ruidosas.

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La imagen muestra el funcionamiento de la válvula proporcional en una
bomba recíproca de doble pistón
4.6 Formación de Gradientes y Tiempo Muerto
(“Dwell-Time”)
El volumen interno de una bomba de HPLC debería ser idealmente lo más
pequeño posible, esto permite una rápida formación del gradiente y además
una transferencia efectiva de los métodos con gradiente entre sistemas
intra- e inter-laboratorio. El tiempo que se necesita entre la formación del
gradiente de solvente hasta que éste llega al comienzo de la columna
analítica se denomina “tiempo muerto del sistema” (tD).
El tiempo muerto del sistema se calcula determinando primero el “volumen
muerto del sistema (VD), que es característico del volumen extra-columna
mostrado por la bomba y la longitud total de los conectores entre el HPLC, y
se determina como sigue:

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Cálculo del Volumen Muerto del Gradiente
1. Quitar la columna y conectar el inyector al detector mediante una
pequeña unión de 0.010-in. d.i. (o menor) – esto se suele denominar
“capilar de restricción”. Un regulador de contrapresión después del
detector ayudará a mantener la suficiente presión en el sistema para
un buen funcionamiento de la válvula antirretorno (“Check-Valve”).
2. Como solvente A usar agua calidad HPLC, y como solvente B añadir
alrededor de 0.1% de acetona a agua HPLC (también puede usarse
metanol o acetonitrilo en lugar de agua).
3. Ajustar la longitud de onda a la máxima absorbancia del compuesto
añadido (265nm para la acetona).
4. Realizar un cromatograma a 100% de A y otro a 100% de B, ajustando la
escala de absorbancia en los datos del sistema, para que ambas señales
del solvente muestren una señal dentro de la escala
5. Programar un gradiente lineal de 0-100% B en 10min a 2mL/min. Las
condiciones exactas no son críticas, simplemente asegúrese que el
volumen total del gradiente es al menos de 20mL. Mantenga una etapa
isocrática al 100% B durante al menos 5min al final.
El cromatograma resultante debería aparecer aproximadamente como
en la figura superior. La etapa isocrática al principio de la gráfica
representa el volumen muerto del sistema (VD), seguido por la etapa
de gradiente, y finalmente la etapa isocrática mantenida hasta el final.
La curvatura del cromatograma debería ser mínima al final del
gradiente, y debería ser lineal excepto al principio y al final.

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6. Determinar en primer lugar el tiempo de retención del sistema
situando el tiempo a mitad de gradiente (t1/2) – la mitad de la
distancia vertical entre el inicio y el final de los segmentos isocráticos;
9.2min para el cromatograma descrito.
Restar a continuación la mitad del tiempo de gradiente; 10min/2 =
5min para este ejemplo de (t1/2)
El resultado es el tiempo muerto del sistema (tD); 9.2min – 5min =
4.2min.
Finalmente transformar tD en volúmen muerto (VD) multiplicando por
el flujo empleado en el método p.ej. 4.2min x 2mL/min = 8.4mL.
Es esencial que los tiempos de equilibrio de la columna y del sistema se
controlen durante el re-equilibrio del gradiente. Esto es, en este ejemplo,
el tiempo total de equilibrio usando una columna de 150 x 4.6mm a un flujo
de 2mL/min sería:
4.2 min (tD) + (1.7ml (volumen muerto de la columna) / 2ml/min x
número de volúmenes de columna)
O para un re-equilibrio de 5 volúmenes de columna:
4.2 + ((1.7/2) x 5 = 8.45min
O para un re-equilibrio de 10 volúmenes de columna:
4.2 + ((1.7/2) x 10) = 12.7min
Los sistemas de mezclado a alta presión con bombas binarias pueden
conseguir volúmenes extra-columna muy pequeños. Las mezclas a alta
presión proporcionan los menores volúmenes muertos ya que el gradiente se
forma después de la bomba, esto se traduce en un menor tiempo de
retención cuando se requieren gradientes rápidos o muy rápidos. Quitar la
segunda cámara de mezcla reduce aún más el volumen de retención.
El volumen efectivo de mezcla de un sistema de gradiente cuaternario a
baja presión necesita ser mayor que para un sistema de gradiente binario a
alta presión para asegurar una correcta mezcla de solventes. Este hecho
incrementa el volumen muerto, haciendo que la respuesta de estos sistemas
se alargue y los cambios en el gradiente se muestren apreciablemente más
lentos.
Ajustar el volumen de retención (VD) a su HPLC le permitirá una
transferencia del método más eficaz. Compensando los diferentes
volúmenes muertos en diferentes sistemas, los tiempos de retención de los
analitos y por lo tanto el perfil del cromatograma pueden mantenerse
idénticos.

- 55 -
4.7 Incidencias de la Bomba
La Válvula de Purga
La causa más probable de un incremento de presión en el sistema es un
bloqueo parcial en la primera frita después del sistema de inyección – El
filtro In-Line o la pre-columna- sin embargo si ninguno de estos dos
elementos están instalados, el problema puede venir de la cabeza de la
propia columna. Si tales aumentos de presión son comunes, es
recomendable seguir algunas medidas preventivas adicionales, como instalar
un filtro de línea o someter a las muestra a una filtración previa antes de su
inyección.
El conjunto de válvula de purga contiene PTFE como frita en la mayoría de
los sistemas de HPLC. Está diseñado para eliminar los depósitos que puedan
provenir de los sellos de los pistones arrastrados por la fase móvil. Cuando
esta frita se bloquea se produce un incremento en la contra presión del
sistema. Si esta presión llega aproximadamente a los 10 Bar mientras se
bombea fase móvil con la válvula de purga abierta, debe cambiarse la frita
No sustituir la frita puede dar como resultado una línea de base errática

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El material del sello del Pistón puede ser arrastrado hasta bloquear la frita
y la parte superior de la columna analítica. Los bloqueos en este punto
retrasan la entrada de los analitos en la columna, produciendo picos no
uniformes con hombros. Este tipo de picos también pueden originarse por
otro tipo de anomalías, pero una frita de columna bloqueada, a menudo
provocará hombros en todos los picos cromatográficos
Una frita de Columna bloqueada por restos del sello de los pistones
produciendo picos con hombro
Pistón y Sellos
Los sellos del Pistón están diseñados para desgastarse con el uso, siendo su
vida útil muy dependiente del tipo y de la concentración de las fases
móviles tampón que se utilicen.
Una fuga en el sello del pistón provoca fluctuaciones en la línea de base
como podemos observar en el gráfico:
Línea de base sinusoidal indicativa de un pistón rallado o sello con fugas

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Cualquier cambio del sello del pistón deberá implicar una inspección visual
del mismo, ya que si existen arañazos en la superficie del pistón, pueden
llevar prematuramente al fallo del nuevo sello reemplazado. Antes de la
inspección del pistón se deben limpiar los posibles depósitos de sales,
principalmente los restos de los tampones o del sello, utilizando un trapo
limpio, sin pelusas, empapado con una mezcla 1:1 de H2O:MeOH , y solo en
una dirección , desde la base hacia el extremo.
Luego, lo examinaremos con luz brillante y con la ayuda de una lupa para
verificar que no hay presente ningún arañazo o estrías.
Los sellos del Pistón están diseñados con frecuencia para deformarse con el
fin de ajustarse al pistón con el que están emparejados. En consecuencia es
posible que haya que sustituir el pistón y el sello al mismo tiempo.
Nota: Algunos fabricantes de instrumentos ofrecen e incluyen accesorios
integrados para la limpieza continua de los sellos facilitando así la
eliminación de los depósitos de cristal que proviene de los tampones
alrededor de los sellos. Con estos accesorios se hace pasar una solución de
lavado por los sellos de pistones para aumentar la vida útil de los mismos.
Una buena solución para lavado es la formada por un 10% de isopropanol en
agua.
En algunos casos esta solución de lavado también sirve para lubricar el
movimiento del pistón a través de un segundo conjunto de sellos residente
en el propio hardware del sello. En ese caso debe usarse siempre una
solución de lavado, incluso aunque no se empleen tampones como fase
móvil.

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Válvulas Antirretorno
La cristalización de los tampones, el crecimiento microbiano en las botellas
de los disolventes y el aire pueden perjudicar el sellado entre la bola de
rubí y el soporte o asiento de zafiro en la válvula antirretorno. La
sedimentación y el crecimiento microbiológico pueden provocar que este
problema permanezca constantemente. En estos casos puede observarse una
línea base con fluctuaciones características y repetitivas:
Típica línea de base producida por una válvula antirretorno defectuosa
Para regenerar una válvula antirretorno pegada o parcialmente bloqueada,
se puede seguir el siguiente proceso de limpieza:
Sonicar durante 10mins en una mezcla 1:1 de H2O:MeOH (1:1)
Sonicar durante 10mins en 0.1M HNO3.
Sonicar durante 5mins in MeOH antes de reinstalarla

- 59 -
Burbuja(s) de Aire en el Cabezal de la Bomba
La captura de aire es un problema relativamente común en bombas de
pistón recíproco, produciéndose en aquellos componentes del sistema que
están contacto directo con la fase móvil como las válvulas de entrada y
salida, pistón, sello del pistón, y cabezal de la bomba.
Las burbujas en el interior de los cabezales de la bomba a menudo generan
una línea de base de tipo sinusoidal:
Las burbujas de aire, si no se introducen directamente en el sistema por una
deficiente desgasificación de la fase móvil, pueden formarse por la creación
de un ligero vacío en el cabezal durante el ciclo de succión (llenado) de la
bomba. La combinación de baja presión, permitiendo la desgasificación, y
los “puntos de nucleación” de la superficie de de los componentes son
ideales para la creación de burbujas.
La válvula proporcional, utilizada para la mezcla en los sistemas a baja
presión para la creación las condiciones isocráticas o en gradiente
requeridas, puede también introducir burbujas debido a la menor
solubilidad del aire en la mezcla de solventes comparada con la de los
solventes puros individuales. Este efecto se denomina “cavitación”.
Una vez que la pequeña burbuja se ha formado puede actuar en realidad
como un amortiguador de presión, amortiguando el efecto de succión y
dispensación de la bomba, haciendo que ésta proporcione un flujo bajo y a
menudo errático. Aflojar ligeramente las conexiones de las válvulas de
salida y dejar fluir fase móvil del cabezal de la bomba puede servirnos para
purgar las burbujas de aire. En la mayoría de las ocasiones simplemente
abrir la válvula de purga y aumentar el flujo de fase móvil - a flujos de hasta
5mL/min- será suficiente para eliminar las burbujas de aire presentes.

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Una disminución de la presión de trabajo generalmente implica una fuga en
el sistema. Debe corregirse apretando, reajustando o cambiando el conector
defectuoso. Los fabricantes a menudo incorporan un test específico para el
diagnóstico de fugas, que puede realizarse para verificar la integridad del
cabezal de la bomba y otros componentes del sistema. El fallo en alguna
parte del test puede relacionarse con el mal funcionamiento de algún
componente específico del sistema cromatográfico reduciéndose así el
tiempo en que el instrumento queda fuera de operación al detectarse más
rápidamente la avería.

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Tutorial 1
Pregunta 1
Del siguiente listado de componentes selecciona aquellos que contribuyen a
un ensanchamiento de las bandas cromatográficas, es decir, disminuyen la
eficiencia en un sistema típico de HPLC
Componente HPLC Si/No
Tubos de conexión
Filtro de Línea
Cabezales de la bomba
Guarda-columna
Inyector
Conexiones-uniones
Celda de flujo del Detector
Botellas de disolvente
Columna Analítica

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Pregunta 2
La ilustración siguiente es el diagrama esquemático de un cabezal de doble
pistón recíproco. Identifica y etiqueta cada componente.
Usando la tabla siguiente, explica cual es la función de cada uno de los
componentes e indica cuál es su fallo asociado más frecuente
Componente
del Equipo
Función Incidencia

- 63 -
Pregunta 3
Evaluar el problema propuesto en el siguiente cromatograma y sugerir las
posibles causas y cómo podemos corregirlo
Pregunta 1
Observaciones:
Posible(s) Causa(s) y Solución(es):

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Pregunta 4
Un gas disuelto en la fase móvil puede provocar múltiples problemas
cromatográficos. Considera éstos y completa la siguiente tabla.
Problema Observado Causa Acción Correctora

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5 Inyectores
El Objetivo de esta sección es:
• Describir la función del sistema de inyección del HPLC.
• Explicar los principios de operación de los sistemas de inyección HPLC
más comunes.
• Enumerar y describir las incidencias más frecuentes y los
procedimientos de mantenimiento.
5.1 Componentes del Sistema de Inyección
El sistema de inyección se encuentra situado después de la bomba, estando
por lo tanto localizado en la parte alta presión del sistema de suministro de
solventes. La inyección de una muestra (a baja presión) en el sistema
representa una etapa crítica del proceso cromatográfico. Las válvulas de
inyección de muestra, o válvulas de conmutación, permiten la introducción
de cantidades precisas de muestra en el sistema y en la columna.
Inyectando directamente en el flujo de fase móvil a alta presión se elimina
la necesidad de parar el flujo de fase móvil, minimizando así de forma
efectiva cualquier perturbación en la línea de base cromatográfica
realizando un cambio, esencialmente libre de pulsaciones, en la dirección
del flujo de fase móvil.
La figura siguiente muestra la válvula de conmutación Rheodyne de 6
puertos y dos posiciones, cuyo diseño conforma la base para todas las
válvulas de inyección. La válvula se compone de una parte estática
(“stator”) enfrentada a un sello giratorio (“rotor seal”), en el que se han
mecanizado unos canales entre los puertos que permiten que el flujo de
fase móvil evite el loop(*) de inyección (“by-pass”) para la carga de muestra
(“load”), o vaya hacia él (“inject”) para la inyección de la muestra.
En la posición intermedia entre “load” e “inject”, el sello del rotor bloquea
momentáneamente el flujo de fase móvil hacia la columna. Este bloqueo
causa un pulso de presión en cabeza de columna, porque por un tiempo
finito el flujo efectivo de fase móvil cae a cero. Puesto que tales pulsos no
son deseables, la válvula debe girarse lo más rápidamente posible para
minimizar cualquier pulso de flujo y presión. Además, estos repetidos
choques de presión pueden dañar la columna, comprimiendo su fase
estacionaria y provocando la aparición de volúmenes muertos que
producirán formas de pico cromatográfico defectuosas, ejemplificadas por
la aparición de hombros y desdoblamiento en los picos.
(*) La traducción de LOOP es BUCLE pero ha preferido mantenerse la palabra
inglesa original por la generalización de su uso en el argot cromatográfico.

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Componentes de una válvula de conmutación Rheodyne de 6 puertos
El Rotor es un disco fabricado normalmente en material polimérico Vespel.
Esta poliimida confiere al rotor unas características de bajo desgaste y alta
Resistencia, admitiendo un rango de pH de 0−10.
Figura mostrando rotores de inyección de Vespel
.
Para fases móviles con pH sobre 10 se recomienda un Rotor Seal compuesto
de material polimérico Tefzel o PEEK, ya que ambos proporcionan mayor
resistencia química y versatilidad en el rango completo de pH de 1−14. Los
ácidos oxidantes fuertes, como el Ácido Nítrico o el Sulfúrico no son
compatibles con PEEK.

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Figura mostrando el rango de pH de los diferentes materiales
NB: los colores de pH mostrados son sólo con fines ilustrativos
El rotor está situado internamente en el cuerpo de la válvula de inyección, y
hace un cierre a alta presión contra la cara del estátor. Como el rotor gira
físicamente en cada secuencia de inyección, y sufre un deterioro de los
canales entre los puertos por la exposición a un pH alto y por las raspaduras
producidas por la fase móvil o partículas contenidas en los solventes, se
desgastará con el uso. En consecuencia, este es uno de los componentes del
HPLC que necesitarán una sustitución rutinaria.
La cara del estátor y el cabezal permiten la introducción y expulsión de la
fase móvil a través de los puertos capilares específicos de entrada y salida.
El puerto de inyección facilita el llenado del loop de muestra con una
jeringa, mientras que el puerto de desechos (“waste”) ventea el loop
permitiendo que se elimine el exceso de muestra.
Existen varias configuraciones para la inyección de un determinado volumen
de la solución de muestra en la fase móvil; uno, muy ampliamente utilizado
emplea un loop de inyección de volumen pre-determinado. Este loop puede
llenarse de dos formas distintas:
Llenado Completo del Loop
Puesto que el loop contiene fase móvil, la solución de muestra introducida
se mezclará y se diluirá necesariamente con esta fase móvil residente
mientras la desplaza. Por tanto, para que el loop se rellene de forma
homogénea, debe inyectarse un volumen de solución de muestra de entre 2
y 5 veces el volumen del loop, eliminando así cualquier posible efecto de
dilución.
Aunque el loop controle efectivamente el volumen de muestra inyectada,
haciendo que la cantidad de muestra introducida por la jeringa no sea un
parámetro critico, para obtener máxima precisión y linealidad es una
práctica recomendada cargar siempre el loop con el mismo volumen de
muestra p.ej. 3x volumen del loop ± 10%, En consecuencia, para un loop de
100µL se correspondería con un volumen de 270−330µL por inyección. La

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reproducibilidad es esencial para mantener la precisión y exactitud; El
volumen absoluto inyectado es de menor importancia.
Llenado Parcial del Loop
La técnica de llenado parcial del loop se utiliza habitualmente cuando es
importante ahorrar una muestra valiosa o limitada. Para obtener la mejor
precisión posible el volumen de muestra inyectada no debe superar el 50%
de la capacidad del loop del inyector. Durante la carga del loop, la muestra
introducida “empuja” a la fase móvil de su interior enviándola fuera a
través de la salida de desechos (“waste”), y durante ese proceso de
intercambio el frente de muestra se diluye.
Este efecto de dilución está causado por el perfil de flujo parabólico de un
líquido en movimiento por el interior de un segmento de tubo ya que
debido al flujo laminar, el centro de la corriente de fluido se mueve más
deprisa que la capa de líquido que está cerca de la pared del tubo. Una
forma de evitar la citada discriminación durante la inyección es inyectar una
burbuja de aire inmediatamente delante del volumen de muestra inyectado.
De esta forma se evita cualquier posible mezcla de la solución de muestra
con la fase móvil contenida en el loop.
La consecuencia de este fenómeno es que la muestra diluida ocupa en
realidad unos 2µL del volumen del loop por cada 1µL de la muestra cargada
con la jeringa. Por lo tanto, asegurándonos de cargar <50% del volumen
efectivo del loop, evitamos que el frente de la banda de muestra diluida
salga del loop y provoque errores relacionados con la precisión y a la falta
de reproducibilidad.
Este efecto se muestra en el siguiente conjunto de figuras, que ilustra los
efectos de la dilución de muestra en el área de pico obtenida:

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1. Injección de 1µL de muestra en un loop de volumen fijo de 20µL. Los
efectos de flujo laminar crean un tamaño de muestra diluida de 2µL.
4. Inyección de 20µL de muestra en un loop de volumen fijo de 20µL.El
volumen de inyección es el mismo que un llenado completo del loop.
Los efectos de flujo laminar crean un volumen de muestra
ligeramente diluido.

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La figura anterior muestra los efectos de dilución representando el área
obtenida frente a los diferentes volúmenes de inyección en un loop de
volumen fijo de 20µµµµL.
Cuando se carga un volumen <10µL de muestra existe una relación lineal
entre el volumen introducido en el loop y la cantidad de muestra inyectada
en columna. Cuando se cargan >40µL, el volumen real inyectado es ± 5% del
volumen del loop.
Sin embargo, en el rango entre 10−40µL se observa una relación no-lineal
diferente.
Después de la inyección son necesarios 5−10 volúmenes de loop para
desplazar completamente la muestra del mismo. Se recomienda por tanto,
mantener el inyector en la posición "inject" (paso principal) el tiempo
necesario para permitir que la fase móvil fluya a través del loop arrastrando
completamente la muestra.

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