Clase de Técnicas Histológicas y Microscopía, versión corta, sin videos ni algunas imagenes

1. Escuela de Medicina Luis Razetti Departamento de Ciencias Morfológicas Cátedra de Histología y Embriología Dr. Luis Alberto Isea M Médico Cirujano Octubre 2011

2. HISTOLOGÍA - Ciencia que estudia los tejidos de los seres vivos Histo + Logía Tejidos Ciencia Macroscópica Anatomía Microscópica - Correlación Estructura - Función Proceso Patológico Clínica

3. TÉCNICA HISTOLÓGICA Tejido Procedimientos Corte Histológico Microscopio Pasos de la Técnica Histológica 1) Obtención del material Incisional Biopsia Autopsia Citología Excisional

5. Detiene procesos celulares dinámicos

6. Elimina posibles patógenos

7. Aumenta la consistencia del tejidoAutolísis - No produce Artefactos - No dificulta etapas ulteriores de la técnica - Buena penetración al tejido Idealmente: Mec. de Acción: Forman Enlaces cruzados entre las Proteínas (Grupos Amino) Gel insoluble

8. TÉCNICA HISTOLÓGICA Perfusión Debe colocarse inmediatamente Volumen de fijador de 10 a 20 veces la muestra Dejar por 6 a 24 horas Fijación Inmersión a) Formol Físicos b) Alcohol c) Glutaraldehido d) Tetraóxido de Osmio Simples Fijadores Químicos Liquido de Fleming Liquido de Zenker e) Líquido de Bouin Compuestos

9. TÉCNICA HISTOLÓGICA a) Formol: - Mas utilizado - Mal fijador de membranas - Bajo precio - Buena efectividad - Poca retracción tisular - Disuelve el glucógeno b) Alcohol - Fija por deshidratación - Útil para citologías. «Lacas o spray» - Excelentes fijadores - Suelen usarse para la Microscopía Electronica - No para coloraciones convencionales c) Glutaraldehido d) Tetraoxido de Osmio

11. Tejidos blandos, núcleo, glucógeno

12. No dejar mas de 48 hr en inmersión

13. Eliminar ácido pícrico antes de la inmersión3) Inclusión Combinación del tejido con ceras (insolubles en agua) para formar un bloque de corte Debe eliminarse el agua de la preparación Batería de alcohol etílico Concentraciones crecientes (50-100%) DESHIDRATACIÓN

14. TÉCNICA HISTOLÓGICA - Se mezcla con un líquido miscible en parafina y agua Xilol Tejido Transparente Disuelve las grasas ACLARAMIENTO - Se realiza la mezcla con las ceras (Parafina) a) Impregnación: Se pasa por parafina caliente, removiendo el xilol b) INCLUSIÓN: Se baña completamente con parafina Otorga la dureza al tejido para realizar el CORTE

15. TÉCNICA HISTOLÓGICA 4) Corte - Una vez en el bloque de parafina, se cortan rebanadas de 5 – 10 mcm (M. óptica) MICROTOMO - Se coloca el corte en un baño de flotación - Se monta en una lámina portaobjeto

18. Se añade alcohol a concentraciones decrecientes Ácido - Básico Especializados (MEC) Colorantes Sales Metálicas (M. Electronica)

19. TÉCNICA HISTOLÓGICA Hematoxilina – Eosina (Coloración mas utilizada) - Se basan en las propiedades de BASOFÍLIA y ÁCIDOFILIA Hematoxilina: - Colorante Básico (al unirse con una Laca) - Carga Positiva - Es Hidrosoluble, colocar antes de deshidratar Tiene afinidad por estructuras con carga NEGATIVA (BASOFILICAS) ÁCIDOS NUCLEICOS (NÚCLEO CELULAR) COLOR PÚRPURA

21. Carga Negativa

22. Tiene afinidad con estructuras de Carga Positiva (ÁCIDOFILAS)

23. Unión con componentes CITOPLASMATICOSCOLOR ROJO - ROSADO

24. TÉCNICA HISTOLÓGICA 6) Montaje - Antes de ver el preparado al microscopio, debe colocarse una lámina cubreobjetos - Debe colocarse una sustancia conservadora a la muestra, para fijar ambas láminas HIDROFÓBICA - Volver a deshidratar el tejido y colocar xileno

26. TÉCNICA HISTOLÓGICA Tinción Lípidos (Corte Congelado) Sudan III Rojo Sudan (TAG) Negro Sudan (Neuronas) Tricrómico de Mallory Fibras Colágenas (Azul) Wright y Giemsa Células Hemáticas Metacromasia Azul de Toluidina - La coloración depende de la agregación de las moléculas - Se ve en tejidos con gran cantidad de polianiones - Azul --------------------- Púrpura -Glucosaminoglicanos MEC, Gránulos Mastocitos PAS: Carbohidratos, Glucogeno (Rojo) Reactivo de Schiff (Reacciona con grupos aldehídos) Feulgen: DNA

31. Errores en metodología (falla en el calculo de tiempos o selección de colorantes)

32. Equipo inadecuado (cuchillas desafiladas)

34. MICROSCOPÍA Microscopio. Concepto - Permite ver imágenes ampliadas y detalladas de estructuras no visibles a simple vista Óptico (Luz) Electrónico Efecto Túnel Fuerza Atómica Clasificación (fuente de luz) Simple (1 lente) Campo Claro Campo Oscuro Contraste de Fase Luz Polarizada Fluorescencia Confocal M. Óptico Compuesto (2 o más lentes)

36. El corte debe ser delgado (5 – 10 mcm)

37. La coloración permite el contraste entre las estructurasPartes Óptica Mecánica Da soporte y estructura Iluminación y aumento

38. MICROSCOPÍA Parte Mecánica Tubo Columna Revolver T Macrometrico Platina T Micrometrico Pie

40. Forman una imagen aumentada, dan resoluciónPoder de resolución Capacidad de una lente de distinguir dos objetos cercanos como independientes Límite de resolución Distancia mínima entre 2 objetos para que sean identificados como objetos separados A MAYOR PODER DE RESOLUCIÓN MAS NÍTIDEZ EN LA IMAGEN 0,2 – 0,5 mcm (M. óptica) 0,2 mm (Ojo humano) MENOR LÍMITE DE RESOLUCIÓN

41. MICROSCOPÍA Objetivo Número de Aumento: Depende de las lentes, es el grado de magnificación de la imagen 10X, 40X, 100X Abertura Numérica: Capacidad de captar rayos luminosos 0,30 0,65 1,30 10X 40X 100X LR = K x λ / AN MAYOR ABERTURA MAYOR RESOLUCIÓN

42. MICROSCOPÍA Distancia mecánica: - Longitud máxima en mm del tubo Medio de inmersión: (Secos vs. Húmedos) - Presenta un índice de refracción similar al del vidrio - Disminuye la desviación de los rayos de luz Espesor del cubreobjetos: - Grosor máximo de la lámina cubreobjetos 2) Ocular - Cilindro hueco con un lente convergente en cada extremo - Amplifica 10 X la imagen, no da resolución www.olympusmicro.com

43. MICROSCOPÍA Aumento total = Aumento del Ocular x Aumento del objetivo Aumento vacío = Aumento sin resolución

45. Diafragma: Regula la cantidad de luz que pasa a la preparación4) Fuente de luz - Bombillo de halógeno. Ilumina la muestra

46. MICROSCOPÍA Recomendaciones al utilizar el microscopio: Coloque el preparado con el cubre objetos hacia ARRIBA Use siempre el objetivo de MENOR aumento primero Use ambos ojos para ver la preparación Realice un primer enfoque con el tornillo MACROMETRICO Si desea enfocar aun mas, oriente la región hacia el centro de la lámina

48. Partículas brillantes sobre un campo oscuro

49. Igual resolución, pero mayor contrasteIMPORTANCIA MÉDICA?

51. Puede compararse con un rayo de referenciaM. De Interferencia Cuantitativo

52. MICROSCOPÍA d) Luz Polarizada - Orientación molecular de los componentes del material - La luz incidente viaja en un solo plano (polarizador) Birefringente (anisotropa) Divide a la luz en 2 componentes Muestra Isotropa - Diferencia estructuras en base a su refringencia. - Musculo estriado y Cel. De Leydig (testiculo) muestran birrefringencia www.olympusmicro.com

54. Usos: - Marcaje molecular

55. Estudios celulares

56. InmunologíaPara evitar distorsión de rayos de luz M. Confocal

57. MICROSCOPÍA f) Confocal - Evita la distorsión provocada por los rayos reflejados desde otros planos de corte - Se excluye la luz no emitida por el plano focal - Se coloca un detector con una hendidura en conjunción con el plano focal de la lente - Puede dar imágenes 3D

59. Se genera una ΔV entre cátodo y ánodoHaz de electrones (Baja λ) - Se usan bobinas electromagnéticas como guía Mayor Resolución LR = 0,2 nm Lente condensadora Lente objetivo - Requiere una preparación especial Fijadores: Glutaraldehído + Tetraóxido de Osmio Dan Densidad Electrónica Infusión: Se usan Resinas epoxi plásticas Corte: Cuchillas de diamante. Cortes muy delgados (25-100 nm) Tinción: Metales Pesados. Resaltan la estructura

62. Se le da voltaje a la punta, creando una ΔV en relación a la muestra (conductor)

63. Se crea un flujo de electrones (túnel)

65. La punta experimenta fuerzas de atracción o repulsión con la muestra generando flexiones del cantilever, que son medidas con un laser

66. Se puede estudiar cualquier tipo de muestra

78. Tareas