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Bioquímica UVEG 2005

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Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Bioquímica Universitat de València Curso 2004-05 1o de Química, Grupo E Prof.: Jesús Salgado Benito http://www.uv.es/salgado/bioquimica/
2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Conocimientos Previos. Repasar... • De Química General – Termodinámica básica: Primer y segundo principio de la termodinámica. Equilibrio químico – Equilibrio de ionización del agua: Concepto de pH. Reacciones ácido- base: pKa, tampones, curvas de valoración – Principales tipos de enlace e interacciones – Cinética química básica. Velocidad de reacción y constante de velocidad. Orden de reacción. Concepto de catalizador – Reacciones de óxido-reducción. Potencial electroquímico – Principales grupos funcionales orgánicos • De Biología General – Moléculas sillares: aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y azúcares – La célula. Células procariotas y eucariotas. Orgánulos principales de las células eucariotas
3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Organización del Curso • Primera parte (prof. Jesús Salgado) – Temas 1-6 • Estructura y función de Proteínas • Enzimología • Estructura y función de Ácidos Nucleicos – Examen en Abril • Segunda parte (prof. Mercedes Costell) – Temas 7-12 • Bioenergética • Metabolismo – Examen en Junio
4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Evaluación • Exámenes – Mínimo para aprobar: 5 puntos sobre 10 • Evaluación continua (máximo 40 %) – Cuestiones, trabajos y tests (a lo largo del curso) – Tutorías • Asistencia obligatoria • Entrega de cuestiones, dudas, etc – Sólo se aplica si sube la nota. Ejemplos: (6x0.6)+(10x0.4)=3,6+4=7,4 (6x0.6)+(9x0.4)=3,6+3,6=7,2 (6x0.6)+(7x0.4)=3,6+2,8=6,4 (6x0.6)+(5x0.4)=3,6+2=5,6 Final Final Eval. Continua Eval. Continua Examen Examen 10 9 7 5 7,4 7,2 6,4 6 6
5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Esquema del Tema • ¿Qué es la Bioquímica? • ¿Qué es la vida? • Organización de los organismos vivos – La célula – Tipos de células • Biomoléculas – Grupos funcionales – Tipos de biomoléculas • Monómeros • Macromoléculas • Aminoácidos y proteínas • Azúcares – Monosacáridos y polisacáridos • Ácidos grasos y lípidos • Nucleótidos y ácidos nucleicos • El agua – Estructura – Interacciones débiles en disolución acuosa – Propiedades del agua
6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) ¿Qué es la Bioquímica? • La Bioquímica estudia las bases moleculares de la vida – Composición química de las formas de vida y su funcionamiento – Pretende resolver preguntas fundamentales • ¿Qué es la vida? Origen de la vida – Múltiples aplicaciones de importancia social • Biomedicina, Biotecnología • Enfoque experimental multidisciplinal – Basado en conceptos de Biología, Química y Física – Ayudado por desarrollos tecnológicos complejos
7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) ¿Qué es la Vida? • Unidad dentro de la diversidad – Todos organismos vivos • Se componen de las misma clase de moléculas (moléculas biológicas) • Funcionan de manera semejante • Responden a las mismas leyes Físicas y Químicas que rigen el Universo • La vida es compleja y dinámica • La vida se organiza y mantiene a sí misma – Organización jerárquica – Necesita de aporte de energía y materia • Metabolismo y homeostasis
8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Organización Jerárquica de Organismos Multicelulares Organismo Sistema (aparato digestivo) Órgano (hígado) Tejido (tejido hepático) Célula (hepatocito) Orgánulo (núcleo) Molécula (DNA) Átomo (carbono)
9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) ¿Qué es la Vida?... • La célula es la unidad fundamental de organización y funcionamiento de la vida • La vida necesita información biológica – Necesaria para su organización, funcionamiento y replicación – Es una información estructural • Secuencia de los genes --> proteínas --> funciones • La vida no es estática: se adapta y evoluciona – Todas las formas de vida tienen un origen común
10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Organismos Vivos • Todas las especies vivas se componen de células – Tipos de células • Procariotas (sin núcleo) • Eucariotas (con núcleo y orgánulos celulares) • Tipos de organismos – Tres dominios • Bacterias • Arqueas • Eucariotas • Los virus son entidades genéticas sin vida autónoma
11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Hay Tres Grandes Tipos de Formas de Vida Sobre la Tierra
12 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) La Célula Procariota
13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) La célula Eucariota Animal
14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) La Célula Eucariota Vegetal
15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Distribución de Biomoléculas en la Célula
16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Biomoléculas • Inorgánicas – Agua 50-95% – Iones (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, ...) 1% • Orgánicas – Derivados de hidrocarburos • Combinaciones de carbono (principal), hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. – Forman enlaces covalentes estables – Importancia del carbono: • Puede participar hasta en 4 enlaces covalentes fuertes – Complejidad y estabilidad estructural • Permite formar cadenas largas lineales o ramificadas
17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Grupos Funcionales en Biomoléculas Polar, aceptor en enlaces de hidrógeno Éster O----- ||----- R— C —O —R’ Ésteres Polar, fácilmente oxidable para formar enlaces disulfuro (S-S) Tiol R— SH Tioles Polar, puede ser tanto dador como aceptor en enlaces de hidrógeno Amido O. ||- ...R— C —NH2 Amidas Base débil, cargado positivamente en estado protonado Amino R— NH2 Aminas Polar, ácido débil, cargado negativamente en estado desprotonado Carboxilo O. ||- .R— C —OH Ácidos Polar, aceptor en enlaces de hidrógeno Carbonilo O || .R— C —R’ Cetonas Polar, aceptor en enlaces de hidrógeno Carbonilo O || R— C —H Aldehídos Polar, dador en enlaces de hidrógeno Hidroxilo R —OH Alcoholes Propiedades Grupo Estructura Familia
18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Biomoléculas Orgánicas • Monómeros – Aminoácidos • grupo amino + carboxilo + cadena lateral – Azúcares sencillos • polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas – Ácidos grasos • ácidos monocarboxílicos con un número par de átomos de carbono – Nucleótidos • azúcar (ribosa) + base nitrogenada + fosfato • Macromoléculas – Proteínas • polímeros de α- aminoácidos – Polisacáridos • polímeros de monosacáridos – Ácidos Nucleicos • polímeros de nucleótidos – DNA, RNA
19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos y Proteínas • Los aminoácidos se distinguen por sus cadenas laterales – Naturaleza hidrofóbica o hidrofílica, tamaño, grupos funcionales – 20 α-aminoácidos formadores de proteínas • Polipéptido – Unión de varios aminoácidos por enlaces peptídicos – Péptido: unos pocos aminoácidos • poca riqueza estructural – Proteína: muchos aminoácidos • la cadena se pliega en estructuras definidas • gran diversidad de funciones – catalizadoras, elementos estructurales, transmisoras de señales, etc.
20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos y Proteínas Algunos α α-aminoácidos Polipéptido Plegamiento de una proteína Cadena polipeptídica desplegada Cadena plegada Enlaces peptídicos Glutamina Valina Lisina Glicina Fenilalanina Serina
21 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Azúcares • Monosacáridos – Según sean aldehídos o cetonas: • Aldosas – Ribosa, glucosa, galactosa • Cetosas – Fructosa – Según el número de carbonos • Triosas • Tetrosas • Pentosas • Hexosas – Formas lineales en equilibrio con hemiacetales cíclicos Aldosa α α-D-Glucopiranosa β β-D-Glucopiranosa Cetosa D-Glucosa Enlace hemiacetálico
22 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Disacáridos y Polisacáridos • Uniones por enlace glucosídico –Disacáridos • Sacarosa, lactosa, maltosa –Oligosacáridos • Rafinosa (trisacárido) –Polisacáridos • Homopolisacáridos – Fuente y almacenamiento de energía » Almidón (en vegetales) » Glucógeno (en animales) – Función estructural » Celulosa (en vegetales) » Quitina (en insectos) • Heteropolisacáridos – En péptidoglucanos » Glucosaminoglucanos – En glucoproteínas Glucógeno
23 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ácidos Grasos Saturados Estearato Insaturados Oleato Cabeza polar Cola hidrocarbonada
24 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Lípidos Triacilglicerol Fosfatidilcolina (fosfolípido) colina Acilo 2 Acilo 1 Acilo 3 Glicerol Colesterol Micela Bicapa
25 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ácido ribonucleico (RNA) Ácido desoxi- ribonucleico (DNA) Ribosa Desoxi- ribosa Enlace fosfo- diéster Enlace fosfo- diéster 3’ 5’ 3’ 5’ Bases nitrogenadas Nucleótido Adenosin- trifosfato (ATP) Timina (T) Citosina (C) Uracilo (U) Adenina (A) Guanina (G) Pirimidinas Purinas A Ribosa Nucleótidos y Ácidos Nucleicos
26 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) El Agua, Matriz de la Vida • Medio donde se desarrolla la vida – Fluido básico de la materia viva • Medio disolvente de las reacciones bioquímicas – Medio de transporte de sustancias • Transporte de nutrientes • Excreción de sustancias tóxicas – Ayuda a mantener la temperatura • Propiedades moleculares y físicas especiales – Estructura molecular: Posibilita interacciones débiles – Propiedades térmicas – Propiedades como disolvente • Polaridad • Presión osmótica
27 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Estructura Molecular del Agua • Hibridación sp3 del oxígeno – Estructura tetraédrica – Geometría no lineal • Distinta electronegatividad de O e H • Molécula polar – Distribución asimétrica de los electrones de enlace – Carga parcial + (δ+) cerca de los H y – (δ-) cerca del O – Capacidad de formar enlaces de hidrógeno H H O δ δ+ δ δ+ δ δ- Dipolos de enlace δ δ+ δ δ- Dipolo neto Enlace de H Geometría angular
28 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Enlaces Débiles en Disolución Acuosa • Pequeña energía de enlace – Se rompen y forman con facilidad – Importantes para la estructura y la función de las biomoléculas • Flexibilidad, dinamismo, interacciones y reconocimiento molecular • Tipos – Interacciones iónicas – Enlaces de hidrógeno – Interacciones dipolares – Fuerzas de van der Waals – Interacciones hidrofóbicas
29 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Interacciones Iónicas • Entre átomos o grupos cargados – Atracción entre iones de carga opuesta – Repulsión entre iones de la misma carga – Dependen de • Las cargas eléctricas (q) • La polaridad del entorno (ε) • La distancia (r ) • No dependen de la orientación • En macromoléculas, dan lugar a puentes salinos – Estabilizan el plegamiento – Intervienen en interacciones intermoleculares Na+ Na+ Na+ Cl– —NH3 + —COO– Puente salino kq1q2 ε r F= Ley de Coulomb Constante dieléctrica del medio Cargas Distancia
30 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) El Enlace de Hidrógeno • Atracción débil entre un átomo de H en un grupo polar y un átomo electronegativo (O, N, S) en otro grupo polar –Dadores • H2O, –OH, –NH, –NH2, –SH –Aceptores hidroxilo dador y agua aceptor carbonilo aceptor y agua dador carbonilo aceptor y amida dador Grupos complementar ios de bases de DNA T A Enlace de hidrógeno fuerte Enlace de hidrógeno débil C C Dependencia con la orientación
31 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Interacciones Dipolares • Entre moléculas o grupos dipolares. Dependen de la distancia, pero no de la orientación C=O δ+ δ– Dipolo permanente – dipolo permanente Dipolo permanente – dipolo inducido Dipolo inducido – dipolo inducido (Fuerzas de dispersión de London) Débil F ∝ 1/r3 Más débil F ∝ 1/r5 Mucho más débil F ∝ 1/r6 C=O δ+ δ– C=O δ+ δ– C — δ+ δ– C — δ+ δ– C — δ+ δ–
32 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fuerzas de van der Waals • Pueden ser atractivas o repulsivas A B A B Suma de los radios de van der Waals A B Solapamiento de nubes electrónicas: Repulsión A B Cerca: atracción Lejos: no interacción Máxima atracción r (nm) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 -1 1 Energía (KJ/mol) r Repulsión Atracción
33 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Propiedades Térmicas del Agua • El agua es un líquido a temperatura ambiente – Agua líquida: • Red dinámica de enlaces de H – Hielo: • Red rígida con número máximo de enlaces de H • Regulador térmico de los organismos vivos – Elevada capacidad calorífica • Modulador de la temperatura – Elevado calor de vaporización • Mecanismo de refrigeración Estructura del hielo
34 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) El Agua como Disolvente • Moléculas hidrófilas – Iones (electrolitos) • Se disuelven a través de esferas de solvatación – Moléculas polares • Se disuelven por interacciones dipolo-dipolo y enlaces de hidrógeno • Moléculas hidrófobas (apolares) – No se disuelven en agua • Se agrupan entre ellas • El agua se organiza alrededor de ellas formando un “clatrato” (efecto hidrofóbico) Disolución de iones en agua Moléculas de agua del entorno Agrupación de moléculas hidrófobas Moléculas de agua muy organizadas Estructura de un clatrato Esfera de solvatación
Estructura de las Proteínas Tema 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
Aminoácidos 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Un α-aminoácido es un ácido carboxílico con un grupo amino y un grupo R en el carbono α • R --> cadena lateral • Dos estereoisómeros posibles – Enantiómeros L y D – Sólo la forma L se encuentra en proteínas L-Alanina D-Alanina
3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Estándar Aminoácidos neutros no polares Aminoácidos neutros polares Aminoácidos ácidos Aminoácidos básicos Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Fenilalanina Triptófano Metionina Cisteina Prolina Serina Treonina Tirosina Asparagina Glutamina Aspartato Glutamato Lisina Arginina Histidina • Se representa normalmente el estado de protonación a pH 7,0 • Los aminoácidos se clasifican según las propiedades de sus cadenas laterales (a pH 7,0) –¡Atención a los casos de His, Tyr y Cys!
4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Alifáticos No Polares Glicina Gly, G Alanina Ala, A Valina Val, V Leucina Leu, L Metionina Met, M Isoleucina Ile, I Prolina Pro, P Cadena lateral ciclada. Implica restricciones conformacionales (Iminoácido)
Aminoácidos Aromáticos 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fenilalanina Phe, F Tirosina Tyr, Y Triptófano Trp, W No polar (Hidrofóbico) Polar No polar (Hidrofóbico)
6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Neutros Polares Serina Ser, S Treonina Thr, T Cisteina Cys, C Asparagina Asn, N Glutamina Gln, Q •Puede encontrarse cargado a pH>8,5 •Grupo -SH es muy reactivo. Dos moléculas de Cys se oxidan formado cistina mediante un puente disulfuro (-S-S-). Puede encontrarse cargado a pH>9 Tirosina Tyr, Y
7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Básicos con Carga Positiva Arginina Arg, R Histidina His, H Lisina Lys, K H+ Se encuentra cargado a pH<7
8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Ácidos con Carga Negativa Aspartato Asp, D Glutamato Glu, E
Aminoácidos no Estándar 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Aminoácidos distintos de los 20 estándar y derivados de éstos realizan funciones biológicas importantes como mensajeros o precursores – Neurotransmisores • γ-aminobutírico (GABA), derivado de la Gln • serotonina, derivado del Trp – Hormonas • tiroxina, derivado de la tirosina • ácido indol acético, derivado del triptófano – Precursores e intermediarios metabólicos • citrulina • ornitina
Aminoácidos Proteicos Modificados • Se forman después de la síntesis proteica • Proporcionan propiedades funcionales específicas 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) γ-carboxiglutamato 4-hidroxiprolina 5-hidroxilisina o-fosfoserina Importante para la unión de calcio en proteasas de la cascada de coagulación Posibilitan la formación de la estructura reticular del colágeno La fosforilación en residuos con grupos hidroxilo (Ser, Tyr, Thr) regula la actividad de muchas proteínas
Propiedades Ácido-Base de los Aminoácidos • Los aminoácidos son anfóteros – se comportan a la vez como ácidos y como bases • A pH 7 Los aminoácidos sin cadena lateral cargada son zwitteriones – presentan simultáneamente una carga positiva y una negativa 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Carga neta +1 Carga neta 0 Carga neta -1 Forma aniónica Forma zwitteriónica (neutra) Forma catiónica K2; pK2 K1; pK1
12 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) α-carboxilo pK1=2-3 Asp y Glu pKR≈4> pK1 Lys y Arg pKR> pK2 α-amino pK2=9-11 His pKR< pK2 Cys, pKR< pK2 Tyr, pKR> pK2 carga - en estado desprotonado Valores de pKa de Aminoácidos
Punto Isoeléctrico (pI) 13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • pI es el valor de pH para el cual la carga neta del aminoácido es 0 – Valor medio de los pKa que flanquean la estructura isoeléctrica • Para aminoácidos neutros es el valor medio de los pK1 y pK2 • Para aminoácidos ácidos o básicos depende de cada caso – Cuando pH= pI disminuye la solubilidad en agua pK1=2.2 pKR=4.3 pK2=9.9 Equivalentes de OH- Ácido glutámico pI= (2.2+4.3)/2 = 3.22 Carga +1 Carga -1 Carga -2 Carga 0
14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Polimerización de Aminoácidos: El enlace Peptídico • Los aminoácidos polimerizan formando polipéptidos mediante enlaces peptídicos – El enlace peptídico es un enlace amida formado por unión del grupo α-carboxilo y el grupo α-amino de dos aminoácidos – Los aminoácidos unidos se llaman residuos de aminoácido – Los residuos se nombran con la terminación “il” comenzando por el extremo N-terminal Formación de un Dipéptido Enlace peptídico N-terminal C-terminal Dos aminoácidos
Propiedades del Enlace Peptídico 15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) C—N —Cα O H Cα— C—N —Cα O H Cα— Estructuras de resonancia del enlace peptídico Equilibrio cis-trans. Sólo en los enlaces X–Pro aparece la conformación cis en una proporción significativa C—N —Cα O H Cα— C=N —Cα O- Cα— + H trans cis • El enlace peptídico es rígido y planar – Tiene carácter parcial de doble enlace (~40%) • Equilibrio de estructuras resonantes • No tiene libertad de giro – Es más corto que otros enlace C—N – Se presenta normalmente en conformación trans • Los grupos C=O y N-H peptídicos son polares – Participan en la formación de enlaces de hidrógeno
Péptidos 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Son polímeros de unos pocos aminoácidos • Ejemplos de algunos péptidos importantes – Glutatión (γ-glutamil-L-cisteinilglicina) • Agente reductor. Protege a las células de productos oxidantes derivados del metabolismo del O2 – Vasopresina (hormona antidiurética) • Interviene en la regulación del equilibrio hídrico – Oxitocina • Hormona sexual. Estimula la secreción de la leche y la contracción muscular uterina durante el parto – Péptidos opiáceos (leu- y met-encefalinas) • pentapéptidos que intervienen en el alivio del dolor
Proteínas 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Largas cadenas de aminoácidos que se pliegan con una estructura definida • Son responsables de la mayoría de las funciones bioquímicas: – Catálisis – Transporte – Estructura – Almacenamiento – Movimiento – Detoxificación – Defensa – Regulación
Tipos de Proteínas 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Según su forma – Fibrilares – Globulares • Según su composición – Simples – Conjugadas • Constan de una cadena polipeptídica y un grupo prostético – apoproteína --> sólo la cadena polipeptídica – holoproteína --> polipéptido + grupo prostético • Según sea el grupo prostético: – glucoproteínas – lipoproteínas – metaloproteínas – hemoproteínas – fosfoproteínas
19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Estructura de las Proteínas • Surge del plegamiento de la cadena polipeptídica • Depende de su secuencia y de las características del disolvente • Se distinguen cuatro niveles estructurales: – Estructura primaria • Secuencia de aminoácidos – Estructura secundaria • Plegamiento local – Estructura terciaria • Plegamiento global – Estructura cuaternaria • Organización multimérica de varias cadenas Conformación de la cadena polipeptídica Plano amida- peptídico Cadena lateral Carbono α Carbono α φ ψ
Estructura Primaria 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Se define por la secuencia de aminoácidos – Específica de cada proteína • Las proteínas homólogas tienen secuencias y funciones semejantes • La comparación de secuencias permite establecer relaciones evolutivas – Mutaciones -->variaciones en la secuencia • Los aminoácidos invariables son importantes para la función • Las mutaciones conservadoras son cambios entre aminoácidos químicamente semejantes • Algunas mutaciones se relacionan con enfermedades --> enfermedades moleculares (patología molecular) Estructura primaria de la insulina
Estructura Secundaria 21 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Patrones repetitivos de conformación local de la cadena polipeptídica – Dependen de los valores de los rotámeros φ y Ψ • Hay un número limitado de conformaciones posibles debido a impedimentos estéricos entre los grupos -NH, -CO y -R • La conformación más favorable depende de la secuencia de aminoácidos – Las conformaciones posibles se estabilizan por un número elevado de enlaces de hidrógeno Fragmento de cadena polipeptídica e conformación extendida: φ =180o, ψ =180o Plano amida Plano amida Cadena lateral Carbono α
Conformaciones Prohibidas El choque estérico (solapamiento de los radios de van der Waals) al girar los rotámeros φ y ψ impide gran número de conformaciones. Las conformaciones posibles se representan en el diagrama de Ramachandran 22 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Choque de los grupos - CO Choque de los grupos - NH Grupos -CO lejos entre ellos y lejos de la cadena lateral R Choque -NH con -CO Conformación Posible φ =0o, ψ =180o φ =180o, ψ =0o φ =-60o, ψ =180o φ =0o, ψ =0o
Diagrama de Ramachandran 23 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Distribución de ángulos φ y ψ en un polipéptido de polialanina – En blanco, valores prohibidos – En azul, valores posibles. • Tipos principales de estructura secundaria – hélice α – láminas β ψ (grados) φ (grados) Hélice α (a derechas) Cadenas β Hélice α (a izquierdas)
24 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Hélice α (3,613) • Conformación helicoidal “a derechas” – φ=-60o, ψ=-40o - -50o – 3,6 residuos por vuelta • avance de 5,4 Å por vuelta – 13 átomos por bucle (hélice 3,613) – Casi todos los grupos peptídicos participan en enlaces de H • Entre residuos i e (i+4) • Excepto en los extremos – Las cadenas laterales se dirigen hacia fuera • Mínima repulsión • Posibles interacciones entre ellas •3,6 residuos •5,4 Å •(1,5 Å por residuo) Residuo “i” Residuo “i+4” Cadenas laterales hacia afuera Vista desde arriba 1 2 3 4 13 átomos por cada bucle cerrado por un enlace de H
Estabilidad de la Hélice α 25 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Contribución principal: enlaces de hidrógeno entre grupos - CO y -NH peptídicos (cada residuo i con i+4) –No es posible en los tres primeros residuos de los extremos •Se estabilizan por enlaces de H con grupos de cadenas laterales • Interacciones entre cadenas laterales –Residuo i con i+3 e i+4 (por encima) y con i-3 e i-4 (por debajo) •Electrostáticas –Atractivas (estabilizadoras, entre residuos de distinta carga) –Repulsivas --> desestabilizadoras (entre residuos con la misma carga) •Hidrofóbicas • Algunos residuos desestabilizan la hélice α –Glicina (no tiene R --> otorga demasiada flexibilidad) –Prolina (restringe el giro de φ; no tiene -NH para formar enlace de H) –Residuos voluminosos (Trp) y ramificados en el carbono β (Val, Thr)
26 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Hoja β Hoja β Paralela Hoja β Antiparalela Enlaces de H mejor orientados (más fuertes) Peor orientación de enlaces de H (más débiles) • Alineamiento de segmentos polipeptídicos en confor-mación extendida (cadenas β) – -CO y -NH peptídicos forman enlaces de H entre cadenas adyacentes – Apariencia de lámina plegada – Cadenas laterales dispuestas perpendicularmente a ambos lados de la hoja – Frecuentes aminoácidos con cadena lateral voluminosa • Según la dirección de las cadenas β – Paralela – Antiparalela
27 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Esquemas de Hojas β Paralela Antiparalela Cadenas laterales
Giros β 28 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Cambian la dirección de la cadena 180o – Conectan entre sí cadenas β antiparalelas • Son giros cortos y cerrados – Implican cuatro residuos • Con frecuencia Gly y Pro – Enlace de H entre i e i+3 • Varios tipos – Tipo I – Tipo II (Gly en 3a posición) Tipo I Tipo II Glicina 1 2 3 4 3 4 1 2
29 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Meandro β Unidad αα Barril β Llave griega Unidades βαβ Estructuras Supersecundarias • Son combinaciones de elementos de estructura secundaria que forman patrones definidos • También se denominan motivos estructurales y son la base para la clasificación estructural de las proteínas
Estructura Terciaria 30 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Estructura tridimensional global que asume una proteína al plegarse – Residuos lejanos en la secuencia quedan cerca en el espacio – Estructura compacta que excluye las moléculas de agua de su interior • La ausencia de agua facilita las interacciones iónicas y los enlaces de hidrógeno • En el interior se agrupan residuos hidrofóbicos (efecto hidrofóbico). Los polares se exponen al exterior – Las proteínas grandes suelen presentar dominios estructurales
31 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Dominios Estructurales Son unidades estructuralmente independientes que presentan características y funciones definidas Mano EF Configuración hélice-vuelta-hélice que se une específicamente a iones Ca2+ Dedo de Zn Habitual en proteínas que unen DNA Cremallera de leucinas Hélice F Hélice E Ca2+
32 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Mantenimiento de la Estructura Terciaria Puente salino Interacciones hidrofóbicas Puentes disulfuro Enlaces de hidrógeno Interacciones covalentes Presentes sólo en algunos casos Interacciones débiles (no covalentes) •Iónicas (puentes salinos) •Hidrofóbicas •Enlaces de hidrógeno •Fuerzas de van der Waals
33 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Proteínas Hidrosolubles y Proteínas de Membrana Entorno acuoso Hidrofóbico Hidrofóbico Arg Arg Asp Asp Lys Lys Glu Glu Asn Asn Gln Gln His His Tyr Tyr Pro Pro Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Ala Trp Trp Cys Cys Val Val Leu Leu Ile Ile Met Met Phe Phe Polar Escala de hidrofobicidad de Engelman Entorno lipídico membrana
Plegamiento de las Proteínas 34 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • El plegamiento depende de las condiciones del medio – Factores físicos • Temperatura • Presión – Factores químicos • pH • Disolventes orgánicos • Agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidinio) • Es reversible y cooperativo Temperatura (ºC) Fracción desnaturalizada Renaturalización Desnaturalización N D D desnaturalizada N nativa Experimento de Anfinsinsen
Proteína denaturalizada <-> Proteína Nativa 35 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Regular, compacta • Estructura 2ria • Abundancia de enlaces intramoleculares – Puentes de H – Enlaces iónicos – Interacciones de van der Waals • Residuos hidrofóbicos no expuestos • “Ovillo estadístico” • Irregular, variable, abierta • Ausencia de estructura 2ria • Pocos enlaces intramoleculares • Residuos hidrofóbicos expuestos – Efecto hidrofóbico – Contribución entrópica al plegamiento D N desnaturalización renaturalización Clatratos: Capas de H2O ordenadas Residuos hidrofóbicos
Plegamiento “in vivo” 36 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Problema del plegamiento “in vivo” – Plegamiento acoplado a la síntesis de proteínas – ¿Cómo selecciona la célula las condiciones de plegamiento? • Control celular de las condiciones de plegamiento (chaperonas moleculares) – Plegamiento de proteínas nacientes – Prevención y corrección de errores de plegamiento en condiciones de estrés (Heat shock proteins, HSP) • Sistemas enzimáticos que ayudan al plegamiento – Proteína-disulfuro isomerasas – Peptidil-prolil isomerasas mRNA ribosoma Síntesis de proteínas Síntesis de proteínas Cadena naciente N proceso catalizado Plegamiento Plegamiento Cys Pro Cys Cys
Estructura Cuaternaria 37 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Asociación no covalente de varias cadenas polipeptídicas – Subunidades=monó- meros=protómeros – Las subunidades se organizan de manera simétrica – Ventajas de la asociación • Mayor estabilidad • Regulación alostérica – Estabilidad • Mismo tipo de enlaces que estructura terciaria Estructura cuaternaria de la hemoglobina Homo-oligómero de cuatro subunidades (tetrámero 2xαβ) α1 β1 β2 α2
Proteínas Fibrosas y Proteínas Globulares 38 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Fibrosas – Forma alargada – Unidades repetidas de un solo tipo de estructura secundaria – Resistentes e insolubles – Función estructural • Ejemplos – Colágeno (en tejido conectivo de vertebrados) – Queratina (en piel, pelo y uñas) – Fibroína de la seda • Globulares – Forma más o menos esférica – Ricas en estructura secundaria – Flexibles, y dinámicas – Múltiples funciones • Ejemplos – Hemoglobina – Inmunoglobulinas (anticuerpos) – Enzimas
El Colágeno 39 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Proteína más abundante de vertebrados • Red fibrosa de tropocolágeno • Tropocolágeno –Abundancia de Pro y Gly • Secuencia G-X-Y –X e Y suelen ser Pro e hidroxi-Pro –En Y también abunda hidroxi-Lys –Triple hélice a derechas formada por tres hélices a izquierdas • Enlaces de H interhélice • Gly, uno de cada tres residuos, en la zona de empaquetamiento • Entrecruzamiento de unidades de tropocolágeno –Por derivados aldehído de Lys Hélice triple de tropocolágeno Tres hélices a izquierdas
40 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fibrilogénesis del Colágeno Cabezas de tropocolágeno Estriaciones 640 Å (64 nm) Estriaciones 640 Å (64 nm) Tropocolágeno Uniones hidoxilisinonorleucina Cadena polipeptídica Norleucina (residuo de Lys sin grupo ε- amino) Residuo de hidroxilisina Cadena polipeptídica
Aminoácidos Especiales en el Colágeno • Residuos de Prolina y Lisina hidroxiladas – Proporcionan grupos formadores de enlaces de hidrógeno – Se forman por adición de hidroxilo • Modificación enzimática post-traduccional • Catalizada por una prolilhidroxilasa (o lisilhidroxilasa) que requiere ascorbato (vitamina C) como antioxidante 41 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Residuo 4-hidroxiprolil Residuo 3-hidroxiprolil Residuo 5-hidroxilisil
α-Queratina Estructura del Pelo 42 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Protofila- mento Protofibrilla Filamento intermedio Células Hélices enrolladas Hélice α Hélice α Dos hélices enrolladas a izquierdas Protofilamento Proto- fibrilla Unidad estructural Dímero Reduc- ción Rizado Oxida- ción Rizado Artificial del cabello
43 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fibroína de la Seda • Fibras formadas por hojas β antiparalelas – Aminoácidos con cadena lateral pequeña (Gly, Ala, Ser) – Residuos hidrofóbicos y polares alternados (en caras opuestas) – Varias hojas interaccionan por las caras hidrofóbicas • Flexible y resistente al estiramiento polar polar apolar apolar
Dinámica de las Proteínas Tema 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Esquema del Tema • Dinámica y Funcionalidad – Flexibilidad – Cambios conformacionales – Interacciones • Interacción Proteína/Ligando – Generalidades – Fracción de saturación – Cooperatividad – Alosterismo • Proteínas transportadoras de oxígeno – Mioglobina y Hemoglobina – Curvas de saturación de O2 – Origen molecular de la cooperatividad – Efectores alostéricos de la hemoglobina. Origen molecular del alosterismo • 2,3-BPG • Efecto Bohr • CO2 • Variantes naturales y patología molecular de la hemoglobina
Dinámica y Funcionalidad 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La funcionalidad de las Proteínas depende de sus propiedades dinámicas – Flexibilidad • Las proteínas no son estructuras rígidas • Su flexibilidad depende de un gran número de enlaces débiles – Cambios conformacionales • Son pequeñas variaciones de la estructura terciaria • Sirven para regular la actividad de las proteínas – Interacciones • Unión reversible de ligandos • Interacciones reversibles proteína-proteína • Se estabilizan mediante enlaces débiles
Interacción Proteína (P) / Ligando (L) 4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Muchas funciones dependen de la unión reversible de ligandos • Tipos de ligandos – En catálisis • P = enzima • L = sustrato, activador, inhibidor – En señalización • P = receptor • L = hormona – En transporte • P = transportador • L = O2, lípido, azúcar, etc. – En sistema inmunológico • P = anticuerpo • L = antígeno P L Sitio de unión Complejo PL L • Sitio de unión – Específico y definido – Interacciones P-L • Enlaces débiles: – Hidrofóbicos – Iónicos – Enlaces de H – van der Waals – Otros
Fracción de Saturación • Para un solo sitio: Representación de Y frente a [L] 1 0,5 0 P + L PL Kd Y 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Constante de disociación Æ Definimos Fracción de Saturación Y : [L] Kd ’ Kd ’’ Unión débil Unión fuerte Definición de Kd Concentración de ligando para la cual se alcanza la mitad de la saturación máxima (L½) Kd = L½ Afinidad ½ ´ Kd ¾ De las expresiones anteriores Æ Ecuación de una hipérbola
6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Cooperatividad • Sitios equivalentes e independientes – K1 = K2 • • • = Kn = L½ – c = 1 • Sitios equivalentes y dependientes – Supercooperatividad + • Todos simultáneamente • c = n – Cooperatividad + • K1 > K2 • • • > Kn • 1 < c < n – Cooperatividad – • K1 < K2 • • • < Kn • 0 < c < 1 P + L PL • Para varios sitios K1 PL + L PL2 K2 PL2 + L PL3 K2 PLn-1 + L PLn Kn • • • c Æ coeficiente de Hill P + nL PLn K
Curvas de Cooperatividad Positiva 7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La afinidad aumenta a medida que se van ocupando los sitios • Resultado: – Curva sigmoidea • Superposición de distintas curvas hiperbólicas teóricas • L½ representa la afinidad del conjunto – Para el conjunto No cabe hablar de Kd Curva sigmoidea 1 0,5 0 L½ Y [L] Kd ’ Kd ’’ Unión débil (primer sitio) Unión fuerte (último sitio) Unión cooperativa
Alosterismo Homotrópico 8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Existe alosterismo cuando: – Hay más de un sitio de unión – La unión en un sitio afecta a la afinidad en otros (dependientes) • Efecto alostérico homotrópico – Sitios equivalentes • Mismo ligando en los distintos sitios • Proteínas multiméricas –Cada sitio en una subunidad proteica • Es el caso de cooperatividad • Dos estados conformacionales de ≠ afinidad – T (tenso), baja afinidad – R (relajado), alta afinidad Modelo concertado (de Monod) L L T T Dímero Modelo secuencial (de Koshland) R R L L L T T Dímero L R L T R R R R L L L
Alosterismo Heterotrópico 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Efecto alostérico heterotrópico – Sitios no equivalentes • Distintos ligandos –Cada uno su sitio específico • Positivo Æ activación • Negativo Æ inhibición • Se deben a cambios conformacionales inducidos por la unión del efector • Sirven como mecanismo de regulación I Efector negativo (inhibidor) Efector positivo (activador) A Activador S P Sustrato S P Sustrato Inhibidor A P I P S P A P S
Curvas de Alosterismo • Solo heterotrópico – Activación o inhibición y no cooperatividad • Activador –Aumenta la afinidad • Inhibidor –Disminuye la afinidad •Homo y heterotrópico –Cooperatividad + activación o inhibición • Activador –Afinidad½, cooperatividad¾ • Inhibidor –Afinidad¾, cooperatividad½ 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1 0,5 0 L½ Y [L] L½ ’’ + Activador 1 0,5 0 Y [L] + Inhibidor + Activador Sólo cooperatividad + Inhibidor Kd ’’ Kd ’’ L½ ’’ Kd
Ejemplo de Sistemas Alostéricos: Proteínas Transportadoras de O2 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Mioglobina – Hemoproteína monomérica – Función: • Almacenamiento de O2 en el músculo • Hemoglobina – Hemoproteína tetramérica • Cada cadena es muy similar a la mioglobina – Función: • Transporte de O2 y CO2 entre los pulmones y los tejidos Mioglobina Hemoglobina
El Sitio de Unión del Oxígeno 12 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fe2+ Desoxi-Hb Oxi-Hb O2 Fe2+ hemo His proximal Fe2+ Grupo hemo Fe2+-protoporfirina IX O2 Histidina distal Histidina proximal Cavidad hidrofóbica
¿Cómo Funciona el Transporte de O2? Y Y Eficiencia del transporte El transporte es eficaz si la saturación en los tejidos es mucho menor que en los pulmones mala regular Muy afín Poco afín Muy afín pO2 pO2 13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) La mayor eficacia se consigue con un comportamiento cooperativo (sigmoideo) Y pO2 Y Eficiencia del transporte (Hemoglobina) buena (R) (T) Cooperatividad pO2
Origen Molecular de la Cooperatividad 14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Desoxihemoglobina Oxihemoglobina Interfase α1β1- α2β2 α1 α2 β2 β1 Transmi- sión del cambio a otras subunida- des • Le hemoglobina es un dímero de dímeros – Interfase α1β1- α2β2 • Interacciones iónicas en forma desoxi (T) – Grupos hemos muy separados • La unión de O2 en una subunidad provoca: – Desplazamiento del Fe2+ en el plano del grupo hemo – Cambio conformacional transmitido a las subunidades vecinas (Transición TÆR)
Transición T Æ R en la Hemoglobina Forma T (desoxi) Forma R (oxi) α1 α2 β1 β2 α1 α2 β1 β2 15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1. Unión de O2 a una subunidad – Cambia ésta de T a R 2. Reordenamiento de la interfase α1β1-α2β2 3. Cambio conformacional transmitido a las subunidades vecinas • Giro de 15º de α1β1 con respecto a α2β2 • Disminución de cavidad entre β1 y β2 4. Transición TÆ R en subunidades vecinas – Aumento de afinidad por el O2 • Cooperatividad α1 β1 α2 β2 α1 β1 α2 β2
Efectores Alostéricos de la Hemoglobina 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Ión H+, CO2 y 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) – Efectores heterotrópicos • Actúan como inhibidores – Estabilizan forma desoxi (T) – Disminuyen afinidad por el O2 • Facilitan liberación en los tejidos – Acentúan cooperatividad • Mejoran la efectividad del transporte • Permiten regulación fisiológica – Modulan la afinidad por el O2 • Transporte de H+ y CO2 en sentido inverso al O2
Papel del 2,3-BPG 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Compuesto iónico – Carga negativa • Se une sólo a las formas T – Sitio de unión sólo en las formas T – 2,3-BPG dificulta la transición TÆR • Estabiliza forma desoxi • Inhibe la unión de O2 • Sin 2,3-BPG – Mucha afinidad por O2 – Poca cooperatividad • Baja eficiencia de transporte + + + + + + + + - - - - - p50O2 P50O2’ 1 0,5 0 Y pO2 (torr) sin 2,3-BPG con 2,3-BPG
Papel del H+ (Efecto Bohr) 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Un pH bajo facilita la liberación de O2 en los tejidos – pH 7,4 (pulmones) • Mayor afinidad – pH 7,2 (músculo activo) • Menor afinidad • Origen molecular del efecto Bohr – Grupos ionizables protonados (dos His y N-terminal) • En estado protonado forman puente salino • Estabilizan forma T (desoxi) • Disminuyen la afinidad por el O2 • Se libera O2 en los tejidos pH 7,2 (en los tejidos) Protón añadido Puente salino que estabiliza la forma T (desoxi)
Papel del CO2 carbamato 19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Una mayor presión parcial de CO2 facilita la liberación de O2 en los tejidos – En los tejidos, pCO2 alta • Menor afinidad por O2 – En los pulmones pCO2 baja • Mayor afinidad por O2 • Origen molecular – CO2 en los tejidos reacciona con grupos N-terminal de la Hb • Forma grupos carbamato con carga – – Participan en puentes salinos de las formas T • Estabiliza forma desoxi • Facilita liberación de O2 Tejidos Pulmones Y
Variantes moleculares de la hemoglobina + + + + + + + + - - - - - Sustituido por Ser (sin carga +) Hemoglobina α2 γ2 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Hemoglobina fetal – Cadenas γ en lugar de β • His143 sustituida por Ser (sin carga +) • Menor afinidad por el 2,3-BPG • Mayor afinidad por O2 –Transferencia de O2 desde la hemoglobina materna Eritrocitos maternos (α2 β2) Eritrocitos del feto (α2 γ2) El O2 fluye desde la oxihemoglobina materna a la desoxihemoglobina del feto Y
Enzimas Tema 4 1 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
Catalizadores Biológicos 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ejemplos de reacciones catalizadas Anhidrasa carbónica Péptido o proteína Proteasa • 1011 veces más rápida • La especifidad depende de R1 • Convierte 6x105 moléculas por segundo • 107 veces más rápida que sin enzima • Catalizador: – Aumenta la velocidad de reacción – No varía ∆G de la reacción – Facilita la reacción en condiciones no extremas – No se consume durante la reacción • Los catalizadores biológicos son: – Casi siempre proteínas (enzimas) – Excepcionalmente RNA catalítico (zibozimas)
El Centro Activo 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Las enzimas son específicas por sus sustratos – Interacción precisa enzima- sustrato – Sitio de interacción: “centro activo” • Hendidura tridimensional • Zona pequeña de la enzima • Propiedades especiales para la unión y catálisis del sustrato – Sustrato y centro activo tienen formas complementarias – Interacción a través de enlaces débiles Uracilo (parte del Sustrato) Serina Treonina Ribonucleasa Centro activo
El Estado de Transición Explicación termodinámica 4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La reacción transcurre a través de un estado de transición (S*) – Intermedio entre S y P – Mayor energía que S • Barrera de energía de activación • La enzima facilita la formación de S* – Reduce la energía de activación • Acelera la reacción – S* es complementario con el centro activo S S* P Sustrato (S) Producto (P) Progreso de la reacción Energía libre De reacción (No catali- zada) Estado de transición S* (catalizada) Energía de activación
Modelos del Complejo Enzima-Sustrato 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La llave y la cerradura (Fisher, 1890) – Centro activo y sustrato son perfectamente complementarios • Reconocimiento molecular • Ajuste inducido (Koshland, 1958) – La unión del sustrato induce un cambio en el centro activo que aumenta la complementariedad • Reconocimiento molecular dinámico Sustrato Enzima Complejo ES Enzima Complejo ES Sustrato Estado de transición
6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Tipos de Enzimas • Oxidoreductasas – Catalizan reacciones de oxidoreducción • Deshidrogenasas, oxidasas, oxigenasas, reductasas, peroxidasas • Transferasas – Catalizan transferencias de grupos • Transcarboxilasas, transaminasas, transmetilasas • Hidrolasas – Catalizan la rotura de enlaces por adición de agua • Esterasas, fosfatasas, peptidasas • Liasas – Catalizan la eliminación de grupos para formar un doble enlace • Descarboxilasas, deshidratasas, desaminasas • Isomerasas – Catalizan reordenamientos moleculares • Epimerasas, mutasas • Ligasas – Catalizan formaciones de enlace entre dos sustratos, con energía aportada por la hidrólisis de ATP
Cofactores Enzimáticos 7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Componentes no proteicos requeridos para la actividad de la enzima – Apoenzima + cofactor = holoenzima – Dos tipos • Iones metálicos – Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, ... • Coenzimas – Moléculas orgánicas pequeñas, muchas son derivadas de las vitaminas – Su carencia produce enfermedades
Nociones de Cinética Química • En condiciones de equilibrio • Velocidad de reacción 8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Velocidad Consumo de A Formación de B Constante de velocidad A B k1 k -1 En el equilibrio v = 0
Nociones de Cinética Química A B C • Reacciones sucesivas – La velocidad depende del paso más lento k1 k2 Si k2 << k1, entonces B C es el paso limitante de la reacción, y la velocidad depende sólo de k2 k2 B = Intermediario 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) – Cuando la primera reacción es reversible, la llamamos preequilibrio A B C k1 k -1 k2 Si k2 << k-1, entonces A y B pueden llegar virtualmente al equilibrio, y decimos que se alcanza un estado estacionario
Cinética de la Catálisis Enzimática Producto Complejo enzima-sustrato (intermediario) Preequilibrio E + S ES E + P k1 k -1 k2 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fase de catálisis: transformación de S en P y recuperación de E Fase de afinidad: unión de S al centro activo de E y formación del complejo ES Es el paso limitante Constante de disociación del complejo ES Constante catalítica (kcat)
Modelo Cinético de Michaelis-Menten 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Relaciona la velocidad de catálisis con la concentración de sustrato • Parte de los siguientes supuestos 1. P no se convierte en S – Es cierto cuando [P] es muy baja (al inicio de la reacción). Consideramos velocidades iniciales (V0) 2. K2 << k-1 – Se alcanza el estado estacionario – [ES] se considera constante 3. [E] << [S] – [S] ≈ [S]inicial
Estado Estacionario 12 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Tiempo Estado Pre-estacionario Concentración Equilibrio Estado estacionario: d [ES] / d t ≈ 0 [E]
Ecuación de Michaelis-Menten E + S ES E + P k1 k -1 k2 1 Velocidad Inicial: 2 En el estado estacionario: Constante de Michaelis 13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) V0 alcanza el valor máximo cuando [ES]=[E]total Ecuación de Michaelis (curva hiperbólica):
Representación de la Ecuación de Michaelis • Se representan valores de velocidad inicial , V0 , para distintos valores de concentración inicial de sustrato [S]1, [S]2, etc • V0 aumenta al aumentar [S], hasta llegar a la saturación ([ES] ≈ [E]total,se alcanza Vmax) • KM representa la [S] para la cual se alcanza la mitad de la Vmax • Vmax es un valor asintótico (se alcanza para [S] = ∞ ). No se puede obtener de la representación hiperbólica 14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Equilibrio Tiempo Producto [S]1 [S]2 [S]3 [S]4 Velocidad de reacción Concentración de sustrato [S]
Linealización de la Ecuación de Michaelis • Para determinar Vmax y KM con precisión la ecuación de Michaelis se transforma en una función lineal • Representación de Lineweaber-Burk (o de dobles inversos) Inverso 15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1/ V0 1/ [S] 1/ Vmax -1/ KM Pendiente: KM / Vmax Pendiente Ordenada en el origen Recta
Significado de la KM 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Dos significados – KM es la [S] para cual V0 = ½Vmax • Representa la [S] necesaria para que ocurra una catálisis significativa – Cuando k2 << k-1 , KM ≈ KS (constante de disociación del complejo ES) • Representa la inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato • KM Tiene unidades de concentración (M) • Para una enzima determinada – KM varía según el sustrato y las condiciones (pH, temperatura, fuerza iónica, ...) ≈
Significado de Vmax y k2 (kcat ) • Vmax revela el número de recambio de la enzima – Número de recambio = kcat • número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por cada molécula de enzima, en condiciones de saturación E + S ES E + P k1 k -1 k2 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1 / kcat es el tiempo necesario para la conversión de una molécula de sustrato en producto (un ciclo catalítico) Unidades : M s-1 Unidades: s-1 Unidades: M
Eficacia Catalítica (kcat / KM ) • En condiciones fisiológicas las enzimas no se encuentran saturadas ([S] < KM ) – En estas condiciones 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Constante de velocidad para la interacción entre E y S • Representa la eficacia catalítica de la enzima • Sirve para comparar la preferencia de una enzima por diferentes sustratos • Unidades: M-1s-1
Inhibición Enzimática 19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Inhibición: Disminución de la actividad de una enzima por acción de un inhibidor – Irreversible • El inhibidor se une fuertementa a la enzima – Ejemplos: » La ampicilina: Modifica covalentemente una transpeptidasa responsable de la síntesis de la pared celular bacteriana » La aspirina: Modifica covalentemente una ciclooxigenasa que produce señales inflamatorias – Reversible • El inhibidor se une a la enzima por enlaces débiles, y el complejo EI se encuentra en equilibrio con las formas libres
Inhibición Reversible Competitiva 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Sin inhibidor [S] Velocidad de reacción Sustrato Inhibidor competitivo • El inhibidor se une a la enzima libre – Compite con el sustrato • Puede ser superada a [S] elevada. No afecta a la Vmax (ni a la kcat ) • Afecta a la KM – Aumenta (KM aparente > KM ) – Suelen ser moléculas similares al sustrato o análogos del estado de transición
Inhibición Reversible No Competitiva Sustrato Inhibidor no competitivo 21 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • El inhibidor se une tanto al E y como al complejo ES – Se une en un sitio distinto del sitio activo • No se supera con [S] elevada • Vmax disminuye – Vmax aparente < Vmax • No afecta a La KM Velocidad de reacción Sin inhibidor [S]
22 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Análisis Gráfico de la Inhibición Inhibición competitiva + Inhibidor competitivo Sin inhibidor + Inhibidor no competitivo Sin inhibidor Inhibición no competitiva -1/KM -1/KM ap 1/Vmax -1/KM -1/Vmax ap 1/Vmax
Mecanismos Moleculares de Regulación Enzimática 23 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Permiten la adaptación de la actividad a necesidades fisiológicas, estados del desarrollo o condiciones ambientales – Regulación temporal/espacial • Utilización de isoenzimas – Regulación lenta • Control de la disponibilidad y de la vida media de la enzima – Regulación rápida • Control alostérico • Modificación covalente – Reversible – Irreversible
Isoenzimas 24 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Son distintas formas de una misma enzima – Enzimas homólogas presentes en un mismo organismo • Cada isoenzima en un tejido diferente o en un momento del desarrollo diferente • Catalizan la misma reacción, con pequeñas diferencias – Pequeñas diferencias en su secuencia » Diferencias en su estructura » Distintos valores de KM y/o Vmax » Distintas propiedades reguladoras
Vida Media y Disponibilidad de las Enzimas 25 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Muchas enzimas presentan una vida media corta – En las células existe un recambio proteico constante – La concentración de las enzimas se encuentra regulada • A través de la regulación de su síntesis – Regulación de la transcripción y de la traducción • A través de la regulación de su degradación – Mediada por ubiquitina y ejecutada por el proteasoma
Enzimas Alostéricas 26 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Contienen varios centros y varias subunidades – Centros activos – Centro reguladores • Efecto alostérico – A través de cambios conformacionales • Alosterismo homotrópico – Entre centros equivalentes • Cooperatividad – Curvas sigmoides – No siguen la cinética de Michaelis-Menten • Alosterismo heterotrópico – De centros reguladores sobre centros activos sustrato [sustrato] V V Estado R Estado T
27 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ejemplo de Enzima Alostérica Carbamilfosfato Aspartato + N-carbamilaspartato Aspartato transcarbamilasa ATCasa Citidin trifosfato CTP Producto final de la ruta Primer paso de la ruta de síntesis de nucleótidos de pirimidina Ruta de 9 pasos ATP Purinas Producción energética Activación R e t r o - i n h i b i c i ó n
Estructura de la ATCasa Estructura cuaternaria: dos trímeros catalíticos + tres dímeros reguladores 28 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
Regulación Alostérica de la ATCasa Mecanismo de inhibición: Los inhibidores estabilizan las formas de baja afinidad (o formas T) Mecanismos de cooperatividad y de activación: Los sustratos y los activadores estabilizan las formas de alta afinidad (o formas R) 29 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Estado T (menos activo) Estado R (más activo) Favorecido por la unión del Inhibidor (CTP) Favorecido por la unión de los sustratos y del activador (ATP)
Activación e Inhibición Alostérica Inhibición Activación 30 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Mayor actividad y curva más sensible a la concentración de sustratos Menor actividad y curva menos sensible a la concentración de sustratos
Modificación Covalente 31 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Irreversible – Activación por rotura proteolítica de precursores inactivos (zimógenos) • Enzimas de la digestión • Cascada de coagulación • Activación de caspasas en apoptosis • Reversible – Unión covalente de un grupo químico que altera las propiedades catalíticas de la enzima • Fosforilación- desfosforilación • Oxidación-reducción • Acetilación- desacetilación
Cascada de la Coagulación 32 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
Regulación por Fosforilación Reversible 33 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Fosforilación – Transferencia de grupo fosforilo desde el ATP a grupos –OH de Ser Thr o Tyr – Cataliza por proteínas quinasa – A menudo desencadenan efectos amplificados • Una sola quinasa activa centenares de otras enzimas que. A su vez cada una de ellas activará centenares de otras enzimas, ... • Desfosforilación – Eliminación de grupo fosforilo de proteína fosforilada – Catalizada por proteína fosfatasa
Regulación de rutas Metabólicas • Control a nivel de sustrato – La acumulación de producto inhibe la acción de la enzima • Control por retroinhibición – El producto final de una ruta inhibe el primer paso de la ruta Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP Hexoquinasa Inhibición 34 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) A B C D N Retroinhibición
Estructura y Función de los Ácidos Nucleicos Tema 5 1ª Parte: Estructura de los Ácidos Nucleicos 1 J. Salgado (UVEG - 2005)
2 J. Salgado (UVEG - 2005) Los Ácidos Nucleicos son Polímeros de Nucleótidos Azúcar Azúcar Azúcar Azúcar Azúcar Fosfato Fosfato Fosfato Fosfato Fosfato Ácido Nucleico Esqueleto azúcar-fosfato Ribosa Desoxirribosa 5’ 3’ DNA y RNA se diferencian en el azúcar: En RNA En DNA Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico Átomos numerados con “primas”
3 J. Salgado (UVEG - 2005) Las Bases Pueden ser Purinas o Pirimidinas Purinas Pirimidinas Purina Pirimidina Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Uracilo (U) Timina (T) Átomos numerados sin “primas” En el DNA se encuentran A, G, C y T En el RNA se encuentran A, G, C y U
4 J. Salgado (UVEG - 2005) Nucleótidos: Unidades Monoméricas de los Ácidos Nucleicos Nucleósido: Base + Azúcar Enlace β-glicosídico Ribosa A Adenosina Nucleótido: Nucleósido + Fosfato Enlace fosfoéster Ribosa A Adenosina 5’-trifosfato o adenilato 5’-trifosfato (5’-ATP) En el RNA: adenosina, guanosina, citidina, uridina En el DNA: desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina, desoxitimidina En el RNA: adenilato, guanilato, citidilato, uridilato En el DNA: desoxiadenilato, desoxiguanitato, desoxicitidilato, desoxitimidilato 1’ 9 5’
La Cadena de Nucleótidos: Estructura Primaria Enlace fosfodiéster Esqueleto azúcar- fosfato DNA RNA Esqueleto azúcar- fosfato 5 J. Salgado (UVEG - 2005) 5’ 3’ Las secuencias de nucleótidos se escriben siempre en la dirección 5’ Æ 3’
Estructura Secundaria del DNA 6 J. Salgado (UVEG - 2005) • La molécula de DNA se pliega localmente como una doble cadena heliciodal – Modelo de James Watson y Francis Crick (1953). Basado en: • Patrón de difracción de rayos X de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin • Reglas de Erwin Chargaff – Las proporciones A:T y G:C son siempre cercanas a 1
7 J. Salgado (UVEG - 2005) La Doble Hélice del DNA “B” • Dos cadenas antiparalelas complementarias – Doble hélice a derechas – Plano de las bases perpendicular al eje de la hélice – ~10 pares de bases (pb) por vuelta • 3,4 Å entre bases • 36º de giro cada base Surco mayor Surco menor Desde arriba Cadenas azúcar- fosfato Bases Apiladas 5’ 3’ 3’ 5’
Apareamiento entre Bases 8 J. Salgado (UVEG - 2005) Guanina Citosina Adenina Timina • Interacción específica entre pares purina- pirimidina – Tres enlaces de H entre G y C – Dos enlaces de H entre A y T • Adaptado a la anchura de la hélice • Facilita la replicación • Los apareamientos erróneos causan mutaciones
Estabilidad de la Doble Hélice 9 J. Salgado (UVEG - 2005) • Enlaces por puente de hidrógeno entre las bases – Son más estables las uniones C≡G (tres enlaces) que las A=T (dos enlaces) • Efecto hidrofóbico – Interacciones hidrofóbicas entre las bases apiladas en el centro de la hélice • Fuerzas de van de Waals debidas al empaquetamiento de los anillos de las bases • Fuerzas electrostáticas – El DNA es un “polianión”. La repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato se reduce por apantallamiento con • Cationes divalentes (Mg2+) • Proteínas básicas, ricas en Lys y Arg (Histonas) • Poliaminas
Desnaturalización del DNA 10 J. Salgado (UVEG - 2005) Efecto hipercrómico: La absorbancia a 260 nm de las bases apiladas en la doble hélice es menor que en las hebras sencillas Absorbancia Temperatura Temperatura de fusión Longitud de onda (nm) Absorbancia Doble hélice Cadena sencilla Curva de fusión Doble hélice Cadena sencilla • Al calentar el DNA se separan las dos hebras de la doble hélice – La temperatura de fusión (Tm) depende de la proporción de pares C≡G frente a A=T – El proceso es reversible y cooperativo – En las células está catalizado por enzimas helicasas, e implica la hidrólisis de ATP
Otras Estructuras Secundarias del DNA 11 J. Salgado (UVEG - 2005) • El DNA de cadena doble puede asumir distintas conformaciones debido a la flexibilidad del anillo de ribosa y al giro del enlace C1’—N – DNA “B” (de Watson y Crick) • En condiciones de humedad elevada – DNA “A” • En DNA parcialmente deshidratado • 11 pb por vuelta, diámetro=26 Å • Semejante a los dúplex de RNA y RNA/DNA – DNA “Z” • Hélice a izquierdas • 12 pb por vuelta, diámetro=18 Å • Puede aparecer en zonas con repeticiones CG • Posible función en la regulación de la expresión génica
Superenrollamiento DNA circular relajado • Surge al girar una cadena doble de DNA cuyos extremos están fijos – Puede ser positivo (DNA sobre-enrollado) o negativo ( DNA infra-enrollado) • Es más común el negativo, y tiene importancia en los procesos de replicación y transcripción – Da lugar a una molécula más compacta 12 J. Salgado (UVEG - 2005) Relajado Superenrollado DNA circular superenrollado
Superenrollamiento in vivo 13 J. Salgado (UVEG - 2005) • El superenrollamiento es un proceso catalizado que requiere energía de la hidrólisis de ATP – Llevado a cabo por las topoisomerasas • Topoisomerasas de tipo I – Catalizan el relajamiento del DNA superenrollado por corte de una de las hebras • Topoisomerasas de tipo II – Introducen superenrollamiento negativo por corte y giro de las dos hebras • En procariotas – Asociación del DNA a un núcleo central de proteínas – Superenrollamiento en “trenza” • En eucariotas – Asociación del DNA a núcleos sucesivos de proteínas – Superenrollamiento solenoidal compacto
Genomas 14 J. Salgado (UVEG - 2005) • Se llama genoma al conjunto completo de información genética de un organismo – Se hereda de generación en generación – Codificado en secuencias de ácidos nucleicos – Organizado en cromosomas • Cada cromosoma contiene una sola molécula de DNA • Los genomas se diferencian por su tamaño y complejidad – En procariotas • Un solo cromosoma de DNA circular de cadena doble • Puede haber DNA extracromosómico circular de cadena doble (llamado plásmido) – En eucariotas • Múltiples cromosomas de DNA lineal de cadena doble • Genoma diploide, excepto en gametos (haploide) • Gran cantidad de DNA no codificador • Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genoma propio (similar al genoma de procariotas) – En virus • Genoma de DNA o RNA, de cadena simple o doble, circular o lineal
El Cromosoma Bacteriano 15 J. Salgado (UVEG - 2005) • Forma una estructura llamada nucleoide – DNA circular de cadena doble, superenrollado y unido a un núcleo central proteico • Tetrámeros de la proteína HU • Poliaminas catiónicas – Le permite comprimirse en un espacio pequeño • Cromosoma extendido (3x106 pb) Æ 1,5 mm • Cromosoma empaquetado Æ 2 µm Centro proteico Bucle relajado Bucles superenrollados Cromosoma de Escherichia coli
Cromosomas Eucariotas 16 J. Salgado (UVEG - 2005) Diámetro del cromosoma Cromatina Histonas Nucleosoma Fibra condensada DNA Cromosoma • DNA lineal empaquetado alrededor de octámeros de histonas – Las histonas asociadas a DNA forman unidades repetidas cada 200 pb, llamadas nucleosomas – El conjunto se asocia en una fibra condensada que forma la cromatina – Se consigue una elevada compactación – La estructura de la cromatina regula la expresión génica
Estructura de los Nucleosomas 17 J. Salgado (UVEG - 2005) • Unidades repetidas cada 200 pb – Nucleosoma: octámero de histonas + DNA enrollado (145 pb) – Las histonas son proteínas policatiónicas • Muchas Lys y Arg • Estabilización electrostática del DNA (son polianiones) – Cinco tipos de histonas • 2 x (H2A, H2B, H3, H4) forman el núcleo octamérico • H1 interacciona con el DNA conector y delimita al nucleosoma – Modificaciones covalentes de las histonas regulan la funcionalidad del DNA • Acetilación, metilación, fosforilación Núcleo de histonas Nucleosomas DNA enrollado (145 pb) DNA conector
Tipos de RNA 18 J. Salgado (UVEG - 2005) • RNA mensajero (mRNA) – Se transcribe en el núcleo a partir de la secuencia de DNA de los genes. Su secuencia será leída en el citoplasma para dar lugar a proteínas específicas • RNA de transferencia (tRNA) – Transporta los aminoácidos hasta los ribosomas para formar las proteínas – Existen tipos específicos para cada aminoácido – Contienen diversas bases modificadas • RNA ribosómico (rRNA) – Principal componente de los ribosomas (formados también por proteínas) • RNA nuclear heterogeneo (hnRNA) – Transcritos primarios y precursores del mRNA en células eucariotas • RNA nuclear pequeño (snRNA) – En partículas ribunucleoproteicas nucleares. Participan en el procesamiento de otros RNA
Estructura de los RNA 3’ 5’ 3’ 5’ Bucle Brazo Estructura primaria Estructura secundaria 19 J. Salgado (UVEG - 2005) • La mayoría son cadenas sencillas plegadas sobre sí mismas – No tienen aplicación las reglas de Chargaff • Excepción: Algunos virus de RNA de cadena doble – Distintos tipos de estructura secundaria • Bucles, horquillas, brazos • Regiones dúplex con apareamientos C≡G (tres enlaces de H) y A=U (dos enlaces de H) entre zonas palindrómicas complementarias – Forman hélices dextrógiras similares a las de el DNA – Adoptan una estructura terciaria compleja, por asociación de hélices y bucles Región palindrómica (autocomplementaria) 3’ 5’ Estructura terciaria de un tRNA
Estructura de los tRNA 20 J. Salgado (UVEG - 2005) Brazo aceptor Anticodón Brazo del anticodón Brazo variable Brazo TΨC Bucle del anticodón Bucle TΨC Brazo DHU Bucle DHU Sitio de unión del aminoácido activado Bucle DHU Bucle del anticodón Bucle TΨC Extremo CCA 5’ 3’ • Estructura adaptada a su función • Forma de trébol – Cuatro brazos principales con zonas dúplex • Brazo aceptor –Une el aminoácido activado en el extremo CCA 3’ • Brazo del anticodón –Contiene la secuencia complementaria de los codones del mRNA • Contiene múltiples bases modificadas – Derivados metilados y dimetilados de A, U, C y G; pseudouridina (Ψ), dihidrouridina (DHU)
Estructura del Ribosoma • Maquinaria de síntesis de las proteínas de gran tamaño molecular –Coeficiente de sedimentación 70S (Svedberg) en procariotas • Complejo ribonucleoproteico: 2/3 rRNA + 1/3 proteínas • Dos subunidades –50S (contiene rRNA 5S y 23 S + 34 polipéptidos) –30S (contiene rRNA 16 S + 21 polipéptidos) 21 J. Salgado (UVEG - 2005) Subunidad 50S Ribosoma (70S, 2700 kDa) Subunidad 30S
Estructura del rRNA Estructura terciaria del rRNA 16S: Determinada mediante cristalografía de rayos X Estructura secundaria del rRNA 16S: Puede deducirse a partir de zonas de complementariedad de su secuencia 22 J. Salgado (UVEG - 2005)
Tema 5 2ª Parte: Procesos del Metabolismo Informacional 23 J. Salgado (UVEG - 2005)
Principios Fundamentales de la Biología Molecular 1. La información codificada en el DNA consiste en una secuencia específica de bases nitrogenadas – La REPLICACIÓN se basa en el apareamiento específico entre las bases de cadenas de DNA complementarias 2. La descodificación de la información genética para su utilización comporta la síntesis de RNA – La TRANSCRIPCIÓN se basa en el apareamiento específico entre bases de cadenas de DNA y cadenas de RNA 3. Con la intervención de varios tipos de RNA se sintetizan las proteínas, que son responsables de la mayoría de las funciones celulares – La TRADUCCIÓN de las secuencias de bases en secuencias de aminoácidos ocurre de acuerdo con el código genético 24 J. Salgado (UVEG - 2005) DNA RNA Proteínas transcripción traducción replicación
Replicación 25 J. Salgado (UVEG - 2005) Molécula parental original Primera generación de moléculas hijas Segunda generación de moléculas hijas • Síntesis de copias nuevas de DNA a partir de un “molde” preexistente – Ocurre una sola vez en la vida de la célula, antes de la división celular – Proceso rápido y exacto, con mecanismos de reparación eficaces – Siempre se da en la dirección 5’ Æ 3’ • La replicación es semi- conservadora – Cada hebra de una cadena doble de DNA sirve de molde para la síntesis de una hebra complementaria
Requerimientos para el Proceso de Replicación 26 J. Salgado (UVEG - 2005) •Molde de DNA preexistente –Cadena (o fragmento de cadena) simple •Cebador (“primer”) –Pequeño fragmento de RNA (~5 nucleótidos) con el grupo 3’-OH libre, unido al DNA molde (sintetizado por la primasa del primosoma) •Precursores activados –Desoxinucleótidos 5’-trifosfato (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) •DNA-polimerasas –Catalizan la formación de enlaces fosfodiéster dirigida por un molde de DNA (actividad polimerasa 5’ Æ 3’) y la corrección de errores (exonucleasa 3’ Æ 5’) –Requieren Mg2+ y un cebador con su extremo 3’-OH libre –Tres tipos: •DNA polimerasa I (Pol I): Elimina el cebador mediante una actividad exonucleasa 5’ Æ 3’ y sintetiza DNA en su lugar •DNA polimerasa II (Pol II): Función desconocida (quizá similar a la Pol I) •DNA polimerasa III (Pol III): Síntesis de la nueva cadena de DNA a partir del cebador •Otras enzimas –Primasa: RNA polimerasa que sintetiza el cebador. Forma parte del primosoma –Helicasa (Dna B): Separa las dos hebras del DNA dúplex. Requiere ATP –Girasa (topoisomerasa II): Genera superenrollamiento negativo. Requiere ATP –Ligasa: Une fragmentos nuevos sintetizados
27 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Replicación: Iniciación 1. La replicación se inicia en lugares específicos – En procariotas el origen es único, y se llama locus oriC • Contiene secuencias de ricas en AT y cuatro sitios de unión para la proteína DnaA – La unión de la DnaA inicia el proceso 2. La helicasa, DnaB, separa las dos hebras de DNA – Se forman un ojo y dos horquillas de replicación – El proceso genera tensión (enrollamiento) que es relajada por la acción la girasa • Topoisomerasa II que introduce superenrollamiento negativo (con consumo de ATP) 3. Las cadenas simples se estabilizan por las SSB (proteínas de unión a cadena simple) Secuencia consenso (13 pb) secuencias ricas en AT en tandem Sitios de unión para la proteína DnaA Origen de replicación en E. coli tetrámeros SSB en las horquillas de replicación ojo de replicación horquilla de replicación ATP helicasa ADP+Pi girasa girasa
28 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Replicación: Elongación 4.La primasa del primosoma sintetiza cebadores de RNA sobre las hebras simples de la horquilla 5.La Pol III sintetiza nuevo DNA a partir del cebador – Siempre en dirección 5’Æ3’ • La hebra guía se sintetiza de manera continua • La hebra retardada forma un bucle donde la síntesis de DNA ocurre de manera discontinua en fragmentos de Okazaki 6.La Pol I elimina los RNA cebadores y sintetiza DNA en su lugar – Tiene actividad exonucleasa 5’Æ3’ y polimerasa 5’Æ3’ 7.Los fragmentos de la hebra retardada son ligados por la DNA ligasa Helicasa Hebra retardada Proteínas SSB Primosoma 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ Primasa Holoenzima DNA Pol III 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Girasa Hebra guía DNA Pol I DNA ligasa Fragmentos de Okazaki Cebador
29 J. Salgado (UVEG - 2005) La maquinaria de replicación Girasa (topoisomerasa) Avance de la horquilla Primosoma Proteína abrazadera Dímero de Pol III Proteína pinza Cadena guía Cadena retardada Ligasa Pol I Fragmento de Okazaki Cebador (RNA) Proteínas de Unión a cadena simple (SSB) Helicasa Cebador Replisoma Holoenzima Pol III: Dímero asimétrico Sintetiza la cadena guía Sintetiza la cadena retardada
Mutaciones 30 J. Salgado (UVEG - 2005) • Cambios en la secuencia del DNA. Tipos: –Sustitución de un par de bases por otro –Eliminación (deleción) de parte de la secuencia –Inserción de pares de bases • Pueden ocurrir de manera espontánea –Transiciones A<>G o T<>C debidas a tautomerizaciones • Amino (-NH2) Æ imino (=NH) • Ceto ( ) Æ enol ( ) • Pueden deberse a agentes mutagénicos –Radiación ultravioleta –Reactivos químicos –Moléculas aromáticas planas (agentes intercalantes) Citosina Tautómero imino de Adenina Mutación por tautomerización: Apareamiento anómalo Æ transición Mutación por radiación: La luz ultravioleta produce dímeros de pirimidina C=O C-OH Dímero de timina
31 J. Salgado (UVEG - 2005) Mecanismos de Reparación • El nivel de fidelidad de las copias de DNA es muy alto, debido a: –La especificidad enzimática de la maquinaria replicativa –La corrección de errores de las DNA polimerasas mediante “prueba de lectura” • Detectan nucleótidos incorrectos y los eliminan “hacia atrás” (actividad exonucleasa 3’Æ5’) –Los mecanismos de reparación post-replicativos • Reparación directa • Reparación por escisión de bases • Reparación por escisión de nucleótidos • Reparación directa –La región dañada se corrige “in situ” • La DNA fotoliasa utiliza energía de la luz para eliminar los dímeros de pirimidina formados por radiación UV • Por escisión de bases –Las bases dañadas se retiran y se reemplazan • Por escisión de nucleótidos –Se elimina y se reemplaza un fragmento en torno a la zona dañada • La escinucleasa urvABC escinde 12 nucleótidos en la zona dañada • Regeneración a cargo de la DNA Pol I y la DNA ligasa
Replicación en Eucariotas • Los eucariotas poseen cinco DNA polimerasas – α, inicia la síntesis – β, función de reparación – δ, elongación – ε, papel desconocido – γ, replicación del genoma mitocondrial 32 J. Salgado (UVEG - 2005) • Más compleja y más lenta que en procariotas – Por el mayor tamaño y complejidad del genoma • Múltiples orígenes de replicación – Cada uno representa una unidad de replicación (replicón) bidireccional • La replicación se encuentra regulada de acuerdo con el ciclo celular – Síntesis de DNA limitada a la fase S, y coordinada con la división celular (mitosis) Ciclo celular Comienza la síntesis de DNA Comienza la mitosis
Expresión Génica 33 J. Salgado (UVEG - 2005) • Expresión de la información genética (secuencias de DNA) – Síntesis de las moléculas que realizan funciones • Principalmente proteínas • El molde para la síntesis de proteínas es mRNA – Además, tRNA y rRNA participan en la síntesis de proteínas • La expresión génica consta de dos procesos – Transcripción • Síntesis de los RNA a partir de DNA molde – Traducción • Síntesis de proteínas a partir de un molde de mRNA Cromosoma Genes Transcripción DNA (genoma) Transcrito RNA (transcriptoma) Proteína (proteoma) Traducción
Transcripción • Síntesis de RNA a partir de un “molde” de DNA – Siempre se da en la dirección 5’Æ3’ – No requiere cebador – Implica segmentos cortos (regiones codificadoras) que no se transcriben necesariamente de manera simultanea – Ocurre múltiples veces a lo largo de la vida de la célula • Sólo una hebra del DNA actúa como molde – El nuevo RNA es complementario de la hebra molde (-) – El nuevo RNA tiene la misma secuencia que la hebra codificadora (+), pero tiene U en lugar de T • Como referencia, la dirección de la hebra codificadora se utiliza como dirección del gen 34 J. Salgado (UVEG - 2005) RNA polimerasa Enrollamiento Desenrollamiento Hebra molde Hebra codificadora RNA naciente Doble hélice híbrida RNA-DNA Avance de la polimerasa Punto de elongación
Requerimientos para la Transcripción 35 J. Salgado (UVEG - 2005) RNA polimerasas De procariotas De eucariotas Inicio de la transcripción Secuencia Consenso (caja TATA o Pribnow) +1 -10 Unidad de transcripción Terminador Promotor +1 -35 -10 • Unidad de transcripción de DNA con promotor y terminador – Promotor: secuencia específica de tamaño variable • En ella se encuentran dos secuencias consenso a ~ -35 y -10 pb con respecto al sitio de inicio • RNA polimerasa – Complejo de cinco tipos de polipéptidos: α, β, β’, ω, σ • El factor σ reconoce el sitio de inicio permite la unión a la cadena molde • α2, β, β’ y ω forman la enzima central que cataliza la síntesis de RNA • No tiene actividad nucleasa (no puede corregir errores) • Nucleótidos activados – CTP, GTP, ATP, UTP
36 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Transcripción: Iniciación 1.La holoenzima α2ββ’ωσ reconoce al promotor de una unidad de transcripción –El reconocimiento se debe al factor σ • Existen distintos factores σ para distintos tipos de promotores 2.Apertura del promotor –Desenrollamiento y separación de las cadenas de DNA en la zona de inicio 3.Unión del primer nucleótido trifosfato a la RNA polimerasa – Suele ser ATP o GTP – Se une por apareamiento de bases a la hebra molde de DNA Apertura del promotor DNA de doble hélice DNA desenrollado (abiertos 17 pb) RNA polimerasa
37 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Transcripción: Elongación RNA polimerasa Enrollamiento Desenrolla- miento Hebra molde Hebra codificadora RNA naciente Doble hélice híbrida RNA-DNA Avance de la polimerasa Punto de elongación P P P OH X 5’ 3’ Burbuja de transcripción 4.Unión de sucesiva de los siguientes nucleótidos – Cada uno se une al 3’-OH libre del anterior por enlace fosfodiéster – Se van seleccionando por apareamiento específico con la hebra de DNA molde • Se forma una hélice dúplex híbrida DNA/RNA de ~8 pb – La región que contiene la RNA polimerasa y la hélice híbrida se llama burbuja de transcripción 5.Avance de la burbuja – La hélice de DNA se va desenrollando por delante y enrollando por detrás – El factor σ se suelta. α2ββ’ω continúa hasta la terminación Unión sucesiva de nuevos nucleótidos X P P P P OH Y YTP PPi 3’ 5’ Enlace fosfodiéster
38 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Transcripción: Terminación 6. Llegada a la señal de terminación en la hebra molde – Secuencia palindrómica rica en GC seguida de secuencia rica en AT • Se forma una estructura en horquilla en el RNA transcrito • La polimerasa se para y el híbrido DNA/RNA se vuelve inestable • La transcripción finaliza en los residuos de U que siguen a la horquilla 7. Disociación – Disociación del híbrido DNA/RNA – Fusión y enrollamiento del DNA abierto – Desprendimiento de la RNA polimerasa • Terminación dependiente del factor ρ (en algunos casos) – Actividad DNA/RNA helicasa, dependiente de ATP, que disocia el complejo de transcripción Región palindrómica (autocomplementaria) Oligo poliU Señal de terminación Terminación dependiente del factor ρ Factor ρ (hexámero) RNA polimerasa DNA/RNA RNA 5’
39 J. Salgado (UVEG - 2005) Regulación de la Transcripción (en Procariotas) • Constituye el control más importante de la expresión génica • La afinidad de la RNA polimerasa por el promotor es el primer nivel de control – Depende de la secuencia del promotor y del tipo de factor σ • Genes de expresión constitutiva – Son transcritos continuamente • Genes inducibles – Su transcripción varía según las condiciones o las necesidades metabólicas • Se regulan a través de centros operadores – secuencias reguladoras cercanas al promotor • Algunos genes que participan en una misma adaptación regulan su expresión de manera conjunta – Forman unidades de expresión llamadas operones
Modelo del Operón de Jacob y Monod 40 J. Salgado (UVEG - 2005) • Gen regulador (i) – Contiene su propio promotor – Codifica la proteína represora (represor) • Operón. Consta de: – Secuencias de regulación • Promotor • Operador – Genes estructurales • Codifican proteínas que participan en una misma adaptación • Puede regularse por inducción o por represión Esquema general del modelo del operón Gen regulador Centros de control Genes estructurales Operón Esquema del operón de la lactosa Operón de la lactosa
Inducción: El Operón de la Lactosa En ausencia de lactosa 41 J. Salgado (UVEG - 2005) • Regula en paralelo la expresión de enzimas relacionadas con la utilización de lactosa en ausencia de glucosa – β-galactosidasa (z) – Galactosido permeasa (y) – Tiogalactosido transacetilasa (a) • En ausencia de lactosa – No hay inductor – El represor sin inductor se une al operador – Impide a la RNA polimerasa transcribir z, y, a • En presencia de lactosa – Se forma el inductor alolactosa – El represor con inductor inactiva al represor – Los genes z, y, a se transcriben En presencia de lactosa El represor unido al centro operador bloquea la transcripción de los genes z, y, a Represor β-galactosidasa Permeasa Trans- acetilasa Inductor Alolactosa (o molécula análoga) Metabolismo de la lactosa RNA pol bloqueada RNA pol no bloqueada
Represión: El Operón del Triptófano 42 J. Salgado (UVEG - 2005) trpL trpE trpD trpC trpB trpA o p trpR p En ausencia de Trp RNA pol no bloqueada mRNA mRNA Enzimas de la síntesis del Trp Represor inactivo trpL trpE trpD trpC trpB trpA o p trpR p En presencia de Trp RNA pol bloqueada mRNA Represor inactivo Represor activo Trp (corepresor) • Regula en paralelo la expresión de enzimas relacionadas con la síntesis de Trp • El Trp actúa como “corepresor” • En ausencia de triptófano – El represor no puede unirse al operador – La RNA polimerasa transcribe los genes relacionados con la síntesis de Trp • En presencia de Trp – El Trp se une al represor – El complejo activo represor/Trp se une al operador – La RNA polimerasa queda bloqueada
Procesamiento Post-transcripcional en Procariotas 43 J. Salgado (UVEG - 2005) Ribonucleasa P tRNA Ribonucleasa III Ribonucleasa III rRNA 16S rRNA 23S rRNA 5S 5’ 3’OH tRNA 5’ CCA-3’OH 1- Corte 2- adición de CCA tRNA maduro 5’ CCA-3’OH 3- Modificación de bases • Procesamiento: – Modificación Post- transcripción de algunos RNA transcritos – Transcrito primario • RNA recién sintetizado, no modificado • En procariotas – Los mRNA no se procesan – Los rRNA y tRNA se obtienen por corte y modificación de transcritos primarios • Intervienen RNAs catalíticos
Transcripción en Eucariotas 44 J. Salgado (UVEG - 2005) • Tiene lugar en el núcleo • Existen tres tipos de RNA polimerasas (cada una reconoce un tipo de promotor) – RNA polimerasa I • Sintetiza precursores de los rRNA – RNA polimerasa II • Sintetiza precursores de los mRNA – RNA polimerasa III • Sintetiza precursores de los tRNA • Promotores complejos y secuencias potenciadoras – Caja TATA entre –30 y –100 – Otras secuencias (caja CAAT, caja GC) • Son necesarios los “factores de transcripción” – Se unen a los promotores y secuencias potenciadoras – Guían la unión de la polimerasa
Procesado en Eucariotas 45 J. Salgado (UVEG - 2005) • En eucariotas, todos los productos de la transcripción deben procesarse • En los pre mRNA se modifican los extremos 5’ y 3’ – Casquetes 5’: en el extremo 5’ se añade 7-metilguanosina y se metilan algunas ribosas – En el extremo 3’ se añade una cola de poli(A) de ~250 residuos • Maduración: – Eliminación de intrones por corte y empalme • Llevada a cabo por partículas ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (snRNPs) – Contienen RNA catalítico (ribozimas) • El conjunto mRNA + snRNPs se llama espliceosoma – Algunos RNA son capaces de automadurarse (RNA autocatalítico) Pre mRNA 5’ 3’ 7 7-metil- guanosina 2’-metilribosa 2’ Espliceosoma Complejo U4-U5-U6 Pre mRNA Exón 1 Exón 2 Intrón
Traducción 46 J. Salgado (UVEG - 2005) • Síntesis de proteínas a partir de un molde de mRNA – En procariotas ocurre inmediatamente después de la transcripción • El transcrito primario sirve de mRNA • Transcripción y traducción pueden ocurrir simultáneamente – En eucariotas está separada de la transcripción en espacio y tiempo • El transcrito primario se procesa y el mRNA se transporta fuera del núcleo • Permite una regulación más compleja Expresión de proteínas en procariotas Ribosoma Proteína naciente Ribosoma Proteína naciente Expresión de proteínas en eucariotas Núcleo Transcrito primario Citosol Transporte Procesado
Requerimientos para la Traducción 47 J. Salgado (UVEG - 2005) • mRNA – Molde con la secuencia organizada en codones • Los codones son tripletes de bases del mRNA • Son “leídos” por apareamiento específico con anticodones de los aminoacil-tRNA • Debe contener al menos una pauta abierta de lectura – En procariotas suelen existir mRNAs policistrónicos (o poligénicos) que contienen varias pautas abiertas de lectura en tandem • Ribosoma – Complejo ribonucleoproteico de rRNA y proteínas – Une el mRNA molde y los distintos tRNA – Cataliza la formación de los enlaces peptídicos de la nueva proteína • tRNA – Específicos para cada uno de los 20 aminoácidos (al menos uno por aminoácido) • Transportan los aminoácidos activados hasta el ribosoma – Cada uno contiene un anticodón (complementario con un codón del mRNA) • Aminoacil-tRNA sintetasas – Activan y unen un aminoácido a cada tRNA • Específicas para cada aminoácido • Interpretan el código genético – Requieren ATP • Diversos factores proteicos
Características del Código Genético 48 J. Salgado (UVEG - 2005) • Es la relación entre la secuencia de bases del DNA (o de su mRNA transcrito) y la secuencia de aminoácidos de las proteínas – Codón: grupo de tres bases que codifican un aminoácido – Las secuencias se leen a partir de un punto de inicio (AUG) • El codón de iniciación establece el marco o pauta de lectura – El resto de codones se leen a partir del de iniciación – El código no solapa – El código está degenerado • 64 tripletes posibles para 20 aminoácidos más la parada – Todos los aminoácidos, excepto Trp y Met, se codifican por más de un codón – Hay tres codones de terminación (UAA, UAG y UGA) – Los codones sinónimos difieren casi siempre en la última base (las dos primeras especifican la identidad del aminoácido) – El código genético es casi universal • Las mitocondrias y los protozoos ciliados tienen algunos codones diferentes
49 J. Salgado (UVEG - 2005) El Código Genético Primera posición (extremo 5’) Segunda posición Tercera posición (extremo 3’)
Variaciones del Código en Mitocondrias Codón Código estándar Código mitocondrial 50 J. Salgado (UVEG - 2005)
Los tRNA 51 J. Salgado (UVEG - 2005) • Moléculas “adaptadoras” – Se unen a codones específicos y transportan aminoácidos específicos – Anticodón y sitio del aminoácido están en brazos opuestos • Muchas bases poco comunes – Impiden apareamientos normales – Facilitan interacciones especiales • Relacionadas con su estructura terciaria • Relacionadas con interacciones con la aminoacil-tRNA sintetasa y proteínas ribosómicas • Aminoacil-tRNA – Intermediario de la síntesis de proteínas • Éster de tRNA+aminoácido Sitio de unión del aminoácido Nucleósidos modificados UH2: dihidrouridina I: inosina mG: metilguanosina m2G: dimetilguanosina T: ribotimidina ml: metilinosina Ψ: pseudouridina tRNA de la alanina 5’ 3’
Las aminoacil-tRNA sintetasas 52 J. Salgado (UVEG - 2005) • Catalizan la adición de un aminoácido sobre su tRNA – Dos etapas catalizadas por la misma enzima • Activación del aminoácido – Formación del intermediario activado aminoacil-AMP » Se consume ATP y se desprende pirofosfato (PPi) – Una pirofosfatasa hidroliza el PPi para impulsar la reacción » Consume una segunda molécula de ATP • Transferencia del aminoácido activado a su tRNA específico – Se transfiere sobre el grupo 2’-OH o 3’-OH libre del tRNA – Se forma un aminoacil-tRNA mediante enlace éster Aminoacil-tRNA tRNA 3’ Adenina aminoácido
Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas 53 J. Salgado (UVEG - 2005) • Doblemente específicas por reconocimiento molecular – Para cada aminoácido • Reconocen propiedades de carga, hidrofobicidad, tamaño – Para cada tRNA correspondiente • Interaccionan específicamente con el brazo aceptor y con el brazo del anticodón – “Conocen” e interpretan el código genético • Son capaces de corregir errores – Contienen sitios especiales de “revisión” • Si el aminoácido es incorrecto es hidrolizado del tRNA • Alta fidelidad Brazo aceptor Sitio de revisión Sitio de activación Lazo del anticodón tRNA Aminoacil-tRNA sintetasa Complejo treonil-tRNA sintetasa Reconocimiento Específico del Lazo del anticodón
El Ribosoma (Procariota) 54 J. Salgado (UVEG - 2005) Sitio de formación del enlace peptídico (formado por RNA) Estructura del Ribosoma • Coordina las interacciones entre el molde (mRNA) y el adaptador (tRNA) • Complejo supramolecular de RNA y proteínas – La funcionalidad principal se debe a los rRNA (ribozimas) – Tres tipos de rRNA (5S, 16S, 23S) procedentes de un transcrito común (30S) – Dos subunidades • Grande (50S) – Función de catálisis (actividad peptidil transferasa) • Pequeña (30S) – Función de reconocimiento – Las proteínas del ribosoma tienen una función estructural
Sitios de Unión en el Ribosoma 55 J. Salgado (UVEG - 2005) • Sitios de unión para los tRNA – Sitio A •Para la unión de los aminoacil-tRNA – Sitio P •Para la unión del peptidil-tRNA – Sitio E •Sitio de salida del tRNA recién descargado • Sitio de unión del mRNA – En la subunidad 30S •En el rRNA 16S de esta subunidad se encuentra un sitio de reconocimiento de la secuencia de iniciación del mRNA • Vía de salida del nuevo polipéptido – Túnel a través de la subunidad 50S •Conecta con el sitio activo, donde se forma el enlace peptídico Sitio E Sitio P Sitio A 30S 50S Túnel de la subunidad 50S
Características de la Traducción 56 J. Salgado (UVEG - 2005) • La dirección de la síntesis de proteínas es siempre N-terÆC-ter • El mRNA molde se lee en dirección 5’Æ3’ • El aminoácido que se incorpora viene determinado sólo por las interacciones codón-anticodón – Excepto en el caso del 1er aminoácido, donde se reconoce específicamente un aminoacil-tRNA de iniciación por el factor de iniciación 2 (IF2) – Se reconocen principalmente las dos primeras bases del codón (balanceo de las bases) • Existe cierta libertad en el apareamiento de la tercera base • La estereoespecificidad es importante para la formación del enlace peptídico – No pueden utilizarse D-aminoácidos
Señal de Iniciación en Procariotas 57 J. Salgado (UVEG - 2005) • La traducción comienza en un punto específico – El codón de iniciación es AUG (Met) • Se encuentra precedido de la secuencia de Shine- Dalgarno, rica en purinas (G,A) lo que le diferencia de otros AUG internos • La secuencia de Shine-Dalgarno interacciona específicamente con una zona del rRNA 16S rica en pirimidinas (C,U) – El codón de iniciación aparea específicamente con un aminoacil-tRNA iniciador que contiene N-formilmetionina en lugar de metionina (fMet-tRNAf)
Mecanismo de la Traducción: Iniciación 58 J. Salgado (UVEG - 2005) 1.Formación del complejo de iniciación 70S –Previamente se ensambla un complejo de 30S que contiene: • mRNA unido a la subunidad 30S con la secuencia de Shine-Dalgarno interaccionado con rRNA 16S • fMet-tRNAf unido en el sitio P y apareado con el codón de iniciación –El ensamblaje es ayudado por los factores de iniciación IF1, IF2, IF3 • Requiere GTP Subunidad 30S Factores de iniciación Complejo de iniciación 30S Complejo de iniciación 70S Subunidad 50S + H2O
Mecanismo de la Traducción: Elongación 59 J. Salgado (UVEG - 2005) 2.Transporte del segundo aminoacil-tRNAs (y sucesivos) al sitio A del ribosoma –Dependiente de factores de elongación EF-Tu y EF-Ts y de GTP 3.Formación del enlace peptídico –Transferencia de grupo peptidil al tRNA del sitio A 4.Translocación simultanea de los tRNAs y del mRNA –Dependiente del factor de elongación EF-G y de GTP •Movimiento del mRNA en la distancia de un codón •Movimiento del tRNA vació al sitio E •Movimiento del peptidil-tRNA al sitio P (el sitio A queda libre) 5.Disociación del tRNA libre Transporte y unión del aminoacil-tRNA GTP GDP + Pi EF-Tu EF-Ts Formación del enlace peptídico Translocación GTP GDP + Pi EF-G
Mecanismo de la Traducción: Terminación 60 J. Salgado (UVEG - 2005) 6. Llegada de un codón de parada (UAA, UGA o UAG) del mRNA al sitio A – El codón de terminación es reconocido por un factor de liberación (RF1 o RF2) • Estos son proteínas (no hay tRNA para los codones de terminación) – El reconocimiento es ayudado por el factor de liberación RF3 • Requiere GTP 7. Hidrólisis del enlace éster que une el polipéptido al tRNA y liberación del polipéptido 8. Liberación del mRNA y del último tRNA y disociación del complejo de traducción – Requiere el factor de liberación del ribosoma (RRF) y GTP
Síntesis de Proteínas en Eucariotas 61 J. Salgado (UVEG - 2005) • Las principales diferencias con respecto a procariotas son: – Tamaño del ribosoma • En eucariotas el ribosoma es de 80S, con dos subunidades de 60S y 40S – Iniciación • Se inicia con Met y no con N-formil-Met, aunque también existe un tRNA especial de iniciación • No hay secuencia de Shine-Dalgarno • El codón de iniciación se encuentra por rastreo (es el más próximo a 5’). Los mRNA son monocistrónicos – Los eucariotas presentan un mayor número de factores de traducción
TEMA 6 TEMA 6 Introducción a la Bioenergética 1. Repaso de conceptos importantes 2. Acoplamiento entre las reacciones endergónicas y exergónicas 3. Sistema ATP/ADP 4. Termodinámica del transporte a través de membrana 5. Teoría quimiosmótica 6. ATP sintasa
Introducción a la Bioenergética ‰ La formación o ruptura de cada biomolécula lleva asociado un cambio de energía. La Termodinámica es el campo de la química que estudia esos cambios de energía. ‰ El objetivo de la termodinámica es predecir si una reacción ocurrirá espontáneamente: si continuará sin necesidad de aporte energético una vez ha comenzado. ‰ Los sistemas biológicos no vulneran la segunda ley de la termodinámica.
El cambio de energía libre de Gibbs (∆G) es la función termodinámica más útil para predecir la espontaneidad de una reacción. ∆G = ∆H-T∆S ‰ Una reacción es espontánea cuando ∆G es negativo. ‰ Concepto de reacción endergónica y exergónica ‰ La ∆G estándar biológica (∆Gº’):Reacciones que se producirán en las condiciones: ¾ 1M de concentración de solutos. ¾ pH 7.0 ([H+]= 10-7 M) ¾ 25ºC ¾1 at de presión
En cualquier reacción de un ser vivo la ∆G debe ser menor de cero para que se formen productos ‰ En el equilibrio, ∆GR = 0 ∆GRº´ = - RT ln Keq En la reacción A + B C + D ∆GR = ∆GRº´ + RT ln [C] [D] [A] [B] ‰ Según la concentración de sustratos y productos en la célula (o en un compartimento de ésta), el signo de ∆G puede cambiar
Reacciones acopladas ‰ Muchos procesos bioquímicos endergónicos se realizan gracias al acoplamiento a reacciones exergónicas. por ejemplo: ∆Gº’(kcal/mol) 1. glucosa-6-P Æ fructosa-6-P + 0.4 2. fructosa-6-P + ATP Æ fructosa-1,6-bisP + ADP - 3.4 3. glucosa-6-P + ATP Æ fructosa-1,6-bisP + ADP - 3.0 La reacción total 3 (suma de 1+2) es exergónica. La suma de ∆G1º’ + ∆G2º’ es ∆G3º’ o –3.0 kcal/mol: La reacción completa es espontánea.
Sistema ATP-ADP ‰ ATP suministra energía libre para conducir muchas reacciones endergónicas ‰ Los otros nucleósidos trifosfato (GTP, UTP y CTP) pueden dirigir reacciones de forma análoga al ATP, aunque el ATP se encuentra en mucha mayor concentración en las células enlaces anhídrido fosfórico Adenosina trifosfato (ATP)
La hidrólisis de los enlaces anhídrido fosfórico del ATP desprende gran cantidad de energía libre * ** * Adenosina trifosfato (ATP) ∆Gº’ ATP + H2O ADP + Pi -30.5 kJ/mol * ATP + H2O AMP + PPi -32.2 kJ/mol ** AMP + H2O Adenosina + Pi -14.0 kJ/mol * ADP + Fosfato inorgánico (Pi) AMP + Pirofosfato inorgánico (PPi)
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Bioquímica UVEG 2005

  • 1. Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Bioquímica Universitat de València Curso 2004-05 1o de Química, Grupo E Prof.: Jesús Salgado Benito http://www.uv.es/salgado/bioquimica/
  • 2. 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Conocimientos Previos. Repasar... • De Química General – Termodinámica básica: Primer y segundo principio de la termodinámica. Equilibrio químico – Equilibrio de ionización del agua: Concepto de pH. Reacciones ácido- base: pKa, tampones, curvas de valoración – Principales tipos de enlace e interacciones – Cinética química básica. Velocidad de reacción y constante de velocidad. Orden de reacción. Concepto de catalizador – Reacciones de óxido-reducción. Potencial electroquímico – Principales grupos funcionales orgánicos • De Biología General – Moléculas sillares: aminoácidos, nucleótidos, ácidos grasos y azúcares – La célula. Células procariotas y eucariotas. Orgánulos principales de las células eucariotas
  • 3. 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Organización del Curso • Primera parte (prof. Jesús Salgado) – Temas 1-6 • Estructura y función de Proteínas • Enzimología • Estructura y función de Ácidos Nucleicos – Examen en Abril • Segunda parte (prof. Mercedes Costell) – Temas 7-12 • Bioenergética • Metabolismo – Examen en Junio
  • 4. 4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Evaluación • Exámenes – Mínimo para aprobar: 5 puntos sobre 10 • Evaluación continua (máximo 40 %) – Cuestiones, trabajos y tests (a lo largo del curso) – Tutorías • Asistencia obligatoria • Entrega de cuestiones, dudas, etc – Sólo se aplica si sube la nota. Ejemplos: (6x0.6)+(10x0.4)=3,6+4=7,4 (6x0.6)+(9x0.4)=3,6+3,6=7,2 (6x0.6)+(7x0.4)=3,6+2,8=6,4 (6x0.6)+(5x0.4)=3,6+2=5,6 Final Final Eval. Continua Eval. Continua Examen Examen 10 9 7 5 7,4 7,2 6,4 6 6
  • 5. 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Esquema del Tema • ¿Qué es la Bioquímica? • ¿Qué es la vida? • Organización de los organismos vivos – La célula – Tipos de células • Biomoléculas – Grupos funcionales – Tipos de biomoléculas • Monómeros • Macromoléculas • Aminoácidos y proteínas • Azúcares – Monosacáridos y polisacáridos • Ácidos grasos y lípidos • Nucleótidos y ácidos nucleicos • El agua – Estructura – Interacciones débiles en disolución acuosa – Propiedades del agua
  • 6. 6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) ¿Qué es la Bioquímica? • La Bioquímica estudia las bases moleculares de la vida – Composición química de las formas de vida y su funcionamiento – Pretende resolver preguntas fundamentales • ¿Qué es la vida? Origen de la vida – Múltiples aplicaciones de importancia social • Biomedicina, Biotecnología • Enfoque experimental multidisciplinal – Basado en conceptos de Biología, Química y Física – Ayudado por desarrollos tecnológicos complejos
  • 7. 7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) ¿Qué es la Vida? • Unidad dentro de la diversidad – Todos organismos vivos • Se componen de las misma clase de moléculas (moléculas biológicas) • Funcionan de manera semejante • Responden a las mismas leyes Físicas y Químicas que rigen el Universo • La vida es compleja y dinámica • La vida se organiza y mantiene a sí misma – Organización jerárquica – Necesita de aporte de energía y materia • Metabolismo y homeostasis
  • 9. 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) ¿Qué es la Vida?... • La célula es la unidad fundamental de organización y funcionamiento de la vida • La vida necesita información biológica – Necesaria para su organización, funcionamiento y replicación – Es una información estructural • Secuencia de los genes --> proteínas --> funciones • La vida no es estática: se adapta y evoluciona – Todas las formas de vida tienen un origen común
  • 10. 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Organismos Vivos • Todas las especies vivas se componen de células – Tipos de células • Procariotas (sin núcleo) • Eucariotas (con núcleo y orgánulos celulares) • Tipos de organismos – Tres dominios • Bacterias • Arqueas • Eucariotas • Los virus son entidades genéticas sin vida autónoma
  • 11. 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Hay Tres Grandes Tipos de Formas de Vida Sobre la Tierra
  • 16. 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Biomoléculas • Inorgánicas – Agua 50-95% – Iones (Na+, K+, Mg2+, Ca2+, ...) 1% • Orgánicas – Derivados de hidrocarburos • Combinaciones de carbono (principal), hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre. – Forman enlaces covalentes estables – Importancia del carbono: • Puede participar hasta en 4 enlaces covalentes fuertes – Complejidad y estabilidad estructural • Permite formar cadenas largas lineales o ramificadas
  • 17. 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Grupos Funcionales en Biomoléculas Polar, aceptor en enlaces de hidrógeno Éster O----- ||----- R— C —O —R’ Ésteres Polar, fácilmente oxidable para formar enlaces disulfuro (S-S) Tiol R— SH Tioles Polar, puede ser tanto dador como aceptor en enlaces de hidrógeno Amido O. ||- ...R— C —NH2 Amidas Base débil, cargado positivamente en estado protonado Amino R— NH2 Aminas Polar, ácido débil, cargado negativamente en estado desprotonado Carboxilo O. ||- .R— C —OH Ácidos Polar, aceptor en enlaces de hidrógeno Carbonilo O || .R— C —R’ Cetonas Polar, aceptor en enlaces de hidrógeno Carbonilo O || R— C —H Aldehídos Polar, dador en enlaces de hidrógeno Hidroxilo R —OH Alcoholes Propiedades Grupo Estructura Familia
  • 18. 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Biomoléculas Orgánicas • Monómeros – Aminoácidos • grupo amino + carboxilo + cadena lateral – Azúcares sencillos • polihidroxialdehídos o polihidroxicetonas – Ácidos grasos • ácidos monocarboxílicos con un número par de átomos de carbono – Nucleótidos • azúcar (ribosa) + base nitrogenada + fosfato • Macromoléculas – Proteínas • polímeros de α- aminoácidos – Polisacáridos • polímeros de monosacáridos – Ácidos Nucleicos • polímeros de nucleótidos – DNA, RNA
  • 19. 19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos y Proteínas • Los aminoácidos se distinguen por sus cadenas laterales – Naturaleza hidrofóbica o hidrofílica, tamaño, grupos funcionales – 20 α-aminoácidos formadores de proteínas • Polipéptido – Unión de varios aminoácidos por enlaces peptídicos – Péptido: unos pocos aminoácidos • poca riqueza estructural – Proteína: muchos aminoácidos • la cadena se pliega en estructuras definidas • gran diversidad de funciones – catalizadoras, elementos estructurales, transmisoras de señales, etc.
  • 20. 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos y Proteínas Algunos α α-aminoácidos Polipéptido Plegamiento de una proteína Cadena polipeptídica desplegada Cadena plegada Enlaces peptídicos Glutamina Valina Lisina Glicina Fenilalanina Serina
  • 21. 21 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Azúcares • Monosacáridos – Según sean aldehídos o cetonas: • Aldosas – Ribosa, glucosa, galactosa • Cetosas – Fructosa – Según el número de carbonos • Triosas • Tetrosas • Pentosas • Hexosas – Formas lineales en equilibrio con hemiacetales cíclicos Aldosa α α-D-Glucopiranosa β β-D-Glucopiranosa Cetosa D-Glucosa Enlace hemiacetálico
  • 22. 22 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Disacáridos y Polisacáridos • Uniones por enlace glucosídico –Disacáridos • Sacarosa, lactosa, maltosa –Oligosacáridos • Rafinosa (trisacárido) –Polisacáridos • Homopolisacáridos – Fuente y almacenamiento de energía » Almidón (en vegetales) » Glucógeno (en animales) – Función estructural » Celulosa (en vegetales) » Quitina (en insectos) • Heteropolisacáridos – En péptidoglucanos » Glucosaminoglucanos – En glucoproteínas Glucógeno
  • 25. 25 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ácido ribonucleico (RNA) Ácido desoxi- ribonucleico (DNA) Ribosa Desoxi- ribosa Enlace fosfo- diéster Enlace fosfo- diéster 3’ 5’ 3’ 5’ Bases nitrogenadas Nucleótido Adenosin- trifosfato (ATP) Timina (T) Citosina (C) Uracilo (U) Adenina (A) Guanina (G) Pirimidinas Purinas A Ribosa Nucleótidos y Ácidos Nucleicos
  • 26. 26 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) El Agua, Matriz de la Vida • Medio donde se desarrolla la vida – Fluido básico de la materia viva • Medio disolvente de las reacciones bioquímicas – Medio de transporte de sustancias • Transporte de nutrientes • Excreción de sustancias tóxicas – Ayuda a mantener la temperatura • Propiedades moleculares y físicas especiales – Estructura molecular: Posibilita interacciones débiles – Propiedades térmicas – Propiedades como disolvente • Polaridad • Presión osmótica
  • 27. 27 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Estructura Molecular del Agua • Hibridación sp3 del oxígeno – Estructura tetraédrica – Geometría no lineal • Distinta electronegatividad de O e H • Molécula polar – Distribución asimétrica de los electrones de enlace – Carga parcial + (δ+) cerca de los H y – (δ-) cerca del O – Capacidad de formar enlaces de hidrógeno H H O δ δ+ δ δ+ δ δ- Dipolos de enlace δ δ+ δ δ- Dipolo neto Enlace de H Geometría angular
  • 28. 28 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Enlaces Débiles en Disolución Acuosa • Pequeña energía de enlace – Se rompen y forman con facilidad – Importantes para la estructura y la función de las biomoléculas • Flexibilidad, dinamismo, interacciones y reconocimiento molecular • Tipos – Interacciones iónicas – Enlaces de hidrógeno – Interacciones dipolares – Fuerzas de van der Waals – Interacciones hidrofóbicas
  • 29. 29 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Interacciones Iónicas • Entre átomos o grupos cargados – Atracción entre iones de carga opuesta – Repulsión entre iones de la misma carga – Dependen de • Las cargas eléctricas (q) • La polaridad del entorno (ε) • La distancia (r ) • No dependen de la orientación • En macromoléculas, dan lugar a puentes salinos – Estabilizan el plegamiento – Intervienen en interacciones intermoleculares Na+ Na+ Na+ Cl– —NH3 + —COO– Puente salino kq1q2 ε r F= Ley de Coulomb Constante dieléctrica del medio Cargas Distancia
  • 30. 30 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) El Enlace de Hidrógeno • Atracción débil entre un átomo de H en un grupo polar y un átomo electronegativo (O, N, S) en otro grupo polar –Dadores • H2O, –OH, –NH, –NH2, –SH –Aceptores hidroxilo dador y agua aceptor carbonilo aceptor y agua dador carbonilo aceptor y amida dador Grupos complementar ios de bases de DNA T A Enlace de hidrógeno fuerte Enlace de hidrógeno débil C C Dependencia con la orientación
  • 31. 31 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Interacciones Dipolares • Entre moléculas o grupos dipolares. Dependen de la distancia, pero no de la orientación C=O δ+ δ– Dipolo permanente – dipolo permanente Dipolo permanente – dipolo inducido Dipolo inducido – dipolo inducido (Fuerzas de dispersión de London) Débil F ∝ 1/r3 Más débil F ∝ 1/r5 Mucho más débil F ∝ 1/r6 C=O δ+ δ– C=O δ+ δ– C — δ+ δ– C — δ+ δ– C — δ+ δ–
  • 32. 32 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fuerzas de van der Waals • Pueden ser atractivas o repulsivas A B A B Suma de los radios de van der Waals A B Solapamiento de nubes electrónicas: Repulsión A B Cerca: atracción Lejos: no interacción Máxima atracción r (nm) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 0 -1 1 Energía (KJ/mol) r Repulsión Atracción
  • 33. 33 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Propiedades Térmicas del Agua • El agua es un líquido a temperatura ambiente – Agua líquida: • Red dinámica de enlaces de H – Hielo: • Red rígida con número máximo de enlaces de H • Regulador térmico de los organismos vivos – Elevada capacidad calorífica • Modulador de la temperatura – Elevado calor de vaporización • Mecanismo de refrigeración Estructura del hielo
  • 34. 34 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) El Agua como Disolvente • Moléculas hidrófilas – Iones (electrolitos) • Se disuelven a través de esferas de solvatación – Moléculas polares • Se disuelven por interacciones dipolo-dipolo y enlaces de hidrógeno • Moléculas hidrófobas (apolares) – No se disuelven en agua • Se agrupan entre ellas • El agua se organiza alrededor de ellas formando un “clatrato” (efecto hidrofóbico) Disolución de iones en agua Moléculas de agua del entorno Agrupación de moléculas hidrófobas Moléculas de agua muy organizadas Estructura de un clatrato Esfera de solvatación
  • 35. Estructura de las Proteínas Tema 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 36. Aminoácidos 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Un α-aminoácido es un ácido carboxílico con un grupo amino y un grupo R en el carbono α • R --> cadena lateral • Dos estereoisómeros posibles – Enantiómeros L y D – Sólo la forma L se encuentra en proteínas L-Alanina D-Alanina
  • 37. 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Estándar Aminoácidos neutros no polares Aminoácidos neutros polares Aminoácidos ácidos Aminoácidos básicos Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Fenilalanina Triptófano Metionina Cisteina Prolina Serina Treonina Tirosina Asparagina Glutamina Aspartato Glutamato Lisina Arginina Histidina • Se representa normalmente el estado de protonación a pH 7,0 • Los aminoácidos se clasifican según las propiedades de sus cadenas laterales (a pH 7,0) –¡Atención a los casos de His, Tyr y Cys!
  • 38. 4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Alifáticos No Polares Glicina Gly, G Alanina Ala, A Valina Val, V Leucina Leu, L Metionina Met, M Isoleucina Ile, I Prolina Pro, P Cadena lateral ciclada. Implica restricciones conformacionales (Iminoácido)
  • 39. Aminoácidos Aromáticos 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fenilalanina Phe, F Tirosina Tyr, Y Triptófano Trp, W No polar (Hidrofóbico) Polar No polar (Hidrofóbico)
  • 40. 6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Neutros Polares Serina Ser, S Treonina Thr, T Cisteina Cys, C Asparagina Asn, N Glutamina Gln, Q •Puede encontrarse cargado a pH>8,5 •Grupo -SH es muy reactivo. Dos moléculas de Cys se oxidan formado cistina mediante un puente disulfuro (-S-S-). Puede encontrarse cargado a pH>9 Tirosina Tyr, Y
  • 41. 7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Básicos con Carga Positiva Arginina Arg, R Histidina His, H Lisina Lys, K H+ Se encuentra cargado a pH<7
  • 42. 8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Aminoácidos Ácidos con Carga Negativa Aspartato Asp, D Glutamato Glu, E
  • 43. Aminoácidos no Estándar 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Aminoácidos distintos de los 20 estándar y derivados de éstos realizan funciones biológicas importantes como mensajeros o precursores – Neurotransmisores • γ-aminobutírico (GABA), derivado de la Gln • serotonina, derivado del Trp – Hormonas • tiroxina, derivado de la tirosina • ácido indol acético, derivado del triptófano – Precursores e intermediarios metabólicos • citrulina • ornitina
  • 44. Aminoácidos Proteicos Modificados • Se forman después de la síntesis proteica • Proporcionan propiedades funcionales específicas 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) γ-carboxiglutamato 4-hidroxiprolina 5-hidroxilisina o-fosfoserina Importante para la unión de calcio en proteasas de la cascada de coagulación Posibilitan la formación de la estructura reticular del colágeno La fosforilación en residuos con grupos hidroxilo (Ser, Tyr, Thr) regula la actividad de muchas proteínas
  • 45. Propiedades Ácido-Base de los Aminoácidos • Los aminoácidos son anfóteros – se comportan a la vez como ácidos y como bases • A pH 7 Los aminoácidos sin cadena lateral cargada son zwitteriones – presentan simultáneamente una carga positiva y una negativa 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Carga neta +1 Carga neta 0 Carga neta -1 Forma aniónica Forma zwitteriónica (neutra) Forma catiónica K2; pK2 K1; pK1
  • 46. 12 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) α-carboxilo pK1=2-3 Asp y Glu pKR≈4> pK1 Lys y Arg pKR> pK2 α-amino pK2=9-11 His pKR< pK2 Cys, pKR< pK2 Tyr, pKR> pK2 carga - en estado desprotonado Valores de pKa de Aminoácidos
  • 47. Punto Isoeléctrico (pI) 13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • pI es el valor de pH para el cual la carga neta del aminoácido es 0 – Valor medio de los pKa que flanquean la estructura isoeléctrica • Para aminoácidos neutros es el valor medio de los pK1 y pK2 • Para aminoácidos ácidos o básicos depende de cada caso – Cuando pH= pI disminuye la solubilidad en agua pK1=2.2 pKR=4.3 pK2=9.9 Equivalentes de OH- Ácido glutámico pI= (2.2+4.3)/2 = 3.22 Carga +1 Carga -1 Carga -2 Carga 0
  • 48. 14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Polimerización de Aminoácidos: El enlace Peptídico • Los aminoácidos polimerizan formando polipéptidos mediante enlaces peptídicos – El enlace peptídico es un enlace amida formado por unión del grupo α-carboxilo y el grupo α-amino de dos aminoácidos – Los aminoácidos unidos se llaman residuos de aminoácido – Los residuos se nombran con la terminación “il” comenzando por el extremo N-terminal Formación de un Dipéptido Enlace peptídico N-terminal C-terminal Dos aminoácidos
  • 49. Propiedades del Enlace Peptídico 15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) C—N —Cα O H Cα— C—N —Cα O H Cα— Estructuras de resonancia del enlace peptídico Equilibrio cis-trans. Sólo en los enlaces X–Pro aparece la conformación cis en una proporción significativa C—N —Cα O H Cα— C=N —Cα O- Cα— + H trans cis • El enlace peptídico es rígido y planar – Tiene carácter parcial de doble enlace (~40%) • Equilibrio de estructuras resonantes • No tiene libertad de giro – Es más corto que otros enlace C—N – Se presenta normalmente en conformación trans • Los grupos C=O y N-H peptídicos son polares – Participan en la formación de enlaces de hidrógeno
  • 50. Péptidos 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Son polímeros de unos pocos aminoácidos • Ejemplos de algunos péptidos importantes – Glutatión (γ-glutamil-L-cisteinilglicina) • Agente reductor. Protege a las células de productos oxidantes derivados del metabolismo del O2 – Vasopresina (hormona antidiurética) • Interviene en la regulación del equilibrio hídrico – Oxitocina • Hormona sexual. Estimula la secreción de la leche y la contracción muscular uterina durante el parto – Péptidos opiáceos (leu- y met-encefalinas) • pentapéptidos que intervienen en el alivio del dolor
  • 51. Proteínas 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Largas cadenas de aminoácidos que se pliegan con una estructura definida • Son responsables de la mayoría de las funciones bioquímicas: – Catálisis – Transporte – Estructura – Almacenamiento – Movimiento – Detoxificación – Defensa – Regulación
  • 52. Tipos de Proteínas 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Según su forma – Fibrilares – Globulares • Según su composición – Simples – Conjugadas • Constan de una cadena polipeptídica y un grupo prostético – apoproteína --> sólo la cadena polipeptídica – holoproteína --> polipéptido + grupo prostético • Según sea el grupo prostético: – glucoproteínas – lipoproteínas – metaloproteínas – hemoproteínas – fosfoproteínas
  • 53. 19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Estructura de las Proteínas • Surge del plegamiento de la cadena polipeptídica • Depende de su secuencia y de las características del disolvente • Se distinguen cuatro niveles estructurales: – Estructura primaria • Secuencia de aminoácidos – Estructura secundaria • Plegamiento local – Estructura terciaria • Plegamiento global – Estructura cuaternaria • Organización multimérica de varias cadenas Conformación de la cadena polipeptídica Plano amida- peptídico Cadena lateral Carbono α Carbono α φ ψ
  • 54. Estructura Primaria 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Se define por la secuencia de aminoácidos – Específica de cada proteína • Las proteínas homólogas tienen secuencias y funciones semejantes • La comparación de secuencias permite establecer relaciones evolutivas – Mutaciones -->variaciones en la secuencia • Los aminoácidos invariables son importantes para la función • Las mutaciones conservadoras son cambios entre aminoácidos químicamente semejantes • Algunas mutaciones se relacionan con enfermedades --> enfermedades moleculares (patología molecular) Estructura primaria de la insulina
  • 55. Estructura Secundaria 21 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Patrones repetitivos de conformación local de la cadena polipeptídica – Dependen de los valores de los rotámeros φ y Ψ • Hay un número limitado de conformaciones posibles debido a impedimentos estéricos entre los grupos -NH, -CO y -R • La conformación más favorable depende de la secuencia de aminoácidos – Las conformaciones posibles se estabilizan por un número elevado de enlaces de hidrógeno Fragmento de cadena polipeptídica e conformación extendida: φ =180o, ψ =180o Plano amida Plano amida Cadena lateral Carbono α
  • 56. Conformaciones Prohibidas El choque estérico (solapamiento de los radios de van der Waals) al girar los rotámeros φ y ψ impide gran número de conformaciones. Las conformaciones posibles se representan en el diagrama de Ramachandran 22 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Choque de los grupos - CO Choque de los grupos - NH Grupos -CO lejos entre ellos y lejos de la cadena lateral R Choque -NH con -CO Conformación Posible φ =0o, ψ =180o φ =180o, ψ =0o φ =-60o, ψ =180o φ =0o, ψ =0o
  • 57. Diagrama de Ramachandran 23 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Distribución de ángulos φ y ψ en un polipéptido de polialanina – En blanco, valores prohibidos – En azul, valores posibles. • Tipos principales de estructura secundaria – hélice α – láminas β ψ (grados) φ (grados) Hélice α (a derechas) Cadenas β Hélice α (a izquierdas)
  • 58. 24 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Hélice α (3,613) • Conformación helicoidal “a derechas” – φ=-60o, ψ=-40o - -50o – 3,6 residuos por vuelta • avance de 5,4 Å por vuelta – 13 átomos por bucle (hélice 3,613) – Casi todos los grupos peptídicos participan en enlaces de H • Entre residuos i e (i+4) • Excepto en los extremos – Las cadenas laterales se dirigen hacia fuera • Mínima repulsión • Posibles interacciones entre ellas •3,6 residuos •5,4 Å •(1,5 Å por residuo) Residuo “i” Residuo “i+4” Cadenas laterales hacia afuera Vista desde arriba 1 2 3 4 13 átomos por cada bucle cerrado por un enlace de H
  • 59. Estabilidad de la Hélice α 25 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Contribución principal: enlaces de hidrógeno entre grupos - CO y -NH peptídicos (cada residuo i con i+4) –No es posible en los tres primeros residuos de los extremos •Se estabilizan por enlaces de H con grupos de cadenas laterales • Interacciones entre cadenas laterales –Residuo i con i+3 e i+4 (por encima) y con i-3 e i-4 (por debajo) •Electrostáticas –Atractivas (estabilizadoras, entre residuos de distinta carga) –Repulsivas --> desestabilizadoras (entre residuos con la misma carga) •Hidrofóbicas • Algunos residuos desestabilizan la hélice α –Glicina (no tiene R --> otorga demasiada flexibilidad) –Prolina (restringe el giro de φ; no tiene -NH para formar enlace de H) –Residuos voluminosos (Trp) y ramificados en el carbono β (Val, Thr)
  • 60. 26 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Hoja β Hoja β Paralela Hoja β Antiparalela Enlaces de H mejor orientados (más fuertes) Peor orientación de enlaces de H (más débiles) • Alineamiento de segmentos polipeptídicos en confor-mación extendida (cadenas β) – -CO y -NH peptídicos forman enlaces de H entre cadenas adyacentes – Apariencia de lámina plegada – Cadenas laterales dispuestas perpendicularmente a ambos lados de la hoja – Frecuentes aminoácidos con cadena lateral voluminosa • Según la dirección de las cadenas β – Paralela – Antiparalela
  • 61. 27 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Esquemas de Hojas β Paralela Antiparalela Cadenas laterales
  • 62. Giros β 28 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Cambian la dirección de la cadena 180o – Conectan entre sí cadenas β antiparalelas • Son giros cortos y cerrados – Implican cuatro residuos • Con frecuencia Gly y Pro – Enlace de H entre i e i+3 • Varios tipos – Tipo I – Tipo II (Gly en 3a posición) Tipo I Tipo II Glicina 1 2 3 4 3 4 1 2
  • 63. 29 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Meandro β Unidad αα Barril β Llave griega Unidades βαβ Estructuras Supersecundarias • Son combinaciones de elementos de estructura secundaria que forman patrones definidos • También se denominan motivos estructurales y son la base para la clasificación estructural de las proteínas
  • 64. Estructura Terciaria 30 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Estructura tridimensional global que asume una proteína al plegarse – Residuos lejanos en la secuencia quedan cerca en el espacio – Estructura compacta que excluye las moléculas de agua de su interior • La ausencia de agua facilita las interacciones iónicas y los enlaces de hidrógeno • En el interior se agrupan residuos hidrofóbicos (efecto hidrofóbico). Los polares se exponen al exterior – Las proteínas grandes suelen presentar dominios estructurales
  • 65. 31 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Dominios Estructurales Son unidades estructuralmente independientes que presentan características y funciones definidas Mano EF Configuración hélice-vuelta-hélice que se une específicamente a iones Ca2+ Dedo de Zn Habitual en proteínas que unen DNA Cremallera de leucinas Hélice F Hélice E Ca2+
  • 66. 32 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Mantenimiento de la Estructura Terciaria Puente salino Interacciones hidrofóbicas Puentes disulfuro Enlaces de hidrógeno Interacciones covalentes Presentes sólo en algunos casos Interacciones débiles (no covalentes) •Iónicas (puentes salinos) •Hidrofóbicas •Enlaces de hidrógeno •Fuerzas de van der Waals
  • 67. 33 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Proteínas Hidrosolubles y Proteínas de Membrana Entorno acuoso Hidrofóbico Hidrofóbico Arg Arg Asp Asp Lys Lys Glu Glu Asn Asn Gln Gln His His Tyr Tyr Pro Pro Ser Ser Gly Gly Thr Thr Ala Ala Trp Trp Cys Cys Val Val Leu Leu Ile Ile Met Met Phe Phe Polar Escala de hidrofobicidad de Engelman Entorno lipídico membrana
  • 68. Plegamiento de las Proteínas 34 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • El plegamiento depende de las condiciones del medio – Factores físicos • Temperatura • Presión – Factores químicos • pH • Disolventes orgánicos • Agentes caotrópicos (urea, cloruro de guanidinio) • Es reversible y cooperativo Temperatura (ºC) Fracción desnaturalizada Renaturalización Desnaturalización N D D desnaturalizada N nativa Experimento de Anfinsinsen
  • 69. Proteína denaturalizada <-> Proteína Nativa 35 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Regular, compacta • Estructura 2ria • Abundancia de enlaces intramoleculares – Puentes de H – Enlaces iónicos – Interacciones de van der Waals • Residuos hidrofóbicos no expuestos • “Ovillo estadístico” • Irregular, variable, abierta • Ausencia de estructura 2ria • Pocos enlaces intramoleculares • Residuos hidrofóbicos expuestos – Efecto hidrofóbico – Contribución entrópica al plegamiento D N desnaturalización renaturalización Clatratos: Capas de H2O ordenadas Residuos hidrofóbicos
  • 70. Plegamiento “in vivo” 36 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Problema del plegamiento “in vivo” – Plegamiento acoplado a la síntesis de proteínas – ¿Cómo selecciona la célula las condiciones de plegamiento? • Control celular de las condiciones de plegamiento (chaperonas moleculares) – Plegamiento de proteínas nacientes – Prevención y corrección de errores de plegamiento en condiciones de estrés (Heat shock proteins, HSP) • Sistemas enzimáticos que ayudan al plegamiento – Proteína-disulfuro isomerasas – Peptidil-prolil isomerasas mRNA ribosoma Síntesis de proteínas Síntesis de proteínas Cadena naciente N proceso catalizado Plegamiento Plegamiento Cys Pro Cys Cys
  • 71. Estructura Cuaternaria 37 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Asociación no covalente de varias cadenas polipeptídicas – Subunidades=monó- meros=protómeros – Las subunidades se organizan de manera simétrica – Ventajas de la asociación • Mayor estabilidad • Regulación alostérica – Estabilidad • Mismo tipo de enlaces que estructura terciaria Estructura cuaternaria de la hemoglobina Homo-oligómero de cuatro subunidades (tetrámero 2xαβ) α1 β1 β2 α2
  • 72. Proteínas Fibrosas y Proteínas Globulares 38 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Fibrosas – Forma alargada – Unidades repetidas de un solo tipo de estructura secundaria – Resistentes e insolubles – Función estructural • Ejemplos – Colágeno (en tejido conectivo de vertebrados) – Queratina (en piel, pelo y uñas) – Fibroína de la seda • Globulares – Forma más o menos esférica – Ricas en estructura secundaria – Flexibles, y dinámicas – Múltiples funciones • Ejemplos – Hemoglobina – Inmunoglobulinas (anticuerpos) – Enzimas
  • 73. El Colágeno 39 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Proteína más abundante de vertebrados • Red fibrosa de tropocolágeno • Tropocolágeno –Abundancia de Pro y Gly • Secuencia G-X-Y –X e Y suelen ser Pro e hidroxi-Pro –En Y también abunda hidroxi-Lys –Triple hélice a derechas formada por tres hélices a izquierdas • Enlaces de H interhélice • Gly, uno de cada tres residuos, en la zona de empaquetamiento • Entrecruzamiento de unidades de tropocolágeno –Por derivados aldehído de Lys Hélice triple de tropocolágeno Tres hélices a izquierdas
  • 74. 40 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fibrilogénesis del Colágeno Cabezas de tropocolágeno Estriaciones 640 Å (64 nm) Estriaciones 640 Å (64 nm) Tropocolágeno Uniones hidoxilisinonorleucina Cadena polipeptídica Norleucina (residuo de Lys sin grupo ε- amino) Residuo de hidroxilisina Cadena polipeptídica
  • 75. Aminoácidos Especiales en el Colágeno • Residuos de Prolina y Lisina hidroxiladas – Proporcionan grupos formadores de enlaces de hidrógeno – Se forman por adición de hidroxilo • Modificación enzimática post-traduccional • Catalizada por una prolilhidroxilasa (o lisilhidroxilasa) que requiere ascorbato (vitamina C) como antioxidante 41 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Residuo 4-hidroxiprolil Residuo 3-hidroxiprolil Residuo 5-hidroxilisil
  • 76. α-Queratina Estructura del Pelo 42 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Protofila- mento Protofibrilla Filamento intermedio Células Hélices enrolladas Hélice α Hélice α Dos hélices enrolladas a izquierdas Protofilamento Proto- fibrilla Unidad estructural Dímero Reduc- ción Rizado Oxida- ción Rizado Artificial del cabello
  • 77. 43 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fibroína de la Seda • Fibras formadas por hojas β antiparalelas – Aminoácidos con cadena lateral pequeña (Gly, Ala, Ser) – Residuos hidrofóbicos y polares alternados (en caras opuestas) – Varias hojas interaccionan por las caras hidrofóbicas • Flexible y resistente al estiramiento polar polar apolar apolar
  • 78. Dinámica de las Proteínas Tema 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 79. 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Esquema del Tema • Dinámica y Funcionalidad – Flexibilidad – Cambios conformacionales – Interacciones • Interacción Proteína/Ligando – Generalidades – Fracción de saturación – Cooperatividad – Alosterismo • Proteínas transportadoras de oxígeno – Mioglobina y Hemoglobina – Curvas de saturación de O2 – Origen molecular de la cooperatividad – Efectores alostéricos de la hemoglobina. Origen molecular del alosterismo • 2,3-BPG • Efecto Bohr • CO2 • Variantes naturales y patología molecular de la hemoglobina
  • 80. Dinámica y Funcionalidad 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La funcionalidad de las Proteínas depende de sus propiedades dinámicas – Flexibilidad • Las proteínas no son estructuras rígidas • Su flexibilidad depende de un gran número de enlaces débiles – Cambios conformacionales • Son pequeñas variaciones de la estructura terciaria • Sirven para regular la actividad de las proteínas – Interacciones • Unión reversible de ligandos • Interacciones reversibles proteína-proteína • Se estabilizan mediante enlaces débiles
  • 81. Interacción Proteína (P) / Ligando (L) 4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Muchas funciones dependen de la unión reversible de ligandos • Tipos de ligandos – En catálisis • P = enzima • L = sustrato, activador, inhibidor – En señalización • P = receptor • L = hormona – En transporte • P = transportador • L = O2, lípido, azúcar, etc. – En sistema inmunológico • P = anticuerpo • L = antígeno P L Sitio de unión Complejo PL L • Sitio de unión – Específico y definido – Interacciones P-L • Enlaces débiles: – Hidrofóbicos – Iónicos – Enlaces de H – van der Waals – Otros
  • 82. Fracción de Saturación • Para un solo sitio: Representación de Y frente a [L] 1 0,5 0 P + L PL Kd Y 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Constante de disociación Æ Definimos Fracción de Saturación Y : [L] Kd ’ Kd ’’ Unión débil Unión fuerte Definición de Kd Concentración de ligando para la cual se alcanza la mitad de la saturación máxima (L½) Kd = L½ Afinidad ½ ´ Kd ¾ De las expresiones anteriores Æ Ecuación de una hipérbola
  • 83. 6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Cooperatividad • Sitios equivalentes e independientes – K1 = K2 • • • = Kn = L½ – c = 1 • Sitios equivalentes y dependientes – Supercooperatividad + • Todos simultáneamente • c = n – Cooperatividad + • K1 > K2 • • • > Kn • 1 < c < n – Cooperatividad – • K1 < K2 • • • < Kn • 0 < c < 1 P + L PL • Para varios sitios K1 PL + L PL2 K2 PL2 + L PL3 K2 PLn-1 + L PLn Kn • • • c Æ coeficiente de Hill P + nL PLn K
  • 84. Curvas de Cooperatividad Positiva 7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La afinidad aumenta a medida que se van ocupando los sitios • Resultado: – Curva sigmoidea • Superposición de distintas curvas hiperbólicas teóricas • L½ representa la afinidad del conjunto – Para el conjunto No cabe hablar de Kd Curva sigmoidea 1 0,5 0 L½ Y [L] Kd ’ Kd ’’ Unión débil (primer sitio) Unión fuerte (último sitio) Unión cooperativa
  • 85. Alosterismo Homotrópico 8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Existe alosterismo cuando: – Hay más de un sitio de unión – La unión en un sitio afecta a la afinidad en otros (dependientes) • Efecto alostérico homotrópico – Sitios equivalentes • Mismo ligando en los distintos sitios • Proteínas multiméricas –Cada sitio en una subunidad proteica • Es el caso de cooperatividad • Dos estados conformacionales de ≠ afinidad – T (tenso), baja afinidad – R (relajado), alta afinidad Modelo concertado (de Monod) L L T T Dímero Modelo secuencial (de Koshland) R R L L L T T Dímero L R L T R R R R L L L
  • 86. Alosterismo Heterotrópico 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Efecto alostérico heterotrópico – Sitios no equivalentes • Distintos ligandos –Cada uno su sitio específico • Positivo Æ activación • Negativo Æ inhibición • Se deben a cambios conformacionales inducidos por la unión del efector • Sirven como mecanismo de regulación I Efector negativo (inhibidor) Efector positivo (activador) A Activador S P Sustrato S P Sustrato Inhibidor A P I P S P A P S
  • 87. Curvas de Alosterismo • Solo heterotrópico – Activación o inhibición y no cooperatividad • Activador –Aumenta la afinidad • Inhibidor –Disminuye la afinidad •Homo y heterotrópico –Cooperatividad + activación o inhibición • Activador –Afinidad½, cooperatividad¾ • Inhibidor –Afinidad¾, cooperatividad½ 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1 0,5 0 L½ Y [L] L½ ’’ + Activador 1 0,5 0 Y [L] + Inhibidor + Activador Sólo cooperatividad + Inhibidor Kd ’’ Kd ’’ L½ ’’ Kd
  • 88. Ejemplo de Sistemas Alostéricos: Proteínas Transportadoras de O2 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Mioglobina – Hemoproteína monomérica – Función: • Almacenamiento de O2 en el músculo • Hemoglobina – Hemoproteína tetramérica • Cada cadena es muy similar a la mioglobina – Función: • Transporte de O2 y CO2 entre los pulmones y los tejidos Mioglobina Hemoglobina
  • 89. El Sitio de Unión del Oxígeno 12 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fe2+ Desoxi-Hb Oxi-Hb O2 Fe2+ hemo His proximal Fe2+ Grupo hemo Fe2+-protoporfirina IX O2 Histidina distal Histidina proximal Cavidad hidrofóbica
  • 90. ¿Cómo Funciona el Transporte de O2? Y Y Eficiencia del transporte El transporte es eficaz si la saturación en los tejidos es mucho menor que en los pulmones mala regular Muy afín Poco afín Muy afín pO2 pO2 13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) La mayor eficacia se consigue con un comportamiento cooperativo (sigmoideo) Y pO2 Y Eficiencia del transporte (Hemoglobina) buena (R) (T) Cooperatividad pO2
  • 91. Origen Molecular de la Cooperatividad 14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Desoxihemoglobina Oxihemoglobina Interfase α1β1- α2β2 α1 α2 β2 β1 Transmi- sión del cambio a otras subunida- des • Le hemoglobina es un dímero de dímeros – Interfase α1β1- α2β2 • Interacciones iónicas en forma desoxi (T) – Grupos hemos muy separados • La unión de O2 en una subunidad provoca: – Desplazamiento del Fe2+ en el plano del grupo hemo – Cambio conformacional transmitido a las subunidades vecinas (Transición TÆR)
  • 92. Transición T Æ R en la Hemoglobina Forma T (desoxi) Forma R (oxi) α1 α2 β1 β2 α1 α2 β1 β2 15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1. Unión de O2 a una subunidad – Cambia ésta de T a R 2. Reordenamiento de la interfase α1β1-α2β2 3. Cambio conformacional transmitido a las subunidades vecinas • Giro de 15º de α1β1 con respecto a α2β2 • Disminución de cavidad entre β1 y β2 4. Transición TÆ R en subunidades vecinas – Aumento de afinidad por el O2 • Cooperatividad α1 β1 α2 β2 α1 β1 α2 β2
  • 93. Efectores Alostéricos de la Hemoglobina 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Ión H+, CO2 y 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) – Efectores heterotrópicos • Actúan como inhibidores – Estabilizan forma desoxi (T) – Disminuyen afinidad por el O2 • Facilitan liberación en los tejidos – Acentúan cooperatividad • Mejoran la efectividad del transporte • Permiten regulación fisiológica – Modulan la afinidad por el O2 • Transporte de H+ y CO2 en sentido inverso al O2
  • 94. Papel del 2,3-BPG 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Compuesto iónico – Carga negativa • Se une sólo a las formas T – Sitio de unión sólo en las formas T – 2,3-BPG dificulta la transición TÆR • Estabiliza forma desoxi • Inhibe la unión de O2 • Sin 2,3-BPG – Mucha afinidad por O2 – Poca cooperatividad • Baja eficiencia de transporte + + + + + + + + - - - - - p50O2 P50O2’ 1 0,5 0 Y pO2 (torr) sin 2,3-BPG con 2,3-BPG
  • 95. Papel del H+ (Efecto Bohr) 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Un pH bajo facilita la liberación de O2 en los tejidos – pH 7,4 (pulmones) • Mayor afinidad – pH 7,2 (músculo activo) • Menor afinidad • Origen molecular del efecto Bohr – Grupos ionizables protonados (dos His y N-terminal) • En estado protonado forman puente salino • Estabilizan forma T (desoxi) • Disminuyen la afinidad por el O2 • Se libera O2 en los tejidos pH 7,2 (en los tejidos) Protón añadido Puente salino que estabiliza la forma T (desoxi)
  • 96. Papel del CO2 carbamato 19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Una mayor presión parcial de CO2 facilita la liberación de O2 en los tejidos – En los tejidos, pCO2 alta • Menor afinidad por O2 – En los pulmones pCO2 baja • Mayor afinidad por O2 • Origen molecular – CO2 en los tejidos reacciona con grupos N-terminal de la Hb • Forma grupos carbamato con carga – – Participan en puentes salinos de las formas T • Estabiliza forma desoxi • Facilita liberación de O2 Tejidos Pulmones Y
  • 97. Variantes moleculares de la hemoglobina + + + + + + + + - - - - - Sustituido por Ser (sin carga +) Hemoglobina α2 γ2 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Hemoglobina fetal – Cadenas γ en lugar de β • His143 sustituida por Ser (sin carga +) • Menor afinidad por el 2,3-BPG • Mayor afinidad por O2 –Transferencia de O2 desde la hemoglobina materna Eritrocitos maternos (α2 β2) Eritrocitos del feto (α2 γ2) El O2 fluye desde la oxihemoglobina materna a la desoxihemoglobina del feto Y
  • 99. Catalizadores Biológicos 2 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ejemplos de reacciones catalizadas Anhidrasa carbónica Péptido o proteína Proteasa • 1011 veces más rápida • La especifidad depende de R1 • Convierte 6x105 moléculas por segundo • 107 veces más rápida que sin enzima • Catalizador: – Aumenta la velocidad de reacción – No varía ∆G de la reacción – Facilita la reacción en condiciones no extremas – No se consume durante la reacción • Los catalizadores biológicos son: – Casi siempre proteínas (enzimas) – Excepcionalmente RNA catalítico (zibozimas)
  • 100. El Centro Activo 3 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Las enzimas son específicas por sus sustratos – Interacción precisa enzima- sustrato – Sitio de interacción: “centro activo” • Hendidura tridimensional • Zona pequeña de la enzima • Propiedades especiales para la unión y catálisis del sustrato – Sustrato y centro activo tienen formas complementarias – Interacción a través de enlaces débiles Uracilo (parte del Sustrato) Serina Treonina Ribonucleasa Centro activo
  • 101. El Estado de Transición Explicación termodinámica 4 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La reacción transcurre a través de un estado de transición (S*) – Intermedio entre S y P – Mayor energía que S • Barrera de energía de activación • La enzima facilita la formación de S* – Reduce la energía de activación • Acelera la reacción – S* es complementario con el centro activo S S* P Sustrato (S) Producto (P) Progreso de la reacción Energía libre De reacción (No catali- zada) Estado de transición S* (catalizada) Energía de activación
  • 102. Modelos del Complejo Enzima-Sustrato 5 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • La llave y la cerradura (Fisher, 1890) – Centro activo y sustrato son perfectamente complementarios • Reconocimiento molecular • Ajuste inducido (Koshland, 1958) – La unión del sustrato induce un cambio en el centro activo que aumenta la complementariedad • Reconocimiento molecular dinámico Sustrato Enzima Complejo ES Enzima Complejo ES Sustrato Estado de transición
  • 103. 6 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Tipos de Enzimas • Oxidoreductasas – Catalizan reacciones de oxidoreducción • Deshidrogenasas, oxidasas, oxigenasas, reductasas, peroxidasas • Transferasas – Catalizan transferencias de grupos • Transcarboxilasas, transaminasas, transmetilasas • Hidrolasas – Catalizan la rotura de enlaces por adición de agua • Esterasas, fosfatasas, peptidasas • Liasas – Catalizan la eliminación de grupos para formar un doble enlace • Descarboxilasas, deshidratasas, desaminasas • Isomerasas – Catalizan reordenamientos moleculares • Epimerasas, mutasas • Ligasas – Catalizan formaciones de enlace entre dos sustratos, con energía aportada por la hidrólisis de ATP
  • 104. Cofactores Enzimáticos 7 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Componentes no proteicos requeridos para la actividad de la enzima – Apoenzima + cofactor = holoenzima – Dos tipos • Iones metálicos – Mg2+, Zn2+, Cu2+, Mn2+, ... • Coenzimas – Moléculas orgánicas pequeñas, muchas son derivadas de las vitaminas – Su carencia produce enfermedades
  • 105. Nociones de Cinética Química • En condiciones de equilibrio • Velocidad de reacción 8 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Velocidad Consumo de A Formación de B Constante de velocidad A B k1 k -1 En el equilibrio v = 0
  • 106. Nociones de Cinética Química A B C • Reacciones sucesivas – La velocidad depende del paso más lento k1 k2 Si k2 << k1, entonces B C es el paso limitante de la reacción, y la velocidad depende sólo de k2 k2 B = Intermediario 9 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) – Cuando la primera reacción es reversible, la llamamos preequilibrio A B C k1 k -1 k2 Si k2 << k-1, entonces A y B pueden llegar virtualmente al equilibrio, y decimos que se alcanza un estado estacionario
  • 107. Cinética de la Catálisis Enzimática Producto Complejo enzima-sustrato (intermediario) Preequilibrio E + S ES E + P k1 k -1 k2 10 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Fase de catálisis: transformación de S en P y recuperación de E Fase de afinidad: unión de S al centro activo de E y formación del complejo ES Es el paso limitante Constante de disociación del complejo ES Constante catalítica (kcat)
  • 108. Modelo Cinético de Michaelis-Menten 11 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Relaciona la velocidad de catálisis con la concentración de sustrato • Parte de los siguientes supuestos 1. P no se convierte en S – Es cierto cuando [P] es muy baja (al inicio de la reacción). Consideramos velocidades iniciales (V0) 2. K2 << k-1 – Se alcanza el estado estacionario – [ES] se considera constante 3. [E] << [S] – [S] ≈ [S]inicial
  • 110. Ecuación de Michaelis-Menten E + S ES E + P k1 k -1 k2 1 Velocidad Inicial: 2 En el estado estacionario: Constante de Michaelis 13 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) V0 alcanza el valor máximo cuando [ES]=[E]total Ecuación de Michaelis (curva hiperbólica):
  • 111. Representación de la Ecuación de Michaelis • Se representan valores de velocidad inicial , V0 , para distintos valores de concentración inicial de sustrato [S]1, [S]2, etc • V0 aumenta al aumentar [S], hasta llegar a la saturación ([ES] ≈ [E]total,se alcanza Vmax) • KM representa la [S] para la cual se alcanza la mitad de la Vmax • Vmax es un valor asintótico (se alcanza para [S] = ∞ ). No se puede obtener de la representación hiperbólica 14 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Equilibrio Tiempo Producto [S]1 [S]2 [S]3 [S]4 Velocidad de reacción Concentración de sustrato [S]
  • 112. Linealización de la Ecuación de Michaelis • Para determinar Vmax y KM con precisión la ecuación de Michaelis se transforma en una función lineal • Representación de Lineweaber-Burk (o de dobles inversos) Inverso 15 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1/ V0 1/ [S] 1/ Vmax -1/ KM Pendiente: KM / Vmax Pendiente Ordenada en el origen Recta
  • 113. Significado de la KM 16 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Dos significados – KM es la [S] para cual V0 = ½Vmax • Representa la [S] necesaria para que ocurra una catálisis significativa – Cuando k2 << k-1 , KM ≈ KS (constante de disociación del complejo ES) • Representa la inversa de la afinidad de la enzima por el sustrato • KM Tiene unidades de concentración (M) • Para una enzima determinada – KM varía según el sustrato y las condiciones (pH, temperatura, fuerza iónica, ...) ≈
  • 114. Significado de Vmax y k2 (kcat ) • Vmax revela el número de recambio de la enzima – Número de recambio = kcat • número de moléculas de sustrato convertidas en producto por unidad de tiempo y por cada molécula de enzima, en condiciones de saturación E + S ES E + P k1 k -1 k2 17 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) 1 / kcat es el tiempo necesario para la conversión de una molécula de sustrato en producto (un ciclo catalítico) Unidades : M s-1 Unidades: s-1 Unidades: M
  • 115. Eficacia Catalítica (kcat / KM ) • En condiciones fisiológicas las enzimas no se encuentran saturadas ([S] < KM ) – En estas condiciones 18 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Constante de velocidad para la interacción entre E y S • Representa la eficacia catalítica de la enzima • Sirve para comparar la preferencia de una enzima por diferentes sustratos • Unidades: M-1s-1
  • 116. Inhibición Enzimática 19 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Inhibición: Disminución de la actividad de una enzima por acción de un inhibidor – Irreversible • El inhibidor se une fuertementa a la enzima – Ejemplos: » La ampicilina: Modifica covalentemente una transpeptidasa responsable de la síntesis de la pared celular bacteriana » La aspirina: Modifica covalentemente una ciclooxigenasa que produce señales inflamatorias – Reversible • El inhibidor se une a la enzima por enlaces débiles, y el complejo EI se encuentra en equilibrio con las formas libres
  • 117. Inhibición Reversible Competitiva 20 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Sin inhibidor [S] Velocidad de reacción Sustrato Inhibidor competitivo • El inhibidor se une a la enzima libre – Compite con el sustrato • Puede ser superada a [S] elevada. No afecta a la Vmax (ni a la kcat ) • Afecta a la KM – Aumenta (KM aparente > KM ) – Suelen ser moléculas similares al sustrato o análogos del estado de transición
  • 118. Inhibición Reversible No Competitiva Sustrato Inhibidor no competitivo 21 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • El inhibidor se une tanto al E y como al complejo ES – Se une en un sitio distinto del sitio activo • No se supera con [S] elevada • Vmax disminuye – Vmax aparente < Vmax • No afecta a La KM Velocidad de reacción Sin inhibidor [S]
  • 119. 22 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Análisis Gráfico de la Inhibición Inhibición competitiva + Inhibidor competitivo Sin inhibidor + Inhibidor no competitivo Sin inhibidor Inhibición no competitiva -1/KM -1/KM ap 1/Vmax -1/KM -1/Vmax ap 1/Vmax
  • 120. Mecanismos Moleculares de Regulación Enzimática 23 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Permiten la adaptación de la actividad a necesidades fisiológicas, estados del desarrollo o condiciones ambientales – Regulación temporal/espacial • Utilización de isoenzimas – Regulación lenta • Control de la disponibilidad y de la vida media de la enzima – Regulación rápida • Control alostérico • Modificación covalente – Reversible – Irreversible
  • 121. Isoenzimas 24 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Son distintas formas de una misma enzima – Enzimas homólogas presentes en un mismo organismo • Cada isoenzima en un tejido diferente o en un momento del desarrollo diferente • Catalizan la misma reacción, con pequeñas diferencias – Pequeñas diferencias en su secuencia » Diferencias en su estructura » Distintos valores de KM y/o Vmax » Distintas propiedades reguladoras
  • 122. Vida Media y Disponibilidad de las Enzimas 25 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Muchas enzimas presentan una vida media corta – En las células existe un recambio proteico constante – La concentración de las enzimas se encuentra regulada • A través de la regulación de su síntesis – Regulación de la transcripción y de la traducción • A través de la regulación de su degradación – Mediada por ubiquitina y ejecutada por el proteasoma
  • 123. Enzimas Alostéricas 26 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Contienen varios centros y varias subunidades – Centros activos – Centro reguladores • Efecto alostérico – A través de cambios conformacionales • Alosterismo homotrópico – Entre centros equivalentes • Cooperatividad – Curvas sigmoides – No siguen la cinética de Michaelis-Menten • Alosterismo heterotrópico – De centros reguladores sobre centros activos sustrato [sustrato] V V Estado R Estado T
  • 124. 27 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Ejemplo de Enzima Alostérica Carbamilfosfato Aspartato + N-carbamilaspartato Aspartato transcarbamilasa ATCasa Citidin trifosfato CTP Producto final de la ruta Primer paso de la ruta de síntesis de nucleótidos de pirimidina Ruta de 9 pasos ATP Purinas Producción energética Activación R e t r o - i n h i b i c i ó n
  • 125. Estructura de la ATCasa Estructura cuaternaria: dos trímeros catalíticos + tres dímeros reguladores 28 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 126. Regulación Alostérica de la ATCasa Mecanismo de inhibición: Los inhibidores estabilizan las formas de baja afinidad (o formas T) Mecanismos de cooperatividad y de activación: Los sustratos y los activadores estabilizan las formas de alta afinidad (o formas R) 29 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Estado T (menos activo) Estado R (más activo) Favorecido por la unión del Inhibidor (CTP) Favorecido por la unión de los sustratos y del activador (ATP)
  • 127. Activación e Inhibición Alostérica Inhibición Activación 30 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) Mayor actividad y curva más sensible a la concentración de sustratos Menor actividad y curva menos sensible a la concentración de sustratos
  • 128. Modificación Covalente 31 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Irreversible – Activación por rotura proteolítica de precursores inactivos (zimógenos) • Enzimas de la digestión • Cascada de coagulación • Activación de caspasas en apoptosis • Reversible – Unión covalente de un grupo químico que altera las propiedades catalíticas de la enzima • Fosforilación- desfosforilación • Oxidación-reducción • Acetilación- desacetilación
  • 129. Cascada de la Coagulación 32 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 130. Regulación por Fosforilación Reversible 33 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) • Fosforilación – Transferencia de grupo fosforilo desde el ATP a grupos –OH de Ser Thr o Tyr – Cataliza por proteínas quinasa – A menudo desencadenan efectos amplificados • Una sola quinasa activa centenares de otras enzimas que. A su vez cada una de ellas activará centenares de otras enzimas, ... • Desfosforilación – Eliminación de grupo fosforilo de proteína fosforilada – Catalizada por proteína fosfatasa
  • 131. Regulación de rutas Metabólicas • Control a nivel de sustrato – La acumulación de producto inhibe la acción de la enzima • Control por retroinhibición – El producto final de una ruta inhibe el primer paso de la ruta Glucosa + ATP Glucosa-6-P + ADP Hexoquinasa Inhibición 34 Prof. J. Salgado (UVEG - 2005) A B C D N Retroinhibición
  • 132. Estructura y Función de los Ácidos Nucleicos Tema 5 1ª Parte: Estructura de los Ácidos Nucleicos 1 J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 133. 2 J. Salgado (UVEG - 2005) Los Ácidos Nucleicos son Polímeros de Nucleótidos Azúcar Azúcar Azúcar Azúcar Azúcar Fosfato Fosfato Fosfato Fosfato Fosfato Ácido Nucleico Esqueleto azúcar-fosfato Ribosa Desoxirribosa 5’ 3’ DNA y RNA se diferencian en el azúcar: En RNA En DNA Ácido desoxirribonucleico Ácido ribonucleico Átomos numerados con “primas”
  • 134. 3 J. Salgado (UVEG - 2005) Las Bases Pueden ser Purinas o Pirimidinas Purinas Pirimidinas Purina Pirimidina Adenina (A) Guanina (G) Citosina (C) Uracilo (U) Timina (T) Átomos numerados sin “primas” En el DNA se encuentran A, G, C y T En el RNA se encuentran A, G, C y U
  • 135. 4 J. Salgado (UVEG - 2005) Nucleótidos: Unidades Monoméricas de los Ácidos Nucleicos Nucleósido: Base + Azúcar Enlace β-glicosídico Ribosa A Adenosina Nucleótido: Nucleósido + Fosfato Enlace fosfoéster Ribosa A Adenosina 5’-trifosfato o adenilato 5’-trifosfato (5’-ATP) En el RNA: adenosina, guanosina, citidina, uridina En el DNA: desoxiadenosina, desoxiguanosina, desoxicitidina, desoxitimidina En el RNA: adenilato, guanilato, citidilato, uridilato En el DNA: desoxiadenilato, desoxiguanitato, desoxicitidilato, desoxitimidilato 1’ 9 5’
  • 136. La Cadena de Nucleótidos: Estructura Primaria Enlace fosfodiéster Esqueleto azúcar- fosfato DNA RNA Esqueleto azúcar- fosfato 5 J. Salgado (UVEG - 2005) 5’ 3’ Las secuencias de nucleótidos se escriben siempre en la dirección 5’ Æ 3’
  • 137. Estructura Secundaria del DNA 6 J. Salgado (UVEG - 2005) • La molécula de DNA se pliega localmente como una doble cadena heliciodal – Modelo de James Watson y Francis Crick (1953). Basado en: • Patrón de difracción de rayos X de Maurice Wilkins y Rosalind Franklin • Reglas de Erwin Chargaff – Las proporciones A:T y G:C son siempre cercanas a 1
  • 138. 7 J. Salgado (UVEG - 2005) La Doble Hélice del DNA “B” • Dos cadenas antiparalelas complementarias – Doble hélice a derechas – Plano de las bases perpendicular al eje de la hélice – ~10 pares de bases (pb) por vuelta • 3,4 Å entre bases • 36º de giro cada base Surco mayor Surco menor Desde arriba Cadenas azúcar- fosfato Bases Apiladas 5’ 3’ 3’ 5’
  • 139. Apareamiento entre Bases 8 J. Salgado (UVEG - 2005) Guanina Citosina Adenina Timina • Interacción específica entre pares purina- pirimidina – Tres enlaces de H entre G y C – Dos enlaces de H entre A y T • Adaptado a la anchura de la hélice • Facilita la replicación • Los apareamientos erróneos causan mutaciones
  • 140. Estabilidad de la Doble Hélice 9 J. Salgado (UVEG - 2005) • Enlaces por puente de hidrógeno entre las bases – Son más estables las uniones C≡G (tres enlaces) que las A=T (dos enlaces) • Efecto hidrofóbico – Interacciones hidrofóbicas entre las bases apiladas en el centro de la hélice • Fuerzas de van de Waals debidas al empaquetamiento de los anillos de las bases • Fuerzas electrostáticas – El DNA es un “polianión”. La repulsión entre las cargas negativas de los grupos fosfato se reduce por apantallamiento con • Cationes divalentes (Mg2+) • Proteínas básicas, ricas en Lys y Arg (Histonas) • Poliaminas
  • 141. Desnaturalización del DNA 10 J. Salgado (UVEG - 2005) Efecto hipercrómico: La absorbancia a 260 nm de las bases apiladas en la doble hélice es menor que en las hebras sencillas Absorbancia Temperatura Temperatura de fusión Longitud de onda (nm) Absorbancia Doble hélice Cadena sencilla Curva de fusión Doble hélice Cadena sencilla • Al calentar el DNA se separan las dos hebras de la doble hélice – La temperatura de fusión (Tm) depende de la proporción de pares C≡G frente a A=T – El proceso es reversible y cooperativo – En las células está catalizado por enzimas helicasas, e implica la hidrólisis de ATP
  • 142. Otras Estructuras Secundarias del DNA 11 J. Salgado (UVEG - 2005) • El DNA de cadena doble puede asumir distintas conformaciones debido a la flexibilidad del anillo de ribosa y al giro del enlace C1’—N – DNA “B” (de Watson y Crick) • En condiciones de humedad elevada – DNA “A” • En DNA parcialmente deshidratado • 11 pb por vuelta, diámetro=26 Å • Semejante a los dúplex de RNA y RNA/DNA – DNA “Z” • Hélice a izquierdas • 12 pb por vuelta, diámetro=18 Å • Puede aparecer en zonas con repeticiones CG • Posible función en la regulación de la expresión génica
  • 143. Superenrollamiento DNA circular relajado • Surge al girar una cadena doble de DNA cuyos extremos están fijos – Puede ser positivo (DNA sobre-enrollado) o negativo ( DNA infra-enrollado) • Es más común el negativo, y tiene importancia en los procesos de replicación y transcripción – Da lugar a una molécula más compacta 12 J. Salgado (UVEG - 2005) Relajado Superenrollado DNA circular superenrollado
  • 144. Superenrollamiento in vivo 13 J. Salgado (UVEG - 2005) • El superenrollamiento es un proceso catalizado que requiere energía de la hidrólisis de ATP – Llevado a cabo por las topoisomerasas • Topoisomerasas de tipo I – Catalizan el relajamiento del DNA superenrollado por corte de una de las hebras • Topoisomerasas de tipo II – Introducen superenrollamiento negativo por corte y giro de las dos hebras • En procariotas – Asociación del DNA a un núcleo central de proteínas – Superenrollamiento en “trenza” • En eucariotas – Asociación del DNA a núcleos sucesivos de proteínas – Superenrollamiento solenoidal compacto
  • 145. Genomas 14 J. Salgado (UVEG - 2005) • Se llama genoma al conjunto completo de información genética de un organismo – Se hereda de generación en generación – Codificado en secuencias de ácidos nucleicos – Organizado en cromosomas • Cada cromosoma contiene una sola molécula de DNA • Los genomas se diferencian por su tamaño y complejidad – En procariotas • Un solo cromosoma de DNA circular de cadena doble • Puede haber DNA extracromosómico circular de cadena doble (llamado plásmido) – En eucariotas • Múltiples cromosomas de DNA lineal de cadena doble • Genoma diploide, excepto en gametos (haploide) • Gran cantidad de DNA no codificador • Las mitocondrias y los cloroplastos tienen genoma propio (similar al genoma de procariotas) – En virus • Genoma de DNA o RNA, de cadena simple o doble, circular o lineal
  • 146. El Cromosoma Bacteriano 15 J. Salgado (UVEG - 2005) • Forma una estructura llamada nucleoide – DNA circular de cadena doble, superenrollado y unido a un núcleo central proteico • Tetrámeros de la proteína HU • Poliaminas catiónicas – Le permite comprimirse en un espacio pequeño • Cromosoma extendido (3x106 pb) Æ 1,5 mm • Cromosoma empaquetado Æ 2 µm Centro proteico Bucle relajado Bucles superenrollados Cromosoma de Escherichia coli
  • 147. Cromosomas Eucariotas 16 J. Salgado (UVEG - 2005) Diámetro del cromosoma Cromatina Histonas Nucleosoma Fibra condensada DNA Cromosoma • DNA lineal empaquetado alrededor de octámeros de histonas – Las histonas asociadas a DNA forman unidades repetidas cada 200 pb, llamadas nucleosomas – El conjunto se asocia en una fibra condensada que forma la cromatina – Se consigue una elevada compactación – La estructura de la cromatina regula la expresión génica
  • 148. Estructura de los Nucleosomas 17 J. Salgado (UVEG - 2005) • Unidades repetidas cada 200 pb – Nucleosoma: octámero de histonas + DNA enrollado (145 pb) – Las histonas son proteínas policatiónicas • Muchas Lys y Arg • Estabilización electrostática del DNA (son polianiones) – Cinco tipos de histonas • 2 x (H2A, H2B, H3, H4) forman el núcleo octamérico • H1 interacciona con el DNA conector y delimita al nucleosoma – Modificaciones covalentes de las histonas regulan la funcionalidad del DNA • Acetilación, metilación, fosforilación Núcleo de histonas Nucleosomas DNA enrollado (145 pb) DNA conector
  • 149. Tipos de RNA 18 J. Salgado (UVEG - 2005) • RNA mensajero (mRNA) – Se transcribe en el núcleo a partir de la secuencia de DNA de los genes. Su secuencia será leída en el citoplasma para dar lugar a proteínas específicas • RNA de transferencia (tRNA) – Transporta los aminoácidos hasta los ribosomas para formar las proteínas – Existen tipos específicos para cada aminoácido – Contienen diversas bases modificadas • RNA ribosómico (rRNA) – Principal componente de los ribosomas (formados también por proteínas) • RNA nuclear heterogeneo (hnRNA) – Transcritos primarios y precursores del mRNA en células eucariotas • RNA nuclear pequeño (snRNA) – En partículas ribunucleoproteicas nucleares. Participan en el procesamiento de otros RNA
  • 150. Estructura de los RNA 3’ 5’ 3’ 5’ Bucle Brazo Estructura primaria Estructura secundaria 19 J. Salgado (UVEG - 2005) • La mayoría son cadenas sencillas plegadas sobre sí mismas – No tienen aplicación las reglas de Chargaff • Excepción: Algunos virus de RNA de cadena doble – Distintos tipos de estructura secundaria • Bucles, horquillas, brazos • Regiones dúplex con apareamientos C≡G (tres enlaces de H) y A=U (dos enlaces de H) entre zonas palindrómicas complementarias – Forman hélices dextrógiras similares a las de el DNA – Adoptan una estructura terciaria compleja, por asociación de hélices y bucles Región palindrómica (autocomplementaria) 3’ 5’ Estructura terciaria de un tRNA
  • 151. Estructura de los tRNA 20 J. Salgado (UVEG - 2005) Brazo aceptor Anticodón Brazo del anticodón Brazo variable Brazo TΨC Bucle del anticodón Bucle TΨC Brazo DHU Bucle DHU Sitio de unión del aminoácido activado Bucle DHU Bucle del anticodón Bucle TΨC Extremo CCA 5’ 3’ • Estructura adaptada a su función • Forma de trébol – Cuatro brazos principales con zonas dúplex • Brazo aceptor –Une el aminoácido activado en el extremo CCA 3’ • Brazo del anticodón –Contiene la secuencia complementaria de los codones del mRNA • Contiene múltiples bases modificadas – Derivados metilados y dimetilados de A, U, C y G; pseudouridina (Ψ), dihidrouridina (DHU)
  • 152. Estructura del Ribosoma • Maquinaria de síntesis de las proteínas de gran tamaño molecular –Coeficiente de sedimentación 70S (Svedberg) en procariotas • Complejo ribonucleoproteico: 2/3 rRNA + 1/3 proteínas • Dos subunidades –50S (contiene rRNA 5S y 23 S + 34 polipéptidos) –30S (contiene rRNA 16 S + 21 polipéptidos) 21 J. Salgado (UVEG - 2005) Subunidad 50S Ribosoma (70S, 2700 kDa) Subunidad 30S
  • 153. Estructura del rRNA Estructura terciaria del rRNA 16S: Determinada mediante cristalografía de rayos X Estructura secundaria del rRNA 16S: Puede deducirse a partir de zonas de complementariedad de su secuencia 22 J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 154. Tema 5 2ª Parte: Procesos del Metabolismo Informacional 23 J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 155. Principios Fundamentales de la Biología Molecular 1. La información codificada en el DNA consiste en una secuencia específica de bases nitrogenadas – La REPLICACIÓN se basa en el apareamiento específico entre las bases de cadenas de DNA complementarias 2. La descodificación de la información genética para su utilización comporta la síntesis de RNA – La TRANSCRIPCIÓN se basa en el apareamiento específico entre bases de cadenas de DNA y cadenas de RNA 3. Con la intervención de varios tipos de RNA se sintetizan las proteínas, que son responsables de la mayoría de las funciones celulares – La TRADUCCIÓN de las secuencias de bases en secuencias de aminoácidos ocurre de acuerdo con el código genético 24 J. Salgado (UVEG - 2005) DNA RNA Proteínas transcripción traducción replicación
  • 156. Replicación 25 J. Salgado (UVEG - 2005) Molécula parental original Primera generación de moléculas hijas Segunda generación de moléculas hijas • Síntesis de copias nuevas de DNA a partir de un “molde” preexistente – Ocurre una sola vez en la vida de la célula, antes de la división celular – Proceso rápido y exacto, con mecanismos de reparación eficaces – Siempre se da en la dirección 5’ Æ 3’ • La replicación es semi- conservadora – Cada hebra de una cadena doble de DNA sirve de molde para la síntesis de una hebra complementaria
  • 157. Requerimientos para el Proceso de Replicación 26 J. Salgado (UVEG - 2005) •Molde de DNA preexistente –Cadena (o fragmento de cadena) simple •Cebador (“primer”) –Pequeño fragmento de RNA (~5 nucleótidos) con el grupo 3’-OH libre, unido al DNA molde (sintetizado por la primasa del primosoma) •Precursores activados –Desoxinucleótidos 5’-trifosfato (dATP, dGTP, dTTP, dCTP) •DNA-polimerasas –Catalizan la formación de enlaces fosfodiéster dirigida por un molde de DNA (actividad polimerasa 5’ Æ 3’) y la corrección de errores (exonucleasa 3’ Æ 5’) –Requieren Mg2+ y un cebador con su extremo 3’-OH libre –Tres tipos: •DNA polimerasa I (Pol I): Elimina el cebador mediante una actividad exonucleasa 5’ Æ 3’ y sintetiza DNA en su lugar •DNA polimerasa II (Pol II): Función desconocida (quizá similar a la Pol I) •DNA polimerasa III (Pol III): Síntesis de la nueva cadena de DNA a partir del cebador •Otras enzimas –Primasa: RNA polimerasa que sintetiza el cebador. Forma parte del primosoma –Helicasa (Dna B): Separa las dos hebras del DNA dúplex. Requiere ATP –Girasa (topoisomerasa II): Genera superenrollamiento negativo. Requiere ATP –Ligasa: Une fragmentos nuevos sintetizados
  • 158. 27 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Replicación: Iniciación 1. La replicación se inicia en lugares específicos – En procariotas el origen es único, y se llama locus oriC • Contiene secuencias de ricas en AT y cuatro sitios de unión para la proteína DnaA – La unión de la DnaA inicia el proceso 2. La helicasa, DnaB, separa las dos hebras de DNA – Se forman un ojo y dos horquillas de replicación – El proceso genera tensión (enrollamiento) que es relajada por la acción la girasa • Topoisomerasa II que introduce superenrollamiento negativo (con consumo de ATP) 3. Las cadenas simples se estabilizan por las SSB (proteínas de unión a cadena simple) Secuencia consenso (13 pb) secuencias ricas en AT en tandem Sitios de unión para la proteína DnaA Origen de replicación en E. coli tetrámeros SSB en las horquillas de replicación ojo de replicación horquilla de replicación ATP helicasa ADP+Pi girasa girasa
  • 159. 28 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Replicación: Elongación 4.La primasa del primosoma sintetiza cebadores de RNA sobre las hebras simples de la horquilla 5.La Pol III sintetiza nuevo DNA a partir del cebador – Siempre en dirección 5’Æ3’ • La hebra guía se sintetiza de manera continua • La hebra retardada forma un bucle donde la síntesis de DNA ocurre de manera discontinua en fragmentos de Okazaki 6.La Pol I elimina los RNA cebadores y sintetiza DNA en su lugar – Tiene actividad exonucleasa 5’Æ3’ y polimerasa 5’Æ3’ 7.Los fragmentos de la hebra retardada son ligados por la DNA ligasa Helicasa Hebra retardada Proteínas SSB Primosoma 5’ 5’ 5’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ Primasa Holoenzima DNA Pol III 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ 3’ Girasa Hebra guía DNA Pol I DNA ligasa Fragmentos de Okazaki Cebador
  • 160. 29 J. Salgado (UVEG - 2005) La maquinaria de replicación Girasa (topoisomerasa) Avance de la horquilla Primosoma Proteína abrazadera Dímero de Pol III Proteína pinza Cadena guía Cadena retardada Ligasa Pol I Fragmento de Okazaki Cebador (RNA) Proteínas de Unión a cadena simple (SSB) Helicasa Cebador Replisoma Holoenzima Pol III: Dímero asimétrico Sintetiza la cadena guía Sintetiza la cadena retardada
  • 161. Mutaciones 30 J. Salgado (UVEG - 2005) • Cambios en la secuencia del DNA. Tipos: –Sustitución de un par de bases por otro –Eliminación (deleción) de parte de la secuencia –Inserción de pares de bases • Pueden ocurrir de manera espontánea –Transiciones A<>G o T<>C debidas a tautomerizaciones • Amino (-NH2) Æ imino (=NH) • Ceto ( ) Æ enol ( ) • Pueden deberse a agentes mutagénicos –Radiación ultravioleta –Reactivos químicos –Moléculas aromáticas planas (agentes intercalantes) Citosina Tautómero imino de Adenina Mutación por tautomerización: Apareamiento anómalo Æ transición Mutación por radiación: La luz ultravioleta produce dímeros de pirimidina C=O C-OH Dímero de timina
  • 162. 31 J. Salgado (UVEG - 2005) Mecanismos de Reparación • El nivel de fidelidad de las copias de DNA es muy alto, debido a: –La especificidad enzimática de la maquinaria replicativa –La corrección de errores de las DNA polimerasas mediante “prueba de lectura” • Detectan nucleótidos incorrectos y los eliminan “hacia atrás” (actividad exonucleasa 3’Æ5’) –Los mecanismos de reparación post-replicativos • Reparación directa • Reparación por escisión de bases • Reparación por escisión de nucleótidos • Reparación directa –La región dañada se corrige “in situ” • La DNA fotoliasa utiliza energía de la luz para eliminar los dímeros de pirimidina formados por radiación UV • Por escisión de bases –Las bases dañadas se retiran y se reemplazan • Por escisión de nucleótidos –Se elimina y se reemplaza un fragmento en torno a la zona dañada • La escinucleasa urvABC escinde 12 nucleótidos en la zona dañada • Regeneración a cargo de la DNA Pol I y la DNA ligasa
  • 163. Replicación en Eucariotas • Los eucariotas poseen cinco DNA polimerasas – α, inicia la síntesis – β, función de reparación – δ, elongación – ε, papel desconocido – γ, replicación del genoma mitocondrial 32 J. Salgado (UVEG - 2005) • Más compleja y más lenta que en procariotas – Por el mayor tamaño y complejidad del genoma • Múltiples orígenes de replicación – Cada uno representa una unidad de replicación (replicón) bidireccional • La replicación se encuentra regulada de acuerdo con el ciclo celular – Síntesis de DNA limitada a la fase S, y coordinada con la división celular (mitosis) Ciclo celular Comienza la síntesis de DNA Comienza la mitosis
  • 164. Expresión Génica 33 J. Salgado (UVEG - 2005) • Expresión de la información genética (secuencias de DNA) – Síntesis de las moléculas que realizan funciones • Principalmente proteínas • El molde para la síntesis de proteínas es mRNA – Además, tRNA y rRNA participan en la síntesis de proteínas • La expresión génica consta de dos procesos – Transcripción • Síntesis de los RNA a partir de DNA molde – Traducción • Síntesis de proteínas a partir de un molde de mRNA Cromosoma Genes Transcripción DNA (genoma) Transcrito RNA (transcriptoma) Proteína (proteoma) Traducción
  • 165. Transcripción • Síntesis de RNA a partir de un “molde” de DNA – Siempre se da en la dirección 5’Æ3’ – No requiere cebador – Implica segmentos cortos (regiones codificadoras) que no se transcriben necesariamente de manera simultanea – Ocurre múltiples veces a lo largo de la vida de la célula • Sólo una hebra del DNA actúa como molde – El nuevo RNA es complementario de la hebra molde (-) – El nuevo RNA tiene la misma secuencia que la hebra codificadora (+), pero tiene U en lugar de T • Como referencia, la dirección de la hebra codificadora se utiliza como dirección del gen 34 J. Salgado (UVEG - 2005) RNA polimerasa Enrollamiento Desenrollamiento Hebra molde Hebra codificadora RNA naciente Doble hélice híbrida RNA-DNA Avance de la polimerasa Punto de elongación
  • 166. Requerimientos para la Transcripción 35 J. Salgado (UVEG - 2005) RNA polimerasas De procariotas De eucariotas Inicio de la transcripción Secuencia Consenso (caja TATA o Pribnow) +1 -10 Unidad de transcripción Terminador Promotor +1 -35 -10 • Unidad de transcripción de DNA con promotor y terminador – Promotor: secuencia específica de tamaño variable • En ella se encuentran dos secuencias consenso a ~ -35 y -10 pb con respecto al sitio de inicio • RNA polimerasa – Complejo de cinco tipos de polipéptidos: α, β, β’, ω, σ • El factor σ reconoce el sitio de inicio permite la unión a la cadena molde • α2, β, β’ y ω forman la enzima central que cataliza la síntesis de RNA • No tiene actividad nucleasa (no puede corregir errores) • Nucleótidos activados – CTP, GTP, ATP, UTP
  • 167. 36 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Transcripción: Iniciación 1.La holoenzima α2ββ’ωσ reconoce al promotor de una unidad de transcripción –El reconocimiento se debe al factor σ • Existen distintos factores σ para distintos tipos de promotores 2.Apertura del promotor –Desenrollamiento y separación de las cadenas de DNA en la zona de inicio 3.Unión del primer nucleótido trifosfato a la RNA polimerasa – Suele ser ATP o GTP – Se une por apareamiento de bases a la hebra molde de DNA Apertura del promotor DNA de doble hélice DNA desenrollado (abiertos 17 pb) RNA polimerasa
  • 168. 37 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Transcripción: Elongación RNA polimerasa Enrollamiento Desenrolla- miento Hebra molde Hebra codificadora RNA naciente Doble hélice híbrida RNA-DNA Avance de la polimerasa Punto de elongación P P P OH X 5’ 3’ Burbuja de transcripción 4.Unión de sucesiva de los siguientes nucleótidos – Cada uno se une al 3’-OH libre del anterior por enlace fosfodiéster – Se van seleccionando por apareamiento específico con la hebra de DNA molde • Se forma una hélice dúplex híbrida DNA/RNA de ~8 pb – La región que contiene la RNA polimerasa y la hélice híbrida se llama burbuja de transcripción 5.Avance de la burbuja – La hélice de DNA se va desenrollando por delante y enrollando por detrás – El factor σ se suelta. α2ββ’ω continúa hasta la terminación Unión sucesiva de nuevos nucleótidos X P P P P OH Y YTP PPi 3’ 5’ Enlace fosfodiéster
  • 169. 38 J. Salgado (UVEG - 2005) Proceso de Transcripción: Terminación 6. Llegada a la señal de terminación en la hebra molde – Secuencia palindrómica rica en GC seguida de secuencia rica en AT • Se forma una estructura en horquilla en el RNA transcrito • La polimerasa se para y el híbrido DNA/RNA se vuelve inestable • La transcripción finaliza en los residuos de U que siguen a la horquilla 7. Disociación – Disociación del híbrido DNA/RNA – Fusión y enrollamiento del DNA abierto – Desprendimiento de la RNA polimerasa • Terminación dependiente del factor ρ (en algunos casos) – Actividad DNA/RNA helicasa, dependiente de ATP, que disocia el complejo de transcripción Región palindrómica (autocomplementaria) Oligo poliU Señal de terminación Terminación dependiente del factor ρ Factor ρ (hexámero) RNA polimerasa DNA/RNA RNA 5’
  • 170. 39 J. Salgado (UVEG - 2005) Regulación de la Transcripción (en Procariotas) • Constituye el control más importante de la expresión génica • La afinidad de la RNA polimerasa por el promotor es el primer nivel de control – Depende de la secuencia del promotor y del tipo de factor σ • Genes de expresión constitutiva – Son transcritos continuamente • Genes inducibles – Su transcripción varía según las condiciones o las necesidades metabólicas • Se regulan a través de centros operadores – secuencias reguladoras cercanas al promotor • Algunos genes que participan en una misma adaptación regulan su expresión de manera conjunta – Forman unidades de expresión llamadas operones
  • 171. Modelo del Operón de Jacob y Monod 40 J. Salgado (UVEG - 2005) • Gen regulador (i) – Contiene su propio promotor – Codifica la proteína represora (represor) • Operón. Consta de: – Secuencias de regulación • Promotor • Operador – Genes estructurales • Codifican proteínas que participan en una misma adaptación • Puede regularse por inducción o por represión Esquema general del modelo del operón Gen regulador Centros de control Genes estructurales Operón Esquema del operón de la lactosa Operón de la lactosa
  • 172. Inducción: El Operón de la Lactosa En ausencia de lactosa 41 J. Salgado (UVEG - 2005) • Regula en paralelo la expresión de enzimas relacionadas con la utilización de lactosa en ausencia de glucosa – β-galactosidasa (z) – Galactosido permeasa (y) – Tiogalactosido transacetilasa (a) • En ausencia de lactosa – No hay inductor – El represor sin inductor se une al operador – Impide a la RNA polimerasa transcribir z, y, a • En presencia de lactosa – Se forma el inductor alolactosa – El represor con inductor inactiva al represor – Los genes z, y, a se transcriben En presencia de lactosa El represor unido al centro operador bloquea la transcripción de los genes z, y, a Represor β-galactosidasa Permeasa Trans- acetilasa Inductor Alolactosa (o molécula análoga) Metabolismo de la lactosa RNA pol bloqueada RNA pol no bloqueada
  • 173. Represión: El Operón del Triptófano 42 J. Salgado (UVEG - 2005) trpL trpE trpD trpC trpB trpA o p trpR p En ausencia de Trp RNA pol no bloqueada mRNA mRNA Enzimas de la síntesis del Trp Represor inactivo trpL trpE trpD trpC trpB trpA o p trpR p En presencia de Trp RNA pol bloqueada mRNA Represor inactivo Represor activo Trp (corepresor) • Regula en paralelo la expresión de enzimas relacionadas con la síntesis de Trp • El Trp actúa como “corepresor” • En ausencia de triptófano – El represor no puede unirse al operador – La RNA polimerasa transcribe los genes relacionados con la síntesis de Trp • En presencia de Trp – El Trp se une al represor – El complejo activo represor/Trp se une al operador – La RNA polimerasa queda bloqueada
  • 174. Procesamiento Post-transcripcional en Procariotas 43 J. Salgado (UVEG - 2005) Ribonucleasa P tRNA Ribonucleasa III Ribonucleasa III rRNA 16S rRNA 23S rRNA 5S 5’ 3’OH tRNA 5’ CCA-3’OH 1- Corte 2- adición de CCA tRNA maduro 5’ CCA-3’OH 3- Modificación de bases • Procesamiento: – Modificación Post- transcripción de algunos RNA transcritos – Transcrito primario • RNA recién sintetizado, no modificado • En procariotas – Los mRNA no se procesan – Los rRNA y tRNA se obtienen por corte y modificación de transcritos primarios • Intervienen RNAs catalíticos
  • 175. Transcripción en Eucariotas 44 J. Salgado (UVEG - 2005) • Tiene lugar en el núcleo • Existen tres tipos de RNA polimerasas (cada una reconoce un tipo de promotor) – RNA polimerasa I • Sintetiza precursores de los rRNA – RNA polimerasa II • Sintetiza precursores de los mRNA – RNA polimerasa III • Sintetiza precursores de los tRNA • Promotores complejos y secuencias potenciadoras – Caja TATA entre –30 y –100 – Otras secuencias (caja CAAT, caja GC) • Son necesarios los “factores de transcripción” – Se unen a los promotores y secuencias potenciadoras – Guían la unión de la polimerasa
  • 176. Procesado en Eucariotas 45 J. Salgado (UVEG - 2005) • En eucariotas, todos los productos de la transcripción deben procesarse • En los pre mRNA se modifican los extremos 5’ y 3’ – Casquetes 5’: en el extremo 5’ se añade 7-metilguanosina y se metilan algunas ribosas – En el extremo 3’ se añade una cola de poli(A) de ~250 residuos • Maduración: – Eliminación de intrones por corte y empalme • Llevada a cabo por partículas ribonucleoproteicas nucleares pequeñas (snRNPs) – Contienen RNA catalítico (ribozimas) • El conjunto mRNA + snRNPs se llama espliceosoma – Algunos RNA son capaces de automadurarse (RNA autocatalítico) Pre mRNA 5’ 3’ 7 7-metil- guanosina 2’-metilribosa 2’ Espliceosoma Complejo U4-U5-U6 Pre mRNA Exón 1 Exón 2 Intrón
  • 177. Traducción 46 J. Salgado (UVEG - 2005) • Síntesis de proteínas a partir de un molde de mRNA – En procariotas ocurre inmediatamente después de la transcripción • El transcrito primario sirve de mRNA • Transcripción y traducción pueden ocurrir simultáneamente – En eucariotas está separada de la transcripción en espacio y tiempo • El transcrito primario se procesa y el mRNA se transporta fuera del núcleo • Permite una regulación más compleja Expresión de proteínas en procariotas Ribosoma Proteína naciente Ribosoma Proteína naciente Expresión de proteínas en eucariotas Núcleo Transcrito primario Citosol Transporte Procesado
  • 178. Requerimientos para la Traducción 47 J. Salgado (UVEG - 2005) • mRNA – Molde con la secuencia organizada en codones • Los codones son tripletes de bases del mRNA • Son “leídos” por apareamiento específico con anticodones de los aminoacil-tRNA • Debe contener al menos una pauta abierta de lectura – En procariotas suelen existir mRNAs policistrónicos (o poligénicos) que contienen varias pautas abiertas de lectura en tandem • Ribosoma – Complejo ribonucleoproteico de rRNA y proteínas – Une el mRNA molde y los distintos tRNA – Cataliza la formación de los enlaces peptídicos de la nueva proteína • tRNA – Específicos para cada uno de los 20 aminoácidos (al menos uno por aminoácido) • Transportan los aminoácidos activados hasta el ribosoma – Cada uno contiene un anticodón (complementario con un codón del mRNA) • Aminoacil-tRNA sintetasas – Activan y unen un aminoácido a cada tRNA • Específicas para cada aminoácido • Interpretan el código genético – Requieren ATP • Diversos factores proteicos
  • 179. Características del Código Genético 48 J. Salgado (UVEG - 2005) • Es la relación entre la secuencia de bases del DNA (o de su mRNA transcrito) y la secuencia de aminoácidos de las proteínas – Codón: grupo de tres bases que codifican un aminoácido – Las secuencias se leen a partir de un punto de inicio (AUG) • El codón de iniciación establece el marco o pauta de lectura – El resto de codones se leen a partir del de iniciación – El código no solapa – El código está degenerado • 64 tripletes posibles para 20 aminoácidos más la parada – Todos los aminoácidos, excepto Trp y Met, se codifican por más de un codón – Hay tres codones de terminación (UAA, UAG y UGA) – Los codones sinónimos difieren casi siempre en la última base (las dos primeras especifican la identidad del aminoácido) – El código genético es casi universal • Las mitocondrias y los protozoos ciliados tienen algunos codones diferentes
  • 180. 49 J. Salgado (UVEG - 2005) El Código Genético Primera posición (extremo 5’) Segunda posición Tercera posición (extremo 3’)
  • 181. Variaciones del Código en Mitocondrias Codón Código estándar Código mitocondrial 50 J. Salgado (UVEG - 2005)
  • 182. Los tRNA 51 J. Salgado (UVEG - 2005) • Moléculas “adaptadoras” – Se unen a codones específicos y transportan aminoácidos específicos – Anticodón y sitio del aminoácido están en brazos opuestos • Muchas bases poco comunes – Impiden apareamientos normales – Facilitan interacciones especiales • Relacionadas con su estructura terciaria • Relacionadas con interacciones con la aminoacil-tRNA sintetasa y proteínas ribosómicas • Aminoacil-tRNA – Intermediario de la síntesis de proteínas • Éster de tRNA+aminoácido Sitio de unión del aminoácido Nucleósidos modificados UH2: dihidrouridina I: inosina mG: metilguanosina m2G: dimetilguanosina T: ribotimidina ml: metilinosina Ψ: pseudouridina tRNA de la alanina 5’ 3’
  • 183. Las aminoacil-tRNA sintetasas 52 J. Salgado (UVEG - 2005) • Catalizan la adición de un aminoácido sobre su tRNA – Dos etapas catalizadas por la misma enzima • Activación del aminoácido – Formación del intermediario activado aminoacil-AMP » Se consume ATP y se desprende pirofosfato (PPi) – Una pirofosfatasa hidroliza el PPi para impulsar la reacción » Consume una segunda molécula de ATP • Transferencia del aminoácido activado a su tRNA específico – Se transfiere sobre el grupo 2’-OH o 3’-OH libre del tRNA – Se forma un aminoacil-tRNA mediante enlace éster Aminoacil-tRNA tRNA 3’ Adenina aminoácido
  • 184. Especificidad de las aminoacil-tRNA sintetasas 53 J. Salgado (UVEG - 2005) • Doblemente específicas por reconocimiento molecular – Para cada aminoácido • Reconocen propiedades de carga, hidrofobicidad, tamaño – Para cada tRNA correspondiente • Interaccionan específicamente con el brazo aceptor y con el brazo del anticodón – “Conocen” e interpretan el código genético • Son capaces de corregir errores – Contienen sitios especiales de “revisión” • Si el aminoácido es incorrecto es hidrolizado del tRNA • Alta fidelidad Brazo aceptor Sitio de revisión Sitio de activación Lazo del anticodón tRNA Aminoacil-tRNA sintetasa Complejo treonil-tRNA sintetasa Reconocimiento Específico del Lazo del anticodón
  • 185. El Ribosoma (Procariota) 54 J. Salgado (UVEG - 2005) Sitio de formación del enlace peptídico (formado por RNA) Estructura del Ribosoma • Coordina las interacciones entre el molde (mRNA) y el adaptador (tRNA) • Complejo supramolecular de RNA y proteínas – La funcionalidad principal se debe a los rRNA (ribozimas) – Tres tipos de rRNA (5S, 16S, 23S) procedentes de un transcrito común (30S) – Dos subunidades • Grande (50S) – Función de catálisis (actividad peptidil transferasa) • Pequeña (30S) – Función de reconocimiento – Las proteínas del ribosoma tienen una función estructural
  • 186. Sitios de Unión en el Ribosoma 55 J. Salgado (UVEG - 2005) • Sitios de unión para los tRNA – Sitio A •Para la unión de los aminoacil-tRNA – Sitio P •Para la unión del peptidil-tRNA – Sitio E •Sitio de salida del tRNA recién descargado • Sitio de unión del mRNA – En la subunidad 30S •En el rRNA 16S de esta subunidad se encuentra un sitio de reconocimiento de la secuencia de iniciación del mRNA • Vía de salida del nuevo polipéptido – Túnel a través de la subunidad 50S •Conecta con el sitio activo, donde se forma el enlace peptídico Sitio E Sitio P Sitio A 30S 50S Túnel de la subunidad 50S
  • 187. Características de la Traducción 56 J. Salgado (UVEG - 2005) • La dirección de la síntesis de proteínas es siempre N-terÆC-ter • El mRNA molde se lee en dirección 5’Æ3’ • El aminoácido que se incorpora viene determinado sólo por las interacciones codón-anticodón – Excepto en el caso del 1er aminoácido, donde se reconoce específicamente un aminoacil-tRNA de iniciación por el factor de iniciación 2 (IF2) – Se reconocen principalmente las dos primeras bases del codón (balanceo de las bases) • Existe cierta libertad en el apareamiento de la tercera base • La estereoespecificidad es importante para la formación del enlace peptídico – No pueden utilizarse D-aminoácidos
  • 188. Señal de Iniciación en Procariotas 57 J. Salgado (UVEG - 2005) • La traducción comienza en un punto específico – El codón de iniciación es AUG (Met) • Se encuentra precedido de la secuencia de Shine- Dalgarno, rica en purinas (G,A) lo que le diferencia de otros AUG internos • La secuencia de Shine-Dalgarno interacciona específicamente con una zona del rRNA 16S rica en pirimidinas (C,U) – El codón de iniciación aparea específicamente con un aminoacil-tRNA iniciador que contiene N-formilmetionina en lugar de metionina (fMet-tRNAf)
  • 189. Mecanismo de la Traducción: Iniciación 58 J. Salgado (UVEG - 2005) 1.Formación del complejo de iniciación 70S –Previamente se ensambla un complejo de 30S que contiene: • mRNA unido a la subunidad 30S con la secuencia de Shine-Dalgarno interaccionado con rRNA 16S • fMet-tRNAf unido en el sitio P y apareado con el codón de iniciación –El ensamblaje es ayudado por los factores de iniciación IF1, IF2, IF3 • Requiere GTP Subunidad 30S Factores de iniciación Complejo de iniciación 30S Complejo de iniciación 70S Subunidad 50S + H2O
  • 190. Mecanismo de la Traducción: Elongación 59 J. Salgado (UVEG - 2005) 2.Transporte del segundo aminoacil-tRNAs (y sucesivos) al sitio A del ribosoma –Dependiente de factores de elongación EF-Tu y EF-Ts y de GTP 3.Formación del enlace peptídico –Transferencia de grupo peptidil al tRNA del sitio A 4.Translocación simultanea de los tRNAs y del mRNA –Dependiente del factor de elongación EF-G y de GTP •Movimiento del mRNA en la distancia de un codón •Movimiento del tRNA vació al sitio E •Movimiento del peptidil-tRNA al sitio P (el sitio A queda libre) 5.Disociación del tRNA libre Transporte y unión del aminoacil-tRNA GTP GDP + Pi EF-Tu EF-Ts Formación del enlace peptídico Translocación GTP GDP + Pi EF-G
  • 191. Mecanismo de la Traducción: Terminación 60 J. Salgado (UVEG - 2005) 6. Llegada de un codón de parada (UAA, UGA o UAG) del mRNA al sitio A – El codón de terminación es reconocido por un factor de liberación (RF1 o RF2) • Estos son proteínas (no hay tRNA para los codones de terminación) – El reconocimiento es ayudado por el factor de liberación RF3 • Requiere GTP 7. Hidrólisis del enlace éster que une el polipéptido al tRNA y liberación del polipéptido 8. Liberación del mRNA y del último tRNA y disociación del complejo de traducción – Requiere el factor de liberación del ribosoma (RRF) y GTP
  • 192. Síntesis de Proteínas en Eucariotas 61 J. Salgado (UVEG - 2005) • Las principales diferencias con respecto a procariotas son: – Tamaño del ribosoma • En eucariotas el ribosoma es de 80S, con dos subunidades de 60S y 40S – Iniciación • Se inicia con Met y no con N-formil-Met, aunque también existe un tRNA especial de iniciación • No hay secuencia de Shine-Dalgarno • El codón de iniciación se encuentra por rastreo (es el más próximo a 5’). Los mRNA son monocistrónicos – Los eucariotas presentan un mayor número de factores de traducción
  • 193. TEMA 6 TEMA 6 Introducción a la Bioenergética 1. Repaso de conceptos importantes 2. Acoplamiento entre las reacciones endergónicas y exergónicas 3. Sistema ATP/ADP 4. Termodinámica del transporte a través de membrana 5. Teoría quimiosmótica 6. ATP sintasa
  • 194. Introducción a la Bioenergética ‰ La formación o ruptura de cada biomolécula lleva asociado un cambio de energía. La Termodinámica es el campo de la química que estudia esos cambios de energía. ‰ El objetivo de la termodinámica es predecir si una reacción ocurrirá espontáneamente: si continuará sin necesidad de aporte energético una vez ha comenzado. ‰ Los sistemas biológicos no vulneran la segunda ley de la termodinámica.
  • 195. El cambio de energía libre de Gibbs (∆G) es la función termodinámica más útil para predecir la espontaneidad de una reacción. ∆G = ∆H-T∆S ‰ Una reacción es espontánea cuando ∆G es negativo. ‰ Concepto de reacción endergónica y exergónica ‰ La ∆G estándar biológica (∆Gº’):Reacciones que se producirán en las condiciones: ¾ 1M de concentración de solutos. ¾ pH 7.0 ([H+]= 10-7 M) ¾ 25ºC ¾1 at de presión
  • 196. En cualquier reacción de un ser vivo la ∆G debe ser menor de cero para que se formen productos ‰ En el equilibrio, ∆GR = 0 ∆GRº´ = - RT ln Keq En la reacción A + B C + D ∆GR = ∆GRº´ + RT ln [C] [D] [A] [B] ‰ Según la concentración de sustratos y productos en la célula (o en un compartimento de ésta), el signo de ∆G puede cambiar
  • 197. Reacciones acopladas ‰ Muchos procesos bioquímicos endergónicos se realizan gracias al acoplamiento a reacciones exergónicas. por ejemplo: ∆Gº’(kcal/mol) 1. glucosa-6-P Æ fructosa-6-P + 0.4 2. fructosa-6-P + ATP Æ fructosa-1,6-bisP + ADP - 3.4 3. glucosa-6-P + ATP Æ fructosa-1,6-bisP + ADP - 3.0 La reacción total 3 (suma de 1+2) es exergónica. La suma de ∆G1º’ + ∆G2º’ es ∆G3º’ o –3.0 kcal/mol: La reacción completa es espontánea.
  • 198. Sistema ATP-ADP ‰ ATP suministra energía libre para conducir muchas reacciones endergónicas ‰ Los otros nucleósidos trifosfato (GTP, UTP y CTP) pueden dirigir reacciones de forma análoga al ATP, aunque el ATP se encuentra en mucha mayor concentración en las células enlaces anhídrido fosfórico Adenosina trifosfato (ATP)
  • 199. La hidrólisis de los enlaces anhídrido fosfórico del ATP desprende gran cantidad de energía libre * ** * Adenosina trifosfato (ATP) ∆Gº’ ATP + H2O ADP + Pi -30.5 kJ/mol * ATP + H2O AMP + PPi -32.2 kJ/mol ** AMP + H2O Adenosina + Pi -14.0 kJ/mol * ADP + Fosfato inorgánico (Pi) AMP + Pirofosfato inorgánico (PPi)