1. Amanda Sánchez López
23/04/2014
amanda_sl15@hotmail.com
TÉCNICAS INTRUMENTALES
BÁSICAS

2. ESQUEMA
1- TECNICAS ELECTROFORÉTICAS
• Fundamento físico-químico
• Ventajas
• Factores que afectan a la electroforesis
• Tipos de electroforesis
2- WESTERN BLOT
3- SHOUTHERN BLOT
4- NORTHEN BLOT

3. ELECTROFORESIS

4. FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
DEFINICIÓN:
Técnica utilizada para la SEPARACIÓN, PURIFICACIÓN E
IDENTIFICACIÓN de partículas.
Basada en la migración de las misma por la acción de un
campo eléctrico.
CÁTODO ÁNODO

5. FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
q
E
L
FEFf
CÁTODO ÁNODO
μ
r
f Ff

6. FUNDAMENTO FISICO-QUIMICO
Las biomoléculas se separan en función de:
- Carga electrica
- Tamaño y forma
• A mayor carga, mayor movilidad
• A mayor tamaño, menor movilidad
• A mayor viscosidad del medio, menor movilidad
U  Movilidad electroforérica.
Velocidad de la particular por
unidad de campo

7. VENTAJAS DE LA TÉCNICA
• Sensibilidad
• Elevado poder de resolución
• Versatilidad
• Posibilidad de separar mezclas complejas
• Aporta potente criterio de pureza
• Posibilidad de determinar otros parámetros: Pm, pI, nºde
cadenas polipeptídicas

8. FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
CAMPO ELECTRICO / FUENTE DE ALIMENTACIÓN
•Diferencia de potencial entre los electrodos (Voltios)
•Intensidad de corriente (Amperios)  [Ley de Ohm(V = i x R)]
•Resistencia (Ohmios)
•Temperatura (efecto Joule)
MUESTRA
• Carga, forma y tamaño de la molécula
TAMPÓN
• Fuerza iónica, pH

9. FACTORES QUE AFECTAN A LA ELECTROFORESIS
SOPORTE
• NO RESTRICTIVO
Permite el paso de la muestra. No supone un impedimento para la misma.
Proteinas.
La muestra se separa en función de la densidad de carga (relación masa y carga)
• RESTRICTIVO
Por su composición ofrecen un impedimento al paso de las muestras.
En condiciones generals, la separación dependerá de la forma, tamaño y carga

10. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

11. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

12. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Separar, identificar y purificar moléculas o
fragmentos de DNA o RNA
MIGRACIÓN
• ÁNODO (+)
• Relación carga-masa igual
• Tamaño y forma
Soportes restrictivos  Agarosa disuelta en un buffer
Agarosa Tamaño
poros
Mejor separación
fragmentos grandes

13. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
Separar, identificar y purificar moléculas o
fragmentos de DNA o RNA
MIGRACIÓN
• ÁNODO (+)
• Relación carga-masa igual
• Tamaño y forma
Soportes restrictivos
DETECCIÓN
Bromuro de etidio.
Agente intercalante fluorescente

14. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

15. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS

16. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
EtBr
Tª

17. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
EtBr
Tª

18. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
EtBr
Tª
Glucosa/glicerol y colorante

19. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
MARCADOR DE PESO MOLECULAR
(PM)
ESTIMACIÓN DE PM

20. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

21. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
• La acrilamida polimeriza por la
acción del TEMED y el PSA
(persulfatoamónico)
• La metilen-bis-acrilamida forma
enlaces cruzados entre los
polímeros de acrilamida
• En conjunto se forma una especie
de malla cuyo diámetro de poro
viene determinado por la
concentración de acrila-mida/bis-
acrilamida (%)

22. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA

23. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA

24. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Uniformidad del
gel
Conformación de la
proteína
Gel
uniforme
Gel
discontinuo
NO
Desnaturalizante
Desnaturalizante

25. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Uniformidad del
gel
Conformación de la
proteína
Gel uniforme Gel discontinuo
NO
Desnaturalizante
Desnaturalizante
NO
Desnaturalizante
Desnaturalizante

26. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
GEL DISCONTINUO
GEL “STACKING”(EMPAQUETADOR)
•Menor concentración de
acrilamida
•Tamaño de poro
Función: Acumular las proteínas a la
entrada del gel separador para que
salgan al mismo tiempo
GEL “RUNNING”(SEPARADOR)
•Mayor concentración de acrilamida
•Tamaño de poro menor
Función: separar las proteínas
STACKING
RUNNING

27. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Las proteinas se pueden separar por: Tamaño, forma y carga eléctrica
La mayoría de las proteínas
estarán cargadas negativamente

28. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
Puentes disulfuro

29. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

30. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES

31. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
A igual tamaño
migra más la de
mayor carga
A igual carga
migra más la de
menor tamaño

32. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
80KDa 40KDa

33. 80KDa
40KDa
TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
80KDa 40KDa

34. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES NO DESNATURALIZANTES
VENTAJAS
• Separa proteínas en estado nativo
• Las proteínas siguen siendo funcionales
• Permite separar complejos proteicos o proteínas multiméricas como una
unidad
• Excelente herramienta para detectar cualquier proceso que altere la carga o la
conformación de una proteína
INCONVENIENTES
• Muchas proteínas no migran por no tener carga neta o por poseer carga neta
positiva
• El proceso de separación es muy lento debido a la debilidad de la carga neta
de las proteínas
• El proceso de separación no sólo estáafectado por el tamaño sino también por
la forma de la proteína

35. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

36. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
Las proteínas pierden su conformación nativa
1. Se emplean AGENTES DESNATURALIZANTES (urea, detergentes), el SDS
(sodiumdodecylsulfate) es el de mayor uso
2. Se emplea un AGENTE REDUCTOR de puentes –s–s– generalmente β-
mercaptoetanol o DTT (ditiotreitol)
¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?

37. La cantidad de SDS unido a la proteína es proporcional a su tamaño, de tal
forma que la relación carga/tamaño entre todas las proteínas va a ser
aprox. la misma
TIPOS DE ELECTROFORESIS
¿QUE CONSEGUIMOS CON ESTO?
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
El β-mercaptoetanol va a “romper” los enlaces –S–S– tanto inter-como
intramoleculares mediante una reacción redox. (El β-mercaptoetanol reduce
los puentes disulfuro)
DTT

38. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
80KDa 40KDa

39. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
60KDa
40KDa
20KDa
80KDa 40KDa

40. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
NO
DESNATURALIZANTE
DESNATURALIZANTE
SDS-PAGE

41. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
VENTAJAS
•Separación rápida de las proteínas
•La separación no depende de la forma de la proteína nativa
•Se puede estimar el peso molecular de las proteínas
•Aunque desnaturalizadas, las proteínas pueden usarse para la fabricación de
anticuerpos (en la mayoría de los casos)
INCONVENIENTES
•Las proteínas separadas están desnaturalizadas por tanto no son funcionales
CONDICIONES DESNATURALIZANTES: SDS-PAGE
PARA LA DETERMINACIÓN DEL PESO MOLECULAR:
1. Necesitamos un marker
2. Necesitamos normalizar

42. ELECTROFORESIS GEL POLIACRILAMIDA
Azul de
coomassie
DETECCION DE PROTEINAS
- Azul de Coomassie
- Todas las proteinas

43. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

44. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. ISOLELECTROENFOQUE
Las proteínas se separan por:
PUNTO ISOELÉCTRICO
Las proteínas se moverán de acorde
con su carga neta hacia el ánodo o el
cátodo hasta que alcancen un valor
de pH = pI donde su carga neta es
neutra (y ya no se mueven)

45. TIPOS DE ELECTROFORESIS
1. ELECTROFORESIS DE ACIDOS NUCLEICOS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS
2.A. NO DESNATURALIZANTE
2.B. DESNATURALIZANTE
B.1. ISOELECTROENFOQUE
B.2. BIDIMENSIONAL

46. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
• Técnica de alta resolución cuyo objetivo es la separación de mezclas de proteínas
altamente complejas
•La base de su elevado poder de resolución está precisamente en la
bidimensionalidad, es decir, en que las proteínas son separadas secuencialmente
por dos criterios físicos
•Debido a su elevada resolución, ha sido una técnica ampliamente utilizada en la
confección de mapas de referencia, es decir, en la disección de la composición
proteica de un determinado orgánulo o tipo celular (metabolómica)

47. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
En realidad son dos
proteinas con identico
peso molecular o punto
isoeléctrico!
SOLUCION:
Electroforesis Bidimensional

48. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL
Peso molecular
Punto
isoeléctrico

49. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. BIDIMENSIONAL

50. WESTERN BLOT

51. WESTERN BLOT
Gel de proteínas Membrana tras WB

52. WESTERN BLOT
● ELECTROTRANSFERENCIA
● Mejor y más tiempo
● TECNICAS DE INMUNODETECCIÓN

53. WESTERN BLOT
La MEMBRANA de NITROCELULOSA
se puede teñir a su vez con un
colorante (ROJO PONCEAU) que
pone de manifiesto el total de
proteínas que se han transferido
desde el gel

54. WESTERN BLOT
DETECCIÓN
•Autorradiografía
•Precipitación de un
cromógeno insoluble por la
acción de una actividad
enzimática
•Fluorescencia
•Quimioluminiscencia

55. WESTERN BLOT
DETECCIÓN

56. WESTERN BLOT
DETECCIÓN

57. NORTHERN/SOUTHERN BLOT

58. MUCHAS GRACIAS

59. TIPOS DE ELECTROFORESIS
2. ELECTROFORESIS DE PROTEINAS. GELES POLIACRILAMIDA
GEL UNIFORME
Concentración de poliacrilamida
uniforme
Función: separar las proteínas:
Tamaño y densidad de carga
Ventajas:
• Rápido
• Sencillo
• Puede estudiarse la funcionalidad
de las proteínas separadas
Desventajas:
•Menor resolución