2009 poster sociedad española de diabetes tenerife

P-007 P1: Genética de diabetes y experimentales RESULTADOS Apoptosis yproliferación de la célulaβinducidaporlasdiferentescondiciones de cultivo Fig. 2: La apoptosis de las células beta cultivadas en placas sin tratar (control), con agarosa, BSA y polihema durante 2, 3 y 4 días de cultivo se determinó mediante la técnica de TUNEL combinada con marcaje anti-insulina y los datos se representaron en la gráfica de la izquierda como porcentaje de células insulina+ TUNEL+ respecto al total de células. A la derecha se muestra una fotografía representativa del comarcaje obtenido con los núcleos apoptóticos señalados con flechas. Se observa a 3 días de cultivo, una inducción de la apoptosis de las células beta en las placas tratadas con agarosa y polihema con respecto al control. En el caso del polihema este aumento es muy pronunciado por lo que se descarta esta condición para el siguiente estudio.★vs control p≤0,05,★★vs control p≤0,01; n=3. Fig. 3: La proliferación de las células beta cultivadas en placas sin tratar (control), con agarosa, BSA y polihema durante 2, 3 y 4 días se determinó añadiendo a los cultivos el análogo de timidina BrdU y marcando las células de los islotes con anticuerpos dirigido contra insulina y BrdU. Los resultados obtenidos se representaron en la gráfica de la izquierda como porcentaje de células insulina+ BrdU+ respecto al total de células. A la derecha se muestra una fotografía representativa del comarcaje obtenido con los núcleos BrdU+ señalados con flechas. No se observan efectos significativos de los tratamientos en la proliferación de las células beta aunque parece existir una tendencia al aumento de proliferación inducida por el tratamiento con BSA a 3 días de cultivo. Se llevaron a cabo una n=5 experimentos. Caracterización del estromapancreático Fig. 4: La expresión de marcadores de células estromales: CD29, CD44, CD49b y CD54. Se determinó mediante citometría de flujo. Se representan imágenes características de los histogramas que representan la intensidad de expresión de las diferentes moléculas de superficie. Las células obtenidas de los restos de digestión de los páncreas y cultivadas presentan marcadores de superficie típicos de células estromales que se conservan con el número de pases excepto en el caso de CD44 donde en el pase 2 se diferencian dos poblaciones de diferente intensidad. OPTIMIZACIÓN DE UN SISTEMA MURINO DE COCULTIVOS DE ISLOTES PANCREÁTICOS CON CÉLULAS ESTROMALES PARA EL ESTUDIO DE LA SUPERVIVENCIA Y FUNCIONALIDAD DE LA CÉLULA β Cebada-Aleu A., Blandino-Rosano M., Perez-Arana G., Segundo C. & Aguilar-Diosdado M. Unidad de InvestigaciónyServicio de EndocrinologíayNutrición, Hospital UniversitarioPuerta del Mar, Cádiz, España La diabetes mellitus tipo 1 (DM1), tanto en humanos como en animales, es un proceso autoinmune que se manifiesta por infiltración linfocítica pancreática y por la presencia de anticuerpos anti-islotes circulantes y que cursa con deterioro funcional progresivo de la célula beta hasta su destrucción final. Su único abordaje terapéutico ha sido hasta muy recientemente la administración de insulina hasta normalizar los valores de glucosa en sangre. Sin embargo, a lo largo de las últimas décadas han surgido estrategias terapéuticas entre las que se incluyen aquellas que tienen como objetivo la sustitución del tejido destruido mediante trasplantes, tanto de páncreas completo como de islotes aislados, y las encaminadas a recuperar masa de células beta a partir de una población inicial de precursores (neogénesis) o de las propias células beta (proliferación). En este sentido existen trabajos que muestran en modelos animales de diabetes autoinmune espontánea o inducida con Estreptozotozina, que tras la infusión de preparaciones celulares obtenidas de médula ósea, se produce una migración de algunas de estas células hacia el tejido pancreático, provocando una mejora de la función de los islotes, probablemente por inducción del aumento de la masa beta. Entre las células que forman parte de los extractos medulares parece que son las denominadas “células madre mesenquimales” o “células estromales multipotentes” (MSCs), las responsables del efecto. Estas células poseen muchas características comunes con las células del estroma del páncreas y esa parece ser una de las razones por la cual terminan alojándose en este territorio donde ejercen su función. Existen también trabajos que confirman una correlación significativa entre las células ductales/epiteliales trasplantadas junto a los islotes y la duración de los implantes en buen estado funcional. ★★ ★ En este trabajo se establece, a partir de tejido pancreático de rata Wistar, un sistema experimental que permita el estudio “in vitro” de las interacciones que pueden establecerse entre células del estroma pancreático y los islotes dentro de un microambiente de daño pancreático y que tienen como resultado la mejora global de la funcionalidad de la masa de células beta. Obtención de islotespancreático Animales Los islotes se aislaron realizando una distensión ductal del páncreas mediante su llenado con una solución de colagenasa P 1mg/ml en HBSS. Posteriormente, el páncreas fue digerido y los islotes separados del mismo mediante centrifugación sobre gradiente de Ficoll. Los islotespancreáticos se obtuvieron a partir de ratasWistar macho de aproximadamente 250 gr de peso. Pase 1 Pase 2 Pase 0 CD29 Caracterización del estromapancreático Las células estromales pertenecientes a distintos pases se tripsinizaron y se recogieron en suspensión. Se marcaron con anticuerpos anti-CD29 (cadena β1 de integrina) y anti-CD49b (cadena α2 de integrina) conjugados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) y anti-CD44 (H-CAM, pgp-1) y anti-CD54 (ICAM-1) conjugados con Ficoeritrina (PE). Posteriormente las células marcadas con estos anticuerpos se analizaron mediante citometría de flujo utilizando para ello un FACSCalibur. CD44 CD49b Obtención de estromapancreático Los restos tisulares que quedan tras el proceso de digestión de los páncreas para la obtención de islotes se lavaron con HBSS y se cultivaron en placas de cultivo con RPMI-1640 suplementado con 10-20% (v/v) de suero fetal, L-glutamina (2mM) y antibiótico (Penicilina, 100 U/ml y Estrectomicina, 100 U/ml) renovándolo cada 24o48h. Cuando las células llegaron a la confluencia, se tripsinizaron para realizar los distintos pases. CD54 INTRODUCCIÓN OBJETIVOS BIBLIOGRAFÍA MATERIALES Y MÉTODOS Determinación de proliferación Determinación de apoptosis A los cultivos se les añadió el análogo de la Timidina 5-bromo-2'-deoxiuridina (BrdU) desde su inicio. Tras su recogida, los islotes se disgregaron con tripsina, las células dispersas se situaron sobre portas mediante citocentrifugación y se marcaron con anticuerpos anti-BrdU, anti-insulina y DAPI. Los islotes se trataron como en el apartado anterior y la apoptosis se determinó mediante técnica TUNEL combinada con marcaje anti-insulina. El DAPI se utilizó como contratinción. Establecimiento de controlesnegativos de adhesión de islotes Análisisestadístico Se trataron las placas de cultivo con diferentes compuestos que evitan la adhesión celular: albúmina de suero bovino (BSA) al 5%, polihema a 10 mg/ml y agarosa al 1%. Para comparar se utilizaron como control placas de cultivo sin tratamiento. Los islotes se cultivaron en las diferentes condiciones a una densidad de 100 islotes/placa en medio RPMI-1640 suplementado con 10% (v/v) de suero bovino fetal, L-glutamina (2mM) y antibiótico (Penicilina, 100 U/ml y Estrectomicina, 100 U/ml). Los grupos experimentales se compararon mediante una ANOVA considerando diferencias significativas los valores con p≤0,05. CONCLUSIONES ,[object Object]

2009 poster sociedad española de diabetes tenerife

Recomendados

Recomendados

Más contenido relacionado

La actualidad más candente

La actualidad más candente (18)

Similar a 2009 poster sociedad española de diabetes tenerife

Similar a 2009 poster sociedad española de diabetes tenerife (20)

Último

Último (20)

2009 poster sociedad española de diabetes tenerife