El documento aborda la producción y características de anticuerpos monoclonales (AcM), destacando la tecnología de hibridomas para su obtención mediante la fusión de linfocitos B con células de mieloma. Se describen diferentes métodos de producción y purificación de AcM, así como su utilidad en inmunoensayos y la necesidad de humanización para evitar la respuesta inmune en humanos. Además, se menciona la humanización de anticuerpos a través de técnicas de ingeniería genética para reducir la inmunogenicidad.

1. Anticuerpos Monoclonales
Daniel Goicochea
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Facultad de Ciencias Biológicas
Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología

2. • Anticuerpos policlonales resultantes de un
animal inmunizado pueden reconocer una
variedad de epítopes sobre el antígeno

3. Anticuerpos monoclonales (Köhler y
Milstein, 1975, 1976).
• Tecnología de hibridomas: fusionar un linfocito B
(información codificante para el anticuerpo) con
una célula de mieloma (célula plasmática
cancerosa: capacidad de multiplicación y
crecimiento ilimitado), para obtener un híbrido:
síntesis y secreción de un anticuerpo y
crecimiento perpetuo

5. Características de las células de
mieloma
• Haber perdido la capacidad de secretar
inmunoglobulina propia (Ig-neg)
• Carecer de alguna de dos enzimas requeridas
para el crecimiento en un medio de cultivo
selectivo denominado HAT
– Hipoxantina-guanosina fosforibosil-transferasa
(HGPRT) -> HGPRT-neg
– Timidina kinasa (TK) -> TK-neg

6. Medio Selectivo HAT
• Contiene hipoxantina, aminopterina y timidina
• Aminopterina actúa como inhibidor de la vía
principal de síntesis de ácidos nucleicos
• La ruta alterna utiliza la hipoxantina y la
timidina como precursores, y que requiere de
las enzimas HGPRT y TK

9. Producción de hibridomas murinos
• ↑ inmunogenicidad - ↑ expansión clonal
y ↑ probabilidad de hallar hibridomas con la
especificidad deseada
• no importa si la inmunización despertó una
respuesta contra posibles contaminantes de la
preparación de antígeno

10. Producción de hibridomas murinos
• Inmunización de ratón singénico (cepa
BALB/c) con antígeno de interés
• Se sacrifica al animal para obtener Linfocitos
esplénicos
• Mezcla de Linfocitos con células de mieloma
por Polietilénglicol (PEG) que promueve la
fusión de membranas celulares.

11. Hibridomas
Cepa BALB/c
semanas

12. • Se obtiene una cantidad de hibridomas al azar
• Se siembran las células distribuidas en placas
de 96 hoyos, en medio HAT
• Sobreviven los hibridomas y proliferan (12-
16h)
• Se prueba los sobrenadantes de los cultivos
mediante ELISA u otra técnica inmunológica
Producción de hibridomas murinos

13. • Se identifican cultivos con Ab de interés
• Se separan células en nuevo cultivo
(clonación)
• Obtención de cultivo monoclonal de
hibridoma, cuyas células se pueden conservar
congeladas en nitrógeno líquido a -196°C
Producción de hibridomas murinos

14. Separación de células
en nuevo cultivo
nitrógeno líquido a -196°C

15. Producción de AcM
• In vitro: cultivos masivos (concentraciones
desde µg/ml hasta mg/ml de medio de
cultivo)
• Material más fácilmente purificable, pero más
costoso por requerimiento de equipos,
medios y suplementos.

16. Producción de AcM
• In vivo: células del hibridoma inyectadas en
cavidad peritoneal de ratones singénicos con
respecto a la cepa que origino los LB y al mieloma
• Se produce un tumor ascítico del cuál se obtiene
grandes volúmenes con alta concentración de
AcM (mg/ml)
• Contiene proteínas contaminantes. Se requiere
de purificación.
• Se sacrifican animales.

18. Producción de AcM
• Determinación de isotipos empleando
antisueros que reconocen distintas subclases
de cadenas pesadas
• Técnicas: IDD, ELISA
• Evaluación de reacciones cruzadas,
especificidad molecular a nivel de epítopo,
probando la capacidad de unión a péptido.

19. Características AcM
• Moléculas únicas e idénticas entre sí.
• Especificidad y afinidad constante (reproducible)
• La capacidad de reconocer solo a un epítopo
disminuye la posibilidad de reacciones cruzadas con
otros Ag.
• Desventaja en precipitación: al solo reconocer un
epítopo de un Ag, no forma complejos
multimoleculares adecuados.
• Ventaja en aglutinación: reconoce un solo epítopo,
pero que está disponible repetidamente en la
superficie

20. Usos de Ab monoclonales
• Su especificidad los hace útiles
para usar como Ab primarios
en inmunoensayos.
• La especificidad también los
hace eficiente para unión a
antígeno en mezcla de
moléculas (como en
purificación por afinidad)

21. AcM Humanizados
• AcM murinos no son útiles en humanos, ya
que el sistema inmune los detecta como
extraños (HAMA: human anti-murine Ab)
• Obtención de AcM humanos: transformación
de linfocitos B mediante infección in vitro
virus Epstein-Barr, manipulación directa de
ADN, producción de Ab quiméricos y
humanizados.

22. • Epstein–Barr virus (EBV) es un virus de herpes que, in
vitro, inmortaliza eficientemente casi todoas los LB.
• Las líneas celulares linfoblastoides (LCL’s) preservan las
características iniciales de las células: producen y
secretan Ig y expresan dichas moléculas, que pueden
ser aisladas en líneas celulares que secreten Ab
específicos
• Este método permite la producción de IgM, IgG, IgA, y
IgE anticuerpos monoclonales
• Human monoclonal antibodies are promising reagents
for passive immunization.

23. Humanización de Ab
• A schematic representation of the advancement
from fully mouse antibodies, represented by red
domains, to fully human antibodies, represented
by blue domains.

24. Humanización de Ab
• Aplicación de ingeniería genética para reducir la
inmunogenicidad de Ab de ratón.
• Se produjo Ab quiméricos conteniendo dominios
constantes de Ab humanos y los dominios
variables de ratón para mantener la especificidad.
Dominio variable de ratón
Dominio constante humano
Mouse Fab
spliced to
human Fc

25. Humanización de Ab
• Posteriormente se produjo Ab humanizados
conteniendo solo los CDR de ratón (región
determinante de complementaridad), que es la
responsable de la unión a Ag
CDR de ratón
Dominio constante humano

26. Humanización a partir de quimeras de
ratón