Este documento describe un estudio que demuestra que el factor de transcripción WT1 codifica el gen amphiregulin. Los autores encontraron que WT1 activa directamente el promotor de amphiregulin y que la expresión de ambos genes se superpone espacial y temporalmente durante el desarrollo renal fetal. Además, la amphiregulina recombinante estimula la ramificación del epitelio renal en cultivos de órganos, lo que sugiere un papel de WT1 en la diferenciación renal a través de la regulación de amphiregulin.

1. TEMA DEL ARTÍCULO:
Sean Bong Lee,1 Karen Huang,1 Rachel Palmer,1 Vivi B. Truong,2 Doris Herzlinger,3 Kathryn A. Kolquist,4 Jenise
Wong,1 Charles Paulding,1 Seung Kew Yoon,1,7 William Gerald,4 Jonathan D. Oliner,2,6 and Daniel A. Haber1,5
NOMBRES:
Lucía Alexandra Chalán Cabrera
Andrea Carolina Cango Cango
RESUMEN DEL ARTÍCULO:
WT1 codifica un factor de transcripción de dedos de zinc implicado en la diferenciación de los riñones y la
tumorigénesis.En ensayos de reportero, reprime la transcripción de WT1 GC-ricos y los promotores ricos en
TC, pero sus objetivos fisiológicos permanecen inciertos.Se utilizó la hibridación para oligonucleótidos de
densidad alta para ataviarse con la búsqueda de genes nativos cuya expresión se ve alterada después de la
expresión inducible de WT1.El blanco principal del WT1fue la amphiregulin,un miembro del factor de
crecimiento epidérmico familiar.El WT1 (KTS) isoforma se une directamente al promotor amphiregulin,
resultando en una fuerte activación transcripcional.El perfil de expresión en vivo de la amphiregulin durante
el desarrolllo fetal del riñón reflejópatrones altamente específicos de WT1 mismo, y recombinantes de
Amphiregulin estimula la ramificación del epitelio en órgano-cultivos de riñón de ratón embrionario.Estas
observaciones sugieren un modelo para WT1 como regulador transcripcionaldurante la diferenciación del
riñón
OBJETIVOS O HIPÓTESIS PLANTEADAS:
Demostrar que el supresor del Tumor de Wilms WT1codifica al amphiregulin, el cuál es un activador
transcripcional.
METODOLOGÍAS UTILIZADAS:
Análisis de las puntas de prueba Microarrayed
Se utilizaron microarreglos de oligonucleótidos de densidad alta parabuscar genes endógenos cuya expresión
es alterada después de la expresión inducible de WT1 en U2OShumano de células del osteorsacoma. En estas
células con fuerza regulada, Tetraciclina-reprimible, lainducción de WT1variantes del empalme, la expresión
de WT1 (KTS) a niveles de comparables para estos observados en el desarrollo de glomérulos que causan la
apoptosis a las 48 horas, un efecto que no se observacon la WT1 (KTS) variante del empalme. Para identificar
directamente los objetivos transcripcionales, las células a mediados de la fase de crecimiento en ausencia
detetraciclina por 11 horas, tiempo de en el que la poli (A) RNA fue aislado y utilizado para inquirir micro-
arreglos de oligonucleótidos que representan6800 genes conocidos y etiquetas de secuencias expresadas
(EST). Perfiles de expresión en las células conWT1 inducible (KTS) fueron comparados para estos expresando
los niveles comparables de WTK1 y las células trans-infectados con el vector vacío. Los análisis Northern se
utilizaronpara validar todos los cambios en la expresión mayor que 5 vecesidentificados por los experimentos
de hibridación matriz.
La inducción de amphiregulin por WT1 (KTS)
Dada la magnitud de la inducción del mRNAamphiregulinpor WT1 (KTS), se trató de determinar si podría
constituir un objetivo directo de la transcripción.Como se predijopor experimentos de hibridación de chips, de
Northern se confirmó que la inducción de amphiregulin era específicoa la WT1 (KTS) variante de empalme,

2. para codificar el pensamientotranscripcionala la forma activa de WT1 (fig. 1A).Elcurso del tiempo de
inducción del mRNAamphiregulin siguientes a la expresión de WT1 (KTS) en las células U2OS fue
coincidente con sí misma la de WT1, fácilmente detectables dentro de 3horas después de la retirada de la
tetraciclina (Figura 1B).La re-adicción dela tetraciclina y la supresión de la expresión de WT1 resultaron
acompañados de una disminución en la expresión de amphiregulin(datos no mostrados).Para determinar si el
amphiregulin es inducida por WT1 en tipos de células adecuadasespecíficamente las células de origen
embrionario del riñón, que estatetraciclina regula la expresión inducible-cido deWT1 isoformas en las células
RSTEM, las células del riñón inmortalizadoaislado de embriones de rata de 12,5 días. En estas células, en-
ARNm endógeno WT1 es detectable en el momento basal, y5 - a veces de inducción 10 de WT1 isoformas se
observatras la retirada de la tetraciclina.La inducción de endógenos de rataARNmamphiregulinfué observada
en 6 horas de seguimiento con la expresión de WT1 (KTS), pero WT1 no(KTS) (Fig.-Ure1C).La presencia o
ausencia de otra alternativa de empalme, codificada por el exón 5 del WT1,no alteró significativamente la
inducción de la amphiregulin porWT1 (KTS) (datos no mostrados).
La activación directa del Promotor de la amphiregulin por WT1 (KTS
Para identificar un potencial de cis-actuación, que responde sitio WT1en el promotor amphiregulinhumano,
identificamosun cromosoma artificial bacteriano (BAC) que contiene los conocidos upstream, que fueron
insertados dentro de los activadores de el promotor del reportero de luciferasa plásmido pGL2. La activación
de los re-Portero por WT1 iso-formas fue probada usando co-transitoriatransfección en células NIH3T3, que
expresan niveles no detectados de endógenos de WT1. A. Un fragmento genómicoque contenía el promotor
amphiregulin conocidos se activó 20 - a 25 veces porWT1 (KTS), pero no la WT1 (KTS) (Figuras 2A y
2B).No hay más activación se observó mediante la inclusión de un kb adicional, 1 de secuencia ascendente
derivados de las BAC (datos no mostrados). Supresión progresiva construccionesmapa de la WT1 que
responde a los principales elementos (WRE) para 60 nt, entre las posiciones 328 and 328 y 275 (Figure 2B).
275 (Figura 2B). También se observó que el sitio CRE muestra un cierto nivel de WT1 (KTS).
Caracterización de los nativos WT1 (KTS)Encuadernación de secuencia
Consenso de secuencias de ADN para el reconocimiento WT1 (KTS), que contienen ambos ricos GC o TC
repetidos, se han derivados del análisis que responde a los promotores WT1.Sin embargo, desdela regulación
de estos promotores reporterosen ensayos transitorios de transfección no ha sido bien correlacionada conla
inducción de los promotores propias a través de WT1 (KTS)hemos tratado de definir la WRE dentro de un
gen que parecerse un objetivo fisiológico de WT1.El protegido 16 ntsecuencia del promotor amphiregulin fue
por tanto analizados por mutagénesis y la EMSA.Para obtener una óptima alineación con otras secuencias de
WT1 potencial de unión, laWRE se muestra en la orientación anti-sentido (Figura 3A).Los cinco 5-terminal de
nucleótidos y la terminal 3adenosina no se requería para WT1 (KTS) vinculante.El restante 10 nt de la
secuencia de amphiregulinpromotor (definido aquí como WRE) es más parecida a la"WTE" motivo 5-
GCGTGGGAGT-3, una alta afinidad WT1sitio de unión en la selección identificados por análisis in vitro
quemuestra mayor afinidad por WT1 (KTS) que la GC EGR1 consenso o ricos-el TC no repetir los
sitiosderivados de la respuesta a los reporterosdel promotor-WT1.La hebra antisentido del WRE5-
CCGTGGGTGG-3, difiere en sólo tres posiciones de la prevista motivo WTE óptima. Para determinar la
contribución relativa de cada uno de los 10 nucleótidos dentro de la WRE, las mutaciones se introdujeron en
cada posición y analizados por la EMSA, utilizando tanto la medición cuantitativa de proteína compleja de
formación y la competencia experimentos oligonucleótido.
Coexpresión de WT1 y amphiregulin en el desarrollo deEstructuras del riñón fetal
El papel fundamental de WT1 durante el desarrollo del riñón se refleja en su patrón altamente restringido de
expresión.Para determinar siinducción de amphiregulin por WT1 en células cultivadas re-refleja una
interacción significativa entre el potencial fisiológico,por lo tanto, en comparación de su expresión en el
desarrollo de estructuras del riñón fetal.En18-semanas los riñones humanos muestra las etapas secuenciales en
el glomérulo diferenciación en una progresión ordenada de las regiones ultra-periféricasindiferenciadas
células blásticas en la región subcortical, que se condensan para formar el epitelio de las llamadas"En forma

3. de S" órganos, evolucionando hacia la diferenciación glomerular, y en más centrado en glomérulos
maduros.Tinciones con anticuerpos persistentes muestra bajos nivelesWT1 de proteína en los podocitos
maduros de los glomérulos,WT1 pero los niveles de ARN son aparentemente por debajo del nivel dela
detección por hibridación in situ.Notablemente, el análisisde expresión amphiregulin era prácticamente super-
imposible en la de WT1.Ambas técnicas de inmunohistoquímica (Figura4B) y el ARN de hibridación in situ
(Figura 4D) demostrado altos niveles de expresión condensada en células blastelasde la LMA, en forma de
cuerpos S, y de los podocitos de diferenciación de glomérulos esté en funcionamiento.Los bajos niveles de
ARNm se amphiregulinTambién señaló en la maduración de los glomérulos por el ARN en la hibridación in
situ. Así, la precisión temporal y espacial especificada de WT1 y la expresión de amphiregulin en los riñones
son compatibles con un desarrollo regulado diferenciación vía.
La inducción de la yema ureteral ramificación en los riñones. Cultivos de órganos por Amphiregulin
La progresión de las estructuras de desarrollo que llevade la organogénesis renal es compleja, lo que refleja a
principios de las señales de la definición y reproductiva de las células epiteliales mesenquimales, así como los
estímulos posteriores que conducen a celularesdiferenciación y la proliferación (Davies, 1996).El ex-patrón de
presión de ambos WT1 y amphiregulin sugiereposibles contribuciones a ambos en las etapas del desarrollo.Sin
embargo, el fracaso del desarrollo en los riñonesWT1 ratones nulos refleja la primera etapa de diferenciación
renal, donde los niveles bajos de expresión en WT1. Las célulasblásticas parecen ser esenciales para la
inducción recíproca de señales entre yema ureteral e indiferenciado y para la supervivencia del mismo
blastema mesenquimatoso.Para examinar el potencial contribución de Amphiregulin, hemos utilizadoun corto
plazo de órganos in vitro en cultivos de ensayo que se hautilizado para modelar las primeras etapas de
diferenciación renal.Indiferenciado meta-riñón rudimentos néfricos fueron aislados desde el primer día
11,5embriones de ratón, una etapa de desarrollo que permitea disección del mesénquima que rodea una sola
Ureramateric brote.Estas se sembraron en nitrocelulosafiltros y se les permite diferenciar in vitro en
presenciao ausencia de Amphiregulinrecombinante.Como era de esperarrudimentos del riñón desarrollado una
red de ramificaciones tubules asociados con la condensación de células del mesénquima.La adición de
Amphiregulin purificado al órgano ademostrado un aumento de la dosis-dependiente en ureterayema de
ramificación de casi 2 veces en comparación con los controles (Figura 5). La magnitud y la dosis de la
integridad de este efecto en este, altamente reproduciblesen el ensayo de cal es muy significativa y
comparable a la adición exógena al observar las células glialesfactor (GDNF), de crecimiento
derivadoneurotróficoconocido por ser un mediador primario de la invasión yema ureteraly la ramificación.
CONCLUSIONES:
Un fragmento genómico que contenía el promotor amphiregulin conocidos se activó 20 - a 25 veces
porWT1 (KTS), pero no la WT1 (KTS)
La progresión de las estructuras de desarrollo que lleva de la organogénesis renal es compleja, lo que
refleja a principios de las señales de la definición y reproductiva de las células epiteliales mesenquimales,
así como los estímulos posteriores que conducen a celulares diferenciación y la proliferación (Davies,
1996).El ex-patrón de presión de ambos WT1 y amphiregulin sugiere posibles contribuciones a ambos en
las etapas del desarrollo.
El papel fundamental de WT1 durante el desarrollo del riñón se refleja en su patrón altamente restringido
de expresión.
También se observó que el sitio CRE muestra un cierto nivel de WT1 (KTS).