Este documento describe un estudio sobre los cambios peptídicos, glicopeptídicos y antigénicos durante la epimastigogénesis de Trypanosoma cruzi Dm28c en medio ML15-HA. Los resultados muestran que los cambios más significativos ocurren en las primeras 24 horas, con una rápida transformación de tripomastigotas a amastigotas y luego a epimastigotas. Los perfiles proteicos y antigénicos cambian durante la diferenciación, indicando modificaciones en las proteínas y ant

1. LXII CONVENCIÓN ANUAL DE ASOVAC
Ciencia y tecnología en el futuro de Venezuela
UNIMET 18 al 23 de Noviembre
CAMBIOS PEPTÍDICOS, GLICOPEPTÍDICOS Y ANTIGÉNICOS
DURANTE LA EPIMASTIGOGÉNESIS DE Trypanosoma cruzi Dm28c
EN MEDIO ML15-HA
D. Graterol, R. Arteaga, D. Ramírez, A. Ramos, M.C. Navarro, M.I. Domínguez, A.R. De Lima, V.T. Contreras
Universidad de Carabobo. Facultad de Ciencias de la Salud. Instituto de Biología Molecular de Parásitos (Instituto BioMolP). Laboratorio de Protozoología. E-mail: convictu@cantv.net
INTRODUCCIÓN
La posibilidad de simular in vitro la Epimastigogénesis en condiciones controladas, permite obtener material biológico (reservorio de la enfermedad de Chagas) dichos eventos ocurren de manera similar a lo observado en el clon EPm6, sin
para el estudio a nivel morfológico y molecular de T. cruzi. El medio ML15-HA permite simular los eventos embargo, los eventos de transformación son significativamente más rápidos (Gigante y col., 2009; Contreras y col.,
morfogenéticos del ciclo vital de T. cruzi. En este medio, los cambios que ocurren durante la epimastigogénesis del clon 2010). De ahí el interés de estudiar los eventos a nivel metabólico y molecular que ocurren en el clon Dm28c para
Dm28c de T. cruzi suceden más rápidamente que para otros aislados incubados en otros medios (Contreras y col., 2010). examinar si los cambios proteicos, glicoproteicos y antigénicos también suceden a mayor velocidad que en EPm6.
Aun cuando los eventos morfológicos y moleculares han sido estudiados en el clon EPm6 de T. cruzi procedente de OBJETIVO: Nuestro objetivo fue estudiar los cambios peptídicos, glicopeptídicos y antigénicos que ocurren durante la
humano (De Lima y col., 2007; Barrios y col., 2008) se demostró que en el clon Dm28c procedente de un rabipelado epimastigogénesis de Dm28c en medio ML15-HA.
MATERIALES Y MÉTODOS
MEM + 10% SFB
ML15-HA 37 C Proteínas totales de los parásitos
(día 0, 1/3, 1, 2, 3, 4, 6, 8, 10 y
Se trabajó con el clon Dm28c de Trypanosoma cruzi, mantenido en el laboratorio por pases alternos trimestrales chipo Tripomastigotas
Epi Control)
ratón (Contreras, 1994). Partiendo de tripomastigotas sobrenadantes de cultivo de células Vero mantenidas en medio s/n células Vero
ML15-HA a 37ºC, la epimastigogénesis se indujo incubando los tripomastigotas en medio ML15-HA a 27ºC (Barrios y
3400 rpm
col., 2008) (Protocolo 1). Los cambios morfológicos se evaluaron por recuento diferencial en cámara de Neubauer y 15 min 4ºC 1 x10 7 p/ml
SDS-PAGE
SDS-PAGE
SDS-PAGE
10%
10%
tinción con Giemsa. ML15-HA 27 C
10%
(COOMASSIE-PLATA y ELECTROTRANSFERENCIA
APABGP modificado) (MNC)
En cada punto de la cinética se hicieron masas húmedas de parásitos, a partir de los cuales se obtuvo las proteínas y
glicoproteínas totales mediante lisis hipotónica. Para caracterizar los perfiles proteicos y glicoproteicos, las proteínas
0d 1/3d 1d 2d 3d 4d 6d 8d 10d MNC
fueron separadas en geles SDS-PAGE (Laemmli, 1970) al 10% y reveladas con tinciones específicas: Coomassie-Plata
para visualizar proteínas y Acido Periódico-Alcian Blue-Glutaraldehído-Plata (APABGP) para glicoproteínas. El análisis LUMINOGRAFIA
PROTEÍNAS y
antigénico se hizo mediante electrotransferencia (Towbin y col., 1979) y los antígenos se revelaron usando suero anti- EPIMASTIGOTAS GLICOPROTEÍNAS
tripomastigotas (Anti-T) y anti-Epimastigota (Anti-E) preparados en conejos (Protocolo 2). ANTÍGENOS
ANTI-T y ANTI-E
Neubauer Giemsa
Protocolo 1. Epimastigogénesis inducida de T. cruzi Protocolo 2. Obtención de los perfiles proteicos, glicoproteicos y antigénicos
durante la Epimastigogénesis inducida de T. cruzi
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
La Tabla I muestra que los cambios más significativos ocurren en las primeras 24 horas con una caída abrupta del Las Figuras 2 y 3 muestra perfiles proteicos y glicoproteicos diferentes: uno para tripomastigotas (T, Figuras 2 y 3) y
porcentaje de tripomastigotas (de 94,8 a 3,9%), un incremento concomitante de los amastigotas (de 0 a 89,4%) y sin otro para epimastigotas (E, Figuras 2 y 3). Durante la diferenciación (canales 1/3 al 10) se aprecian cambios tanto en las
incremento poblacional neto (Nt/N0=1). Mientras que los epimastigotas se establecen como morfología predominante a proteínas (Figura 2) como en las glicoproteínas (Figura 3). El perfil epimastigota específico se observa a partir del día 4
partir del día 2 de la cinética hasta el día 10 con un incremento de 59 veces (Nt/N0) el inoculo a consta de la de incubación compatible con el incremento progresivo de la morfología epimastigota (Tabla I).
multiplicación de los epimastigotas.
En las proteínas las mayores modificaciones están representadas por la distribución, cambios de intensidad y la
Tabla I presencia de polipéptidos transitorios de alto peso molecular (por encima del marcador de 100 kDa) antes del día 3 y
Epimastigogénesis de T. cruzi (Dm28c) en medio
ML15-HA pH 7,0 a 27 C k cambios en los de mediano y bajo peso molecular a partir del día 4 (por debajo del marcador de 75 kDa).
n
Porcentaje de Formas
Tiempo Nt/N0
En las glicoproteínas durante la diferenciación de tripomastigotas a epimastigotas (canales 1/3 al 10) se logra evidenciar
0d 1/3d
(días) T D A E Muertos cambios de espesor y de intensidad de algunos glicopéptidos, lo que sugiere la existencia de regiones de re-arreglos
glicopeptídicos. Parecido a lo que se observa con las proteínas a partir del día 4 de incubación los parásitos muestran un
0 94,8 0 0 5,1 0 1,0
perfil glicopeptídico similar al de los epimastigotas controles compatible con el incremento progresivo de la morfología
1/3 14,8 0 74,3 10,8 0 -
1 3,9 2,6 89,4 3,9 0 1,0
epimastigota.
1d 2d
2 0 28,6 45,4 25,0 0 1,8
3 0,8 7,1 33,9 58,0 0 2,9 Mr Mr
T 1/3 1 2 3 4 6 8 10 E T 1/3 1 2 3 4 6 8 10 E
4 1,6 11,9 15,0 71,4 0 6,5 (kDa) (kDa)
k
6 0 6,8 8,4 84,7 0 15,1 225 * 225 225
n
150 150 150
8 0 6,8 3,9 85,8 3,3 45,1 10 µm
134
114 118
4d 8d 100 100 100
10 0 1,7 1,7 82,6 13,9 59,0 88 90/80
75 75/72 75 75/69 *
T= Tripomastigotas; A= Amastigotas; E= Epimastigotas; D= Formas en diferenciación; Figura 1. Micrografía de luz de los cambios morfológicos durante la 61/60 61
Nt/N0 = la relación entre el recuento de parásitos/ml a tiempo (t) sobre el recuento a Epimastigogénesis de T. cruzi (Dm28c) en medio ML15-HA pH 7,0 a 27 C. 50 51/49 50 56/52/49
tiempo 0. n = núcleo; k = kinetoplasto; d = días. 47/45/43 44
35 35
En la Figura 1 se aprecia la transformación de tripomastigotas en amastigotas al primer día de incubación y la 25 25
transformación de amastigotas en epimastigotas a partir del segundo día (2d) con predominio de los epimastigotas a los
4 y 8 días (4d y 8d).
Mr Mr Figura 4. Inmunoblot (SDS-PAGE 10%) de los antígenos de T. cruzi durante la Figura 5. Inmunoblot (SDS-PAGE 10%) de los antígenos de T. cruzi durante la
T 1/3 1 2 3 4 6 8 10 E M Az T 1/3 1 2 3 4 6 8 10 E M (kDa) epimastigogénesis en medio ML15-HA pH 7,0 a 27 C, colocando 4 µg de epimastigogénesis en medio ML15-HA pH 7,0 a 27 C, colocando 4 µg de
(kDa)
proteína/canal revelados con suero de conejo Anti-T (1/2000) y conjugado (1/3000). proteína/canal revelados con suero de conejo Anti-E (1/2000) y conjugado (1/3000).
Mucina 225 225 T= tripomastigotas sobrenadantes de células Vero. E= epimastigotas de 6 días T= tripomastigotas sobrenadantes de células Vero. E= epimastigotas de 6 días
220 225 170
170
150 150 150 mantenidos por pases semanales en medio ML15-HA pH 7,0. Los números 1/3, 1, 2, mantenidos por pases semanales en medio ML15-HA pH 7,0. Los números 1/3, 1, 2,
120
100 3, 4, 6, 8 y 10 días corresponde al tiempo de incubación en medio ML15-HA pH 7,0 a 3, 4, 6, 8 y 10 días corresponde al tiempo de incubación en medio ML15-HA pH 7,0 a
100 100 100
87
87 27 C. “Mr” corresponde a la movilidad relativa de los marcadores de peso molecular 27 C. “Mr” corresponde a la movilidad relativa de los marcadores de peso molecular
75 75 Fetuína 75
70 en kDa. en kDa.
66 63
64 57
52 *
50 50 50 50
48
-Glico-
44
45/44
42 40/39
39 proteína
35 35
34 35
33
27
31
27
La Figura 4 muestra que el anticuerpo anti-T revela 3 perfiles bien definidos: un primer perfil correspondiente a tiempo
25 25
25
25
1/3d y 1d similar al de Tripomastigotas (canal T), un perfil entre el día 3 y 10 similar al perfil de Epimastigotas (canal E)
y un perfil de transición correspondiente al día 2 con bandas antigénicas compartidas con los tripomastigotas y los
epimastigotas (canales T y E) y un antígeno de 80 kDa (punta de flecha blanca) ausente en los tripomastigotas y los
epimastigotas.
Figura 2. Electroforesis (SDS-PAGE) 10% de las proteínas (8 µg) de T. cruzi Figura 3. Electroforesis (SDS-PAGE) 10% de las glicoproteínas (10 µg) de T. cruzi
(Dm28c) durante la Epimastigogénesis en medio ML15-HA pH 7,0 a 27 C, (Dm28c) durante la Epimastigogénesis en medio ML15-HA pH 7,0 a 27 C, revelado
coloreadas con Coomassie-Plata. T= tripomastigotas sobrenadantes de células Vero. por APABGP. T= tripomastigotas sobrenadantes de células Vero. E= epimastigotas de
E= epimastigotas de 6 días mantenidos por pases semanales en medio ML15-HA pH 6 días mantenidos por pases semanales en medio ML15-HA pH 7,0. Los números 1/3, La Figura 5 muestra que el anticuerpo anti-E revela también 3 perfiles bien definidos: un primer perfil correspondiente
7,0. Los números 1/3, 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 días corresponde al tiempo de incubación en 1, 2, 3, 4, 6, 8 y 10 días corresponde al tiempo de incubación en medio ML15-HA pH
medio ML15-HA pH 7,0 a 27 C. El canal “M” corresponde a los marcadores 7,0 a 27 C. Az corresponde a una mezcla de azucares usado como control de a tiempo 1/3d y 1d con cambios significativos respecto al perfil de Tripomastigotas (canal T), un perfil entre el día 3 y
peptídicos de peso molecular y “Mr” a la movilidad relativa en kDa. coloración. El canal “M” corresponde a los marcadores peptídicos de peso molecular
y “Mr” a la movilidad relativa en kDa. 10 similar al perfil de Epimastigotas (canal E) y un perfil de transición correspondiente al día 2d con bandas antigénicas
compartidas con los tripomastigotas y los epimastigotas (canales T y E) y un antígeno de 60 kDa (punta de flecha
REFERENCIAS : blanca) ausente en los tripomastigotas y los epimastigotas.
Barrios J, Contreras O, Graterol D, Navarro MC, Contreras VT, De Lima AR. (2008). TRYPANOSOMA CRUZI: Epimastigogénesis en condiciones axénicas. Cambios morfológicos, peptídicos,
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Contreras V, Gigante G, González G, Linares E, Arteaga R, Graterol D, De Lima AR, Domínguez MI, Navarro MC. (2010). Epimastigogénesis, Metaciclogénesis y Amastigogénesis de Trypanosoma
cruzi clon Dm28c en medio ML15-HA. Acta Cient Venez 61(1): 50-51. LX Convención anual de AsoVAC. 2010; Nov 14-19; Ciudad Bolívar, Venezuela.
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Salus 11(2): 39-47.
De Lima AR, Navarro MC, Domínguez MI, Graterol D, Arteaga R, Fernández A, Pineda W y Contreras VT. (2009). Antígenos Amastigota específicos son expresados durante la Epimastigogénesis la epimastigogénesis ocurre a mayor velocidad que el medio semi-definido MEMTAU y que la presencia del estadio
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Gigante G, González G, Linares E. (2009). Epimastigogénesis, Metaciclogénesis, Amastigogénesis del clon Dm28c de T. cruzi en medio ML15-HA [Tesis de Grado para optar al título de Licenciado
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Financiamiento: FONACIT S1-2001000683; CDCH-UC FCS: Proyectos 2003-005; 2006-006; 00212-07; 2010-001; Investigaciones Menores 0394-2010; 011-2011; 180-2011; 0461-2010; Equipamiento Institucional 2005-012.